检测14-3-3eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 检测14-3-3eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其应用 (Chemiluminescence immunoassay kit for detecting 14-3-3eta protein and application thereof ) 是由 饶星 廖智星 刘宇卉 李临 其他发明人请求不公开姓名 于 2018-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒。该试剂盒采用能够与14-3-3 eta蛋白特异性结合的第一抗14-3-3 eta蛋白抗体和第二抗14-3-3 eta蛋白抗体制成；其以双抗体夹心的方式,利用光激化学发光免疫分析平台的灵敏度高、线性范围宽、精密度好等优势,为临床诊断类风湿提高确诊率,为预防类风湿和提早发现类风湿提供辅助检测。(The invention relates to a chemiluminescence immunoassay kit for detecting 14-3-3eta protein. The kit is prepared by adopting a first anti-14-3-3 eta protein antibody and a second anti-14-3-3 eta protein antibody which can be specifically combined with 14-3-3eta protein; the double-antibody sandwich type high-sensitivity kit adopts the advantages of high sensitivity, wide linear range, good precision and the like of a light-activated chemiluminescence immunoassay platform, improves the diagnosis rate for clinically diagnosing rheumatoid diseases, and provides auxiliary detection for preventing rheumatoid diseases and finding the rheumatoid diseases in advance.)
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法、使用方法。
背景技术
14-3-3eta(η)蛋白是一种新型的血清/血浆蛋白标志物，诱导炎症因子，如白细胞介素(IL)-1和-6，并联系到关节损伤。7种亚型中只有14-3-3η蛋白在RA活动性炎症滑膜和血清中高表达，并与RA前炎性因子表达和滑膜炎症呈正相关，且滑膜液14-3-3η蛋白水平至少高于血清水平5倍以上，提示滑膜是14-3-3η蛋白的主要来源。与健康的人相比，14-3-3η亚型在关节炎患者中高水平表达，这被认为与14-3-3η蛋白诱导相关的炎症因子和关节损伤的能力直接相关。
现有的检测14-3-3蛋白的方法均为非均相免疫检测法，这些方法灵敏较低，准确度不高，操作也较为复杂。并且，国内、外市场上尚没有发现商品化14-3-3eta蛋白检测试剂盒。曾报道有酶联免疫吸附法(ELISA法)检测患者血清中14-3-3eta蛋白，但是其灵敏较低，特异性也较差，操作也较为繁琐。
因此，目前亟需研究开发一种灵敏度高、特异性好、操作方法简便的14-3-3eta蛋白检测试剂盒。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒。该试剂盒采用能够与14-3-3 eta蛋白特异性结合的第一抗14-3-3 eta蛋白抗体和第二抗14-3-3 eta蛋白抗体制成；利用光激化学发光免疫分析平台的灵敏度高、线性范围宽、精密度好等优势，为临床诊断类风湿提高确诊率，为预防类风湿和提早发现类风湿提供辅助检测，成为类风湿新型标志物。
本发明第一方面提供了一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒，其包括：第一试剂、第二试剂、校准品、低水平质控品和高水平质控品，其中：
所述第一试剂包含包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒，所述第一抗14-3-3eta蛋白抗体能够与14-3-3 eta蛋白的第一表位特异性结合；
所述第二试剂包含能够与14-3-3 eta蛋白的第二表位特异性结合的含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体，所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，所述校准品、低水平质控品和高水平质控品均包含重组抗原14-3-3eta蛋白。
根据本发明，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成六个浓度水平的6瓶工作校准品溶液。
在本发明的一些实施例中，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成如下六个浓度水平的工作校准品溶液：0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL。
在本发明的一些优选的实施例中，所述校准品还包括新生牛血清和冻干保护剂。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品的质控范围为10％-40％，优选为10％-30％，更优选为10％-20％。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品的靶值浓度为0.20±0.05ng/mL。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品的质控范围为10％-40％，优选为10％-30％，更优选为10％-20％。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品的靶值浓度为5.0±1.0ng/mL。
根据本发明，所述试剂盒还包括第三试剂，其包含亲和素和/或链霉亲和素包被的感光微粒。
根据本发明，所述试剂盒还包括微孔板条。
本发明中，所述校准品、低水平质控品和/或高水平质控品均为冻干粉。
在本发明的一些优选的实施例中，所述低水平质控品和/或高水平质控品中包含新生牛血清。
在本发明的另一些优选的实施例中，第一试剂和/或第二试剂中包含蛋白稳定剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述蛋白稳定剂为牛血清白蛋白。
本发明中，所述第一试剂中的发光微粒为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，其能够与单线态氧反应而生成可检测的化学发光信号。
本发明中，所述第三试剂中的感光微粒为填充有感光化合物的高分子微粒，其能够在激发状态产生单线态氧。
在本发明的一些实施例中，所述第一试剂中包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒的浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选30-100μg/mL，最优选40-80μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述第二试剂中含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体的浓度为0.1-8μg/mL，优选0.2-6μg/mL，更优选0.4-4μg/mL，最优选0.6-2μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述第三试剂中所述亲和素和/或链霉亲和素包被的感光微粒的浓度为5-20μg/mL，优选8-15μg/mL，更优选10-12μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述14-3-3 eta蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。
在本发明的另一些实施例中，试剂盒在0.1ng/mL-20.0ng/mL范围内，试剂盒剂量-反应曲线线性相关系数(r)不低于0.990。
本发明第二方面提供了一种检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测方法，其包括使用如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施方式中，该方法包括：
步骤R1，将待测样品与第一试剂和第二试剂混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与第三试剂混合，得到第二混合物；
步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述感光微粒产生单线态氧，所述发光微粒能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作14-3-3eta蛋白标准工作曲线的步骤。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3 eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量。
本发明中，步骤R1和R2之间以及步骤R2和R3之间没有分离和/或洗涤的步骤。
在本发明的一些实施例中，在步骤R3中，使用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发感光微粒产生单线态氧，发光微粒与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光。
在本发明的一些优选的实施例中，该方法还包括校准步骤：利用0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL的六个浓度水平的工作校准品溶液进行复孔测定并校准。
在本发明的另一些优选的实施例中，该方法还包括质量控制步骤，采用三次样条插值拟合进行拟合，给出样品的浓度值。
在本发明的又一些实施例中，使用如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白的正常范围的上限为0.2ng/mL，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度≥0.2ng/mL判定为阳性，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度＜0.2ng/mL判定为阴性。
本发明第三方面提供了一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测系统，其利用本发明第一方面所述的试剂盒和/或利用本发明第二方面所述的方法来检测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述系统包括：
反应装置，其用于待测样品与第一试剂、第二试剂发生化学发光免疫反应；
激发和读数装置，其用于激发和记录化学发光免疫反应的化学发光信号；
处理器，其根据所述化学发光信号的存在和/或强度判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述处理器采用三次样条插值拟合进行拟合，直接给出样品的浓度值。
本发明第四方面提供了一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测方法，其采用本发明第三方面所述的检测系统和如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒通过如本发明第一方面所述的方法来检测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，该方法包括以下步骤：
1)在反应孔中分别加入待测样品或校准品、质控品；
2)在反应孔中依次加入第一试剂和第二试剂；
3)对步骤2)中得到的混合物进行温育；
4)在反应孔中加入第三试剂；
5)对步骤4)中得到的混合物进行温育；
6)激光照射反应孔并计算每孔发光光子量；
7)根据标准曲线，计算待测样品中待测目标分子的浓度。
在本发明的一些具体实施例中，该方法包括以下步骤：
1)在反应孔中分别加入25μL待测样品或校准品、质控品；
2)在反应孔中依次加入25μL第一试剂和25μL第二试剂；
3)37℃温育15分钟；
4)在反应孔中加入第三试剂175μL；
5)37℃温育10分钟；
6)激光照射微孔并计算每孔发光光子量；
7)根据标准曲线，计算样品浓度。
在本发明的一些优选的实施例中，该方法还包括校准程序，其包括以下步骤：
1)使用化学发光分析仪器的操作软件，进入校准程序，利用六个校准品进行复孔测定并校准；
2)提交校准任务；
3)由检测系统自动操作。
在本发明的一些优选的实施例中，该方法还包括质量控制程序，其包括：通过检测系统的处理器采用三次样条插值拟合进行拟合，自动给出样品的浓度值。
在本发明的一些实施方式中，采用如本发明第四方面所述的检测系统和如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒来判断待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白的正常范围的上限为0.2ng/mL，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度≥0.2ng/mL判定为阳性，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度＜0.2ng/mL判定为阴性。
本发明第五方面提供了一种使用如本发明第三方面所述的检测系统和使用如本发明第一方面所述的试剂盒或如第二或第四方面所述的方法在检测待测样品中14-3-3eta蛋白的存在和/或含量中的应用，其中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织。
本发明第六方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于检测类风湿性关节炎的试剂盒中的应用，其包括：
步骤M1，提供来自待测主体的待测样品；
步骤M2，判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量；
步骤M3，将其与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品、或来自同一待测主体的治疗前的样品中所述14-3-3 eta蛋白的含量比较；
其中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织。
在本发明的一些实施例中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的存在是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
在本发明的一些实施例中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量的增加是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
在本发明的一些实施例中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量增加0.2ng/ml是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
在本发明的一些实施例中，与类风湿性关节炎对照样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的相对含量是所述待测主体中类风湿性关节炎的预后性指示物。
在本发明的一些实施例中，与来自同一待测主体的治疗前的样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的相对含量指示治疗方案的效力。
在本发明的一些实施例中，在步骤M2中，采用本发明第三方面所述的检测系统和/或通过本发明第二或第四方面所述的方法来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
本发明所提供的用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒采用能够与14-3-3 eta蛋白特异性结合的第一抗14-3-3 eta蛋白抗体和第二抗14-3-3 eta蛋白抗体制成；其以双抗体夹心的方式，利用光激化学发光免疫分析平台的灵敏度高、线性范围宽、精密度好等优势，为临床诊断类风湿提高确诊率，为预防类风湿和提早发现类风湿提供辅助检测。
将本发明的试剂盒和检测系统应用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫分析具有以下优点：(1)信号值范围宽，达到定量测试标准；(2)灵敏度高，对早期RA与确定RA患者的敏感度高；(3)稳定性好，精密度好；(4)此试剂盒将成为国内首个14-3-3eta蛋白检测试剂盒。推动类风湿临床诊断的进步，为行业建立新标准。
附图说明
为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。
图1示出实施例1中不同样品组14-3-3 eta(η)蛋白的检测结果。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
“待测主体”、“受治疗者”和“患者”可互换使用，在没有特别说明或限定的情况下，是指哺乳动物，诸如人和非人灵长类、以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其它哺动物物种。
本发明所述用语“均相”所对应的英文定义为“homogeneous”，其是指无须对结合的抗原抗体复合物和剩余的游离抗原或抗体进行分离既可进行检测。
本发明所述用语“待测样品”是指可能含有被分析物的一种混合物，被分析物包括但不限于蛋白质、激素、抗体或抗原。可以被用在本发明公开的方法中的典型待测样品包括体液和组织，如血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织等。
本发明所述用语“14-3-3”和“14-3-3蛋白”可互换使用，是指在真核细胞中普遍表达的保守胞内调节分子的14-3-3家族的至少一个成员。14-3-3蛋白具有结合许多功能各异的信号转导蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体的能力。实际上，多于100种信号转导蛋白已被报道为14-3-3的配体。14-3-3蛋白可被认为是Tetratrico肽重复片段超家族的演化成员。它们通常具有9或10个α螺旋，通常沿着其氨基末端螺旋形成同二聚体和/或异二聚体相互作用。这些蛋白包含多个已知结构域，所述结构域包括用于二价阳离子相互作用、磷酸化&乙酰化和蛋白水解裂解的区域及其它。已知在哺乳动物中表达七种不同遗传编码的14-3-3蛋白同种型，每种同种型包含242-255个氨基酸。七种14-3-3蛋白同种型命名为14-3-3α/β(alpha/beta)、14-3-3δ/ξ(delta/zeta)、14-3-3ε(epsilon)、14-3-3γ(gamma)、14-3-3η(eta)、14-3-3τ/θ(tau/theta)和14-3-3σ(sigma/stratifin)。14-3-3蛋白具有高程度的序列相似性，已知经历翻译后处理如，磷酸化、瓜氨酸化、等等。参见如，Megidish等(1998)J.Biol.Chem.273：21834-45。因此，抗14-3-3自身抗体可特异性结合和/或识别多于一种14-3-3蛋白同种型，或可特异性结合和/或识别仅一种同种型(如，14-3-3η)。另外，抗14-3-3抗体可结合和/或识别已被如，天然(如，翻译后)或化学方法修饰的14-3-3-蛋白。
本发明中所述用语“相对特异性片段”是指针对14-3-3家族的7个同种型14-3-3蛋白，本发明人通过研究发现如SEQUENCE NO.1所示的14-3-3eta蛋白或其片段的氨基酸序列中片段1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa为仅属于14-3-3η(eta)蛋白的特异性表位，其与14-3-3家族的其他6个同种型14-3-3蛋白的氨基酸序列无任何交叉，由其产生的单克隆抗体，只识别或结合14-3-3η(eta)蛋白，不识别或结合14-3-3家族的其他6个同种型14-3-3蛋白。
本发明中所述“关节炎”与“关节炎疾患”和“关节痛”可互换使用，除了指明之处以外，通常是指人体关节的炎症性疾患。疼痛、肿胀、僵硬和难以移动通常与关节炎疾患有关。关节炎由多于100种不同情况组成。这些情况可以是任何情况，从相对轻微的形式到严重损害的系统形式。关节炎疾患可由多种原因的任何原因造成，包括感染、创伤、退行性疾病、代谢紊乱或干扰或其它未知病因。关节炎疾患可按照亚型更具体地描述，例如，类风湿性关节炎、混合性***病(MCTD)、晶体性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、骨关节炎、类肉瘤病、复发性风湿病、创伤后关节炎、恶性肿瘤相关的关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、骨关节炎、细菌传染性关节炎、等等。关节炎还可伴有其它鉴定的疾病，包括痛风、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病、等等。明确定义的关节炎疾患是指知晓关于关节炎的类型和其阶段，如，发作、缓解、复发、等等。
本发明所述用语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留对抗原的特异性结合的抗体片段；包括但不限于Fab、Fv、scFv、Fd片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双特异性抗体，以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或链霉亲和素(生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“单克隆抗体”是指由单克隆的B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。
本发明所述用语“多克隆抗体”是指由一个以上的B淋巴细胞克隆产生的免疫球蛋白集合，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”或“特异结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。
本发明所述用语“特异性结合配对成员”是指这样一对分子，它们能够相互特异性结合，例如，酶-底物、抗原-抗体、配基-受体。一个具体的特异性结合配对成员对的例子是生物素-链霉亲和素系统，其中“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等；而“链霉亲和素”是由链霉菌分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。“链霉亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。在任何需要的情况下，本发明中所用任何试剂，包括抗原、抗体、发光微粒或感光微粒，可以根据实际需要缀合生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的任一员。
本发明所述用语“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或者T细胞受体的任何蛋白决定簇。在本发明的一些具体实施例中，表位是抗原表面能够被抗体特异性集合的区域。表位决定簇通常可以包括分子的化学活性表面基团，例如但不限于：氨基酸、糖侧链、磷酰基和/或磺酰基。在本发明的其他一些具体实施例中，表位可以具体特定三位结构特征以及特定电荷特征。
在本发明中所述“感光微粒”是通过功能基团被包被在基体上形成填充有感光化合物的高分子微粒，在光激发下能够产生单线态氧。在本发明一些具体实施例中，所述感光化合物是光敏剂，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，和这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。在本发明一些实施例中，所述感光化合物是化学活化的其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些感光微粒的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。
本发明所述用语“发光微粒”是指能够与单线态氧反应可以产生可检测信号的高分子微粒。感光微粒被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的单线态氧，该高能态的单线态氧被近距离的发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒。在本发明的一些具体实施例中，所述发光微粒含有这样一类物质，其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。这些物质的典型例子包括但不限于：烯醇醚、烯胺、9-烷叉黄原胶、9-烷叉-N-烷基吖啶满、芳乙烯醚、双环氧乙烯、二甲基噻吩、芳香性咪唑或光泽精。在本发明的另一些具体实施例中，所述发光微粒是含有能够与单线态氧反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷的烯烃类化合物；可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷；可以与单线态氧反应以形成二酮类的乙炔类；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类，诸如鲁米诺；和可以形成内过氧化物类的芳族化合物。可以根据本公开和要求保护的发明利用的发光微粒的具体的、非限制性实例记载于美国专利号US5340716(该专利文献在此全文引为参考)。优选地，所述“发光微粒”可以是通过功能基团被包被在基体上形成填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。
本发明所述“基体”是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述基体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述基体可以是固体(如聚合物、金属、玻璃、有机和无机物诸如矿物、盐和硅藻)、小油滴(如碳氢化合物、碳氟化合物、硅质流体)、囊泡(如合成的诸如磷脂、或天然的诸如细胞、及细胞器官)。基体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。基体通常具有多功能性，或者能够通过特异或非特异的共价或非共价相互作用而结合到感光微粒或发光微粒上。有许多官能团是可用的或者将其合并进来。典型的官能团包括羧酸、乙醛、氨基、氰基、乙烯基、羟基、巯基等。适用于本发明的基体的一个非限制性的例子是羧基改性的乳胶颗粒。这种基体的详细情况可参见美国专利US5709994与US5780646(这两篇专利文献在此全文引为参考)。
本发明所述用语“化学发光免疫检测试剂套装”是指化学发光免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂的组合。
本发明所述用语“化学发光免疫检测试剂盒”是指含有化学发光免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂的盒或容器；所述“化学发光免疫检测试剂盒”既可以直接将化学发光免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂装入合适的盒或容器中制成，也可以将相应的“化学发光免疫检测试剂套装”装入合适的盒或容器中制成；所述“化学发光免疫检测试剂盒”还可以进一步用于构成或制备具体用途的，例如用于检测类风湿性关节炎的试剂盒。
Ⅱ.实施方案
如前所述，现有的检测14-3-3蛋白的方法均为非均相免疫检测法，这些方法灵敏较低，准确度不高，操作也较为复杂。本发明人研究发现，采用均相化学发光免疫检测法检验14-3-3蛋白灵敏度高、线性范围宽、精密度好，且检测过程中免去洗涤等步骤，操作较为简便。本发明正是基于上述发现做出的。
因此，本发明涉及一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂套装，其包括：第一试剂、第二试剂、校准品、低水平质控品和高水平质控品，其中：所述第一试剂包含包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒，所述第一抗14-3-3eta蛋白抗体能够与14-3-3 eta蛋白的第一表位特异性结合；
所述第二试剂包含能够与14-3-3 eta蛋白的第二表位特异性结合的含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体，所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，所述校准品、低水平质控品和高水平质控品均包含重组抗原14-3-3eta蛋白。
根据本发明，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成六个浓度水平的6瓶工作校准品溶液。
在本发明的一些实施例中，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成如下六个浓度水平的工作校准品溶液：0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL。
在本发明的一些优选的实施例中，所述校准品还包括新生牛血清和冻干保护剂。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品的质控范围为10％-40％，优选为10％-30％，更优选为10％-20％。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品的靶值浓度为0.20±0.05ng/mL。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品的质控范围为10％-40％，优选为10％-30％，更优选为10％-20％。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品的靶值浓度为5.0±1.0ng/mL。
根据本发明，所述试剂套装还包括第三试剂，其包含亲和素和/或链霉亲和素包被的感光微粒。
根据本发明，所述试剂套装还包括微孔板条。
本发明中，所述校准品、低水平质控品和/或高水平质控品均为冻干粉。
在本发明的一些优选的实施例中，所述低水平质控品和/或高水平质控品中包含新生牛血清。
在本发明的另一些优选的实施例中，第一试剂和/或第二试剂中包含蛋白稳定剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述蛋白稳定剂为牛血清白蛋白。
本发明中，所述第一试剂中的发光微粒为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，其能够与单线态氧反应而生成可检测的化学发光信号。
本发明中，所述第三试剂中的感光微粒为填充有感光化合物的高分子微粒，其能够在激发状态产生单线态氧。
在本发明的一些实施例中，所述第一试剂中包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒的浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选30-100μg/mL，最优选40-80μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述第二试剂中含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体的浓度为0.1-8μg/mL，优选0.2-6μg/mL，更优选0.4-4μg/mL，最优选0.6-2μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述第三试剂中所述亲和素和/或链霉亲和素包被的感光微粒的浓度为5-20μg/mL，优选8-15μg/mL，更优选10-12μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述14-3-3 eta蛋白的氨基酸序列如SEQUENCE NO.1所示。
在本发明的另一些实施例中，试剂套装在0.1ng/mL-20.0ng/mL范围内，试剂套装剂量-反应曲线线性相关系数(r)不低于0.990。
本发明第一方面所涉及的用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒为均相化学发光免疫检测试剂盒，其可以理解为通过将上述试剂套装装入合适的盒或容器中制成，也可以理解为将进行化学发光免疫检测所必须使用的全部试剂或药剂装入合适的盒或容器中制成；所述试剂盒包括：第一试剂、第二试剂、校准品、低水平质控品和高水平质控品，其中：
所述第一试剂包含包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒，所述第一抗14-3-3eta蛋白抗体能够与14-3-3 eta蛋白的第一表位特异性结合；
所述第二试剂包含能够与14-3-3 eta蛋白的第二表位特异性结合的含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体，所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
本发明中，所述校准品、低水平质控品和高水平质控品均包含重组抗原14-3-3eta蛋白。
本发明中，所述14-3-3 eta蛋白的序列如Sequence NO.1所示。而所述第二表位和所述第一表位分别独立第选自氨基酸片段为14-3-3 eta蛋白的序列的相对特异性片段：第1位-第6位氨基酸(1-6aa)、第27位-第38位氨基酸(27-38aa)、第71位-第83位氨基酸(71-83aa)、第112位-第119位氨基酸(112-119aa)和第141位-第154位氨基酸(141-154aa)。
本发明中，所述的第一抗14-3-3eta蛋白抗体和第二抗14-3-3eta蛋白抗体分别独立地选自单克隆抗体和/或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
本发明中所述单克隆抗体能够与14-3-3 eta蛋白的表位特异性结合。例如，本发明中所述的单克隆抗体为能够与所述14-3-3 eta蛋白的序列的相对特异性片段(表位)：1-6aa、27-38aa、71-83aa、112-119aa和141-154aa特异性结合的抗体。
本发明中对所述单克隆抗体的制备方法没有特别的限制，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。例如，在一些实施例中，制备14-3-3eta单抗，其包括：
步骤一、动物免疫
1、首次免疫
选取3-5只8周左右的Balb/c雄性小鼠，首次免疫将14-3-3eta抗原和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，每只小鼠经腹腔注射乳化后抗原，免疫剂量为100μg/只小鼠。
2、加强免疫
首次免疫后，每隔2周进行一次免疫，用14-3-3eta抗原和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，每只小鼠经腹腔注射乳化后抗原，免疫剂量为50μg/只小鼠，共进行3次免疫。隔2周后，经尾静脉注射未乳化抗原50μg/只小鼠进行最后一次加强免疫。
步骤二、细胞融合
最后一次加强免疫结束后第三天，无菌环境下处死小鼠取小鼠脾脏并用适当的方法均匀分散脾细胞。在PEG介导下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，并采用有限稀释法滴加至96孔细胞培养板进行培养。
步骤三、抗体检测
融合结束10天左右，待克隆长至适当大小，对各孔的细胞培养上清进行检测。具体检测方案如下：
1)用14-3-3eta抗原进行包板，并用2％BSA进行封闭；
2)加入细胞培养板中各孔的细胞培养上清，反应后充分洗涤；
3)加入HRP标记的抗鼠二抗，反应后充分洗涤；
4)加入TMB底物反应15min显色，加入2M硫酸终止反应并进行OD450读数，并确定阳性克隆对应的孔号。
步骤四、克隆化
将阳性克隆进行2-3次克隆化，使细胞株稳定。
步骤五、扩大培养，制备单抗
用体外培养或制备腹水等方式进行单抗制备。
本发明中对所述多克隆抗体的制备方法没有特别的限制，其可以通过本领域技术人员所公知的方法来制备得到。例如，在一些实施例中，制备14-3-3eta羊多抗，其包括：
步骤一、动物免疫及采血
1、首次免疫
将14-3-3eta重组蛋白浓度调节至2mg/ml，将2ml的完全佐剂和2ml14-3-3eta重组蛋白分别吸人两个5ml注射器内，然后***三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。取少量乳化后抗原，滴至清水表面，乳化抗原不扩散说明乳化成功。
选择2头健壮公羊，进行皮下多点注射，每头羊注射2ml乳化抗原(即2mg14-3-3eta抗原)
2、加强免疫
首次免疫后每隔2周进行一次加强免疫，共进行4次加强免疫
将14-3-3eta重组蛋白浓度调节至1mg/ml，将2ml的不完全佐剂和2ml14-3-3eta重组蛋白用相同方法进行乳化。
首次免疫后，由于完全佐剂中卡介苗以及抗原的刺激，羊会出现***肿大，此时用乳化的抗原进行***注射，尽可能多注射几个***。
3、取血，分离血清
最后一次加强免疫后一周，颈动脉放血，全血凝集后切成块状放置于37度孵育1-2小时，吸取血清并12000rpm离心5min去除血细胞等固体。
步骤二、多抗纯化
1、14-3-3 eta抗原免疫亲和柱制备
将14-3-3 eta抗原(与免疫用抗原带不同亲和标签，如免疫原带His标签，亲和纯化用抗原带GST标签)透析至0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3缓冲液中；
按每克干粉可溶胀成3ml凝胶，每ml凝胶偶联5mg抗原，称取适当量的CNBractivated sepharose 4B(GE)干粉，用1mM HCl溶胀并在抽滤瓶中不断洗涤，通常1ml凝胶需用100ml1mM HCl进行洗涤，将凝胶干粉中的保护剂洗涤干净；
用抽滤瓶滤干凝胶上残留液体，将溶胀好的凝胶加至透析好的14-3-3 eta抗原溶液中，并缓慢搅拌，2-8度反应过夜，使抗原通过共价键结合至凝胶上；
滤掉反应后的溶液上清，向偶联好的凝胶加入10倍体积的0.1M Tris.HCl，PH8.0，用Tris的游离氨基分别凝胶上未反应的活性基团；
凝胶装柱，用0.1M Tris.HCl，0.5M NaCl，pH8.5和0.1M HAc，0.5M NaCl，PH4.0两种缓冲液轮流冲洗10倍柱体积，重复冲洗5遍，以去除非共价结合的抗原，至此亲和柱制备完成。
2、多抗亲和层析纯化
用3倍体积生理盐水稀释14-3-3eta抗血清，并在搅拌的情况下逐渐加入稀释后抗血清等体积的饱和硫酸铵溶液，使之产生沉淀；
12000rpm离心以上混合液10min，弃上清，沉淀用原始抗血清3-5倍体积的PBS溶解，并用0.22μm过滤器过滤；
用PBS平衡14-3-3 eta抗原亲和柱，将以上滤液上样至亲和柱，上样完毕后用PBS进行洗涤，直至没有蛋白被洗涤出来；
用0.1M甘氨酸，pH3.0缓冲液对以上柱进行洗脱，收集洗脱液并及时用3MTris.HCl，pH8.5进行中和；
洗脱液用20倍体积的PBS进行透析，每4小时以上换透析液一次，共换2次透析液，得到亲和纯化的14-3-3 eta多抗。
在本发明的一些优选的实施例中，所述校准品还包括新生牛血清和冻干保护剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述校准品含重组抗原14-3-3 eta蛋白、新生牛血清和冻干保护剂。在本发明的一些优选的实施例中，例如，所述校准品被校准品稀释液按照比例梯度稀释成六个浓度水平的6个工作校准品溶液，六个浓度水平分别为：0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL。
本发明中，所述校准品、低水平质控品和/或高水平质控品均为冻干粉。
在本发明的一些优选的实施例中，所述低水平质控品和/或高水平质控品中还包含新生牛血清。
在本发明的一些优选的实施例中，所述低水平质控品和/或高水平质控品中还包含防腐剂。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品(冻干粉)含重组抗原14-3-3 eta蛋白、新生牛血清、防腐剂。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品的质控范围为10％-40％；优选为10％-30％；更优选为10％-20％。
在本发明的一些实施例中，所述低水平质控品的靶值浓度为0.20±0.05ng/mL。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品(冻干粉)含重组抗原14-3-3 eta蛋白、新生牛血清、防腐剂。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品的质控范围为10％-40％；优选为10％-30％；更优选为10％-20％。
在本发明的一些实施例中，所述高水平质控品的靶值浓度为5.0±1.0ng/mL。
根据本发明，所述试剂盒还包括第三试剂，其包含亲和素和/或链霉亲和素包被的感光微粒。
本发明中，所述第三试剂中的感光微粒为填充有感光化合物的高分子微粒，其能够在激发状态产生单线态氧。
本发明中，所述第一试剂中的发光微粒为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，其能够与单线态氧反应而生成可检测的化学发光信号。
在本发明的一些优选的实施例中，第一试剂和/或第二试剂中包含蛋白稳定剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述蛋白稳定剂为牛血清白蛋白。
在本发明的一些优选的实施例中，第一试剂和/或第二试剂中还包含磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些优选的实施例中，第一试剂和/或第二试剂中还包含防腐剂。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述第一试剂包含包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒、磷酸盐缓冲液、蛋白稳定剂和防腐剂。
在本发明的另一些具体优选的实施例中，所述第二试剂包含包含能够与14-3-3eta蛋白的第二表位特异性结合的含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体、磷酸盐缓冲液、蛋白稳定剂、防腐剂。
在本发明的一些实施例中，所述第一试剂中包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒的浓度为10-200μg/mL，优选20-150μg/mL，更优选30-100μg/mL，最优选40-80μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述第二试剂中含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体的浓度为0.1-8μg/mL，优选0.2-6μg/mL，更优选0.4-4μg/mL，最优选0.6-2μg/mL。
在本发明的一些实施例中，所述第三试剂中所述亲和素和/或链霉亲和素包被的感光微粒的浓度为5-20μg/mL，优选8-15μg/mL，更优选10-12μg/mL。
在本发明的一些实施例中，试剂盒在0.1ng/mL-20.0ng/mL范围内，试剂盒剂量-反应曲线线性相关系数(r)不低于0.990。
根据本发明，所述试剂盒还包括微孔板条。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法主要包括，制备第一试剂的步骤和第一制备试剂的步骤；其中，第一试剂包含包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒，所述第一抗14-3-3eta蛋白抗体能够与14-3-3 eta蛋白的第一表位特异性结合；第二试剂包含能够与14-3-3 eta蛋白的第二表位特异性结合的含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体，所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
在本发明的一些具体实施例中，制备第一试剂(第一抗14-3-3eta蛋白抗体包被的发光微粒)的步骤包括：
步骤S1，将一定浓度的发光微球溶液与第一抗14-3-3eta蛋白抗体在包被缓冲溶液中混合得到第Ⅰ混合物；
步骤S2，向第Ⅰ混合物中加入终止液终止反应，然后再加入封闭液进行封闭，经清洗后，得到第一试剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述终止液为硼氢化钠溶液，所述硼氢化钠溶液的浓度为2-40mg/ml，优选4-30mg/ml，更优选5-10mg/ml。
在本发明的一些优选的实施例中，所述封闭液为甘氨酸溶液，所述甘氨酸溶液的浓度为10-200mg/ml，优选20-150mg/ml，更优选50-100mg/ml。
在本发明的一些具体实施方式中，第二试剂(第二抗14-3-3eta蛋白抗体标记的生物素)的步骤包括：
步骤T1，将一定浓度的生物素溶液与第二抗14-3-3eta蛋白抗体在标记缓冲溶液中混合得到第Ⅱ混合物；
步骤T2，对第Ⅱ混合物进行透析，经缓冲溶液稀释后，得到所述第二试剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述包被缓冲溶液和标记缓冲溶液均为碳酸氢钠缓冲溶液。
在本发明的一些具体实施方式中，本发明所述用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法主要包括，制备第一试剂的步骤和第一制备试剂的步骤，其中，第一试剂包含包被第一抗14-3-3eta蛋白抗体的发光微粒、蛋白稳定剂和防腐剂，所述第一抗14-3-3eta蛋白抗体能够与14-3-3 eta蛋白的第一表位特异性结合；第二试剂包含能够与14-3-3 eta蛋白的第二表位特异性结合的含生物素标记的第二抗14-3-3eta蛋白抗体、蛋白稳定剂和防腐剂，所述第二表位和所述第一表位不相重叠。
在本发明的一些具体实施例中，制备第一试剂(第一抗14-3-3eta蛋白抗体包被的发光微粒、蛋白稳定剂和防腐剂)的步骤包括：
步骤S1，将一定浓度的发光微球溶液与第一抗14-3-3eta蛋白抗体在包被缓冲溶液中混合得到第Ⅰ混合物；
步骤S2，向第Ⅰ混合物中加入终止液终止反应，然后再加入封闭液进行封闭，经清洗后加入缓冲溶液、蛋白稳定剂和防腐剂，得到第一试剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述终止液为硼氢化钠溶液，所述硼氢化钠溶液的浓度为2-40mg/ml，优选4-30mg/ml，更优选5-10mg/ml。
在本发明的一些优选的实施例中，所述封闭液为甘氨酸溶液，所述甘氨酸溶液的浓度为10-200mg/ml，优选20-150mg/ml，更优选50-100mg/ml。
在本发明的一些具体实施方式中，制备第二试剂(第二抗14-3-3eta蛋白抗体标记的生物素、蛋白稳定剂和防腐剂)的步骤包括：
步骤T1，将一定浓度的生物素溶液与第二抗14-3-3eta蛋白抗体在标记缓冲溶液中混合得到第Ⅱ混合物；
步骤T2，对第Ⅱ混合物进行透析，经缓冲溶液稀释后，加入蛋白稳定剂和防腐剂，得到所述第二试剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述包被缓冲溶液和标记缓冲溶液均为碳酸氢钠缓冲溶液。
在本发明第二方面，本发明所涉及的检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测方法为均相化学发光免疫检测方法，其包括使用如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
类似地，本发明所涉及的检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测方法，还可以包括使用本发明前述的化学发光免疫检测试剂套装来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施方式中，所述检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测方法包括：
步骤R1，将待测样品与第一试剂和第二试剂混合，得到第一混合物；
步骤R2，将第一混合物与第三试剂混合，得到第二混合物；
步骤R3，使能量或者活性化合物与所述第二混合物接触，激发所述感光微粒产生单线态氧，所述发光微粒能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；
步骤R4，检测步骤R3中所述化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述方法还包括在步骤R1之前的制作14-3-3 eta蛋白标准工作曲线的步骤。在本发明的一些具体实施例中，所述制作14-3-3 eta蛋白标准工作曲线的步骤包括：首先根据步骤R1-R4，检测出含有不同浓度的14-3-3 eta蛋白的工作校准品溶液的化学发光信号值，然后根据浓度与信号值的对应关系，拟合出14-3-3 eta蛋白标准工作曲线，得到14-3-3 eta蛋白的浓度与化学发光信号值之间的函数关系。
在本发明的一些进一步的实施例中，在步骤R4中，检测步骤R3中所述化学发光信号的强度，并基于14-3-3 eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3eta蛋白的含量。
本发明中，待检样品在均相化学发光条件下反应，过程无需洗涤，亦即步骤R1和R2之间以及步骤R2和R3之间没有分离和/或洗涤的步骤。
在本发明的一些实施例中，在步骤R3中，使用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发感光微粒产生单线态氧，发光微粒与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光。
在本发明的一些优选的实施例中，该方法还包括校准步骤：利用0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL的六个浓度水平的工作校准品溶液进行测定并校准。
在本发明的另一些优选的实施例中，该方法还包括质量控制步骤，采用三次样条插值拟合进行拟合，给出样品的浓度值。
在本发明的又一些实施例中，使用本发明前述试剂套装或如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白的正常范围的上限为0.2ng/mL，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度≥0.2ng/mL判定为阳性，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度＜0.2ng/mL判定为阴性。
在本发明的一些具体实施例中，判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白，所述检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的均相化学发光免疫检测方法包括：
(1)将待测样品与第一试剂和第二试剂混合，得到第一混合物；
(2)将第一混合物与第三试剂混合，得到第二混合物；
(3)使用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，其能够激发感光微粒产生单线态氧，发光微粒与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光作为可检测的化学发光信号；
(4)检测步骤(4)中的化学发光信号是否存在。
在本发明的一些进一步具体的实施例中，确定14-3-3 eta蛋白的含量，所述检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的均相化学发光免疫检测方法包括：
步骤一、制作14-3-3 eta蛋白标准工作曲线。
(1)取工作校准品溶液(六个浓度水平分别为：0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、
2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL)与第一试剂和第二试剂混合，得到第三混合物；
(2)将第三混合物与第三试剂混合，得到第四混合物；
(3)使用600-700nm波长的激发光照射第四混合物，激发感光微粒产生单线态氧，发光微粒与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光作为可检测的化学发光信号；
(4)检测步骤(3)中产生的化学发光信号的强度；
(5)检测出含有不同浓度的14-3-3 eta蛋白的工作校准品溶液的化学发光信号值(强度)，然后根据浓度与信号值的对应关系，拟合出14-3-3 eta蛋白标准工作曲线，得到14-3-3 eta蛋白的浓度与化学发光信号值之间的函数关系。
步骤二、检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量。
(1)将待测样品与第一试剂和第二试剂混合，得到第一混合物；
(2)将第一混合物与第三试剂混合，得到第二混合物；
(3)使用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发感光微粒产生单线态氧，发光微粒与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光作为可检测的化学发光信号；
(4)检测步骤(3)中产生的化学发光信号的强度，并基于14-3-3 eta蛋白标准工作曲线来确定待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量。
(5)使用本发明前述试剂套装或如本发明第一方面所述的化学发光免疫检测试剂盒来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白的正常范围的上限为0.2ng/mL，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度≥0.2ng/mL判定为阳性，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度＜0.2ng/mL判定为阴性。
本发明第三方面提供了一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测系统，其利用本发明前述试剂套装或本发明第一方面所述的试剂盒通过本发明第二方面所述的方法来检测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述检测系统包括：
反应装置，其用于待测样品与第一试剂、第二试剂发生化学发光免疫反应；
激发和读数装置，其用于激发和记录化学发光免疫反应的化学发光信号；
处理器，其根据所述化学发光信号的存在和/或强度判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，所述处理器采用三次样条插值拟合进行拟合，直接给出样品的浓度值。
在本发明的一些具体实施例中，本发明所述检测系统包括进样模块、加样臂模块、孵育盘模块、试剂盘模块、试剂臂模块、激发和读数模块以及处理器模块；其中，进样模块中的样本通过所述加样臂模块转移到位于所述孵育盘模块上的反应杯中，反应杯随孵育盘转动至指定位置后，试剂臂模块将试剂盘模块中的试剂转移到所述反应杯中，反应杯内的样品与试剂在孵育盘模块经混合孵育，孵育结束后反应杯被转至激发和读数模块进行光激发并对激发后产生的发光信号进行读数检测；最后，处理器模块根据所产生的发光信号的存在和/或强度判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
本发明第四方面提供了一种用于检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测方法，其使用本发明第三方面所述的检测系统和本发明前述试剂套装或本发明第一方面所述的试剂盒来检测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量。
在本发明的一些实施例中，该方法包括以下步骤：
1)在反应孔中分别加入待测样品或校准品、质控品；
2)在反应孔中依次加入第一试剂和第二试剂；
3)对步骤2)中得到的混合物进行温育；
4)在反应孔中加入第三试剂；
5)对步骤4)中得到的混合物进行温育；
6)激光照射反应孔并计算每孔发光光子量；
7)根据标准曲线，计算待测样品中待测目标分子的浓度。
在本发明的一些具体实施例中，该方法包括以下步骤：
1)在反应孔中分别加入25μL待测样品或校准品、质控品；
2)在反应孔中依次加入25μL第一试剂和25μL第二试剂；
3)37℃温育15分钟；
4)在反应孔中加入第三试剂175μL；
5)37℃温育10分钟；
6)激光照射微孔并计算每孔发光光子量；
7)根据标准曲线，计算样品浓度。
在本发明的一些优选的实施例中，该方法还包括校准程序，其包括以下步骤：
1)使用化学发光分析仪器的操作软件，进入校准程序，利用六个校准品进行复孔测定并校准；
2)提交校准任务；
3)由检测系统自动操作。
在本发明的另一些优选的实施例中，该方法还包括质量控制程序，其包括：通过检测系统的处理器采用三次样条插值拟合进行拟合，自动给出样品的浓度值。
在本发明的一些实施方式中，采用本发明第三方面所述的检测系统和本发明前述试剂套装或本发明第一方面所述的试剂盒来判断待测样品中是否存在14-3-3eta蛋白的正常范围的上限为0.2ng/mL，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度≥0.2ng/mL判定为阳性，当待测样品中14-3-3 eta蛋白的浓度＜0.2ng/mL判定为阴性。
在本发明第五方面，本发明所提供的如本发明第三方面所述的检测系统在检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的存在和/或含量中的应用，可以理解为使用如本发明第三方面所述的检测系统和本发明前述试剂套装或本发明第一方面所述的试剂盒通过本发明第二或第四方面所提供的化学发光免疫检测方法来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量的方法，其中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
同样地，本发明所提供的如本发明前述试剂套装或如本发明第一方面所述的试剂盒在检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的存在和/或含量中的应用，可以理解为使用如本发明第三方面所述的检测系统通过本发明第二或第四方面所提供的化学发光免疫检测方法来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量的方法，其中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
类似地，本发明所提供的如本发明第二或第四方面所提供的化学发光免疫检测方法在检测待测样品中14-3-3 eta蛋白的存在和/或含量中的应用，可以理解为利用本发明第三方面所述的检测系统和本发明前述试剂套装或本发明第一方面所提供的试剂盒，并通过如本发明第二或第四方面所述的化学发光免疫检测方法来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量的方法，其中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
本发明第六方面所涉及的如本发明前述试剂套装或如本发明第一方面所述的试剂盒在制备用于检测类风湿性关节炎的试剂盒中的应用，可以理解为利用如本发明前述试剂套装或如本发明第一方面所述的试剂盒来制备用于检测类风湿性关节炎的试剂盒中的方法，其包括：
步骤M1，提供来自待测主体的待测样品；
步骤M2，采用本发明第三方面所述的检测系统和/或通过本发明第二或第四方面所述的方法来判断测待测样品中是否存在14-3-3 eta蛋白和/或确定14-3-3 eta蛋白的含量；
步骤M3，将其与正常对照样品、类风湿性关节炎对照样品、或来自同一待测主体的治疗前的样品中所述14-3-3 eta蛋白的含量比较；
其中，所述待测样品选自血液、血液衍生物、血清、血浆、尿液、脑脊髓液、***、唾液、滑膜液、肺气肿积液和组织，优选所述待测样品选自血液、血浆和血清，进一步优选所述待测样品为血清。
本发明中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的存在是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
本发明中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量的增加是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
在一些优选的实施例中，与正常对照样样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的含量增加0.2ng/ml是所述待测主体中类风湿性关节炎的诊断性指示物。
本发明中，与类风湿性关节炎对照样品相比，所述待测样品中14-3-3 eta蛋白的相对含量是所述待测主体中类风湿性关节炎的预后性指示物。
本发明中，与来自同一待测主体的治疗前的样品相比，所述待测样品中14-3-3eta蛋白的相对含量指示治疗方案的效力。
Ⅲ.具体实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
本发明所述方法中，所有试剂在组合或混合后，均可以根据实际需要进行混匀和/或温育。具体地，所述温育的温度可以是25-45℃温度范围内的任意温度，温育时间可以是过夜或者10-20min均可。
实施例1：
1、第一试剂(抗14-3-3eta蛋白抗体包被的发光微粒)的制备：
(1)发光微粒和感光微粒的制备
用作本发明的发光微粒和感光微粒的制备方法、组成结构及其含量可以参见中国专利CN100429197C(该专利文献在此全文引为参考)中的实施例1。
(2)预处理
将待处理0.2mg抗体原料装入透析袋(截留分子量为14KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.05M pH9.6 CB透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中，取样测定蛋白浓度。
(3)包被过程
3.1取2mg发光微粒加入离心管，加入0.05M pH9.6 CB交联缓冲液，离心7500rpm，15min，弃上清，向离心管中加入400ul交联缓冲液，进行超声清洗微粒，再次离心。
3.2加入200ul交联缓冲液将微粒重悬，使微粒浓度为10mg/ml，再加入0.1mg抗体原料，混匀后将离心管置于37℃，垂直旋转混合器上25-40rpm混匀过夜。
3.3将离心管放入2-8℃冷却10min，取4μL的8mg/ml NaBH4溶液，立即加入离心管内并混匀，室温，垂直旋转混合器上25-40rpm反应2小时。
3.4在离心管中加入32μL的75mg/mL Gly溶液混匀，垂直旋转混合器上25-40rpm反应1小时。
(4)清洗
离心管称重配平后，离心7500rpm，15min，弃上清，加入0.1M pH7.4 PBST清洗缓冲液，进行超声清洗微粒。重复两次，再用微粒保存缓冲液清洗一次。
(5)配制
加入4mL工作稀释液，使其工作浓度为50μg/mL，制得第一试剂，备用。
2、第二试剂(抗14-3-3eta蛋白抗体标记的生物素)的制备：
(1)预处理
取待处理0.2mg抗体原料装入透析袋(截留分子量为14KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.1M pH8.0 NaHCO3透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。将透析好的蛋白吸出转移至干净离心管中，取样测定蛋白浓度。
(2)标记过程
取200μL0.1M pH8.0 NaHCO3标记缓冲液加入离心管，加入0.1mg抗14-3-3eta蛋白抗体原料，混匀。再加入配制好的5mg/mL生物素溶液8μL，迅速混匀。2-8℃垂直旋转混合器上25-40rpm反应过夜。
(3)透析
取待处理生物素标记溶液装入透析袋(截留分子量为14KD)中，将透析袋放入烧杯，在烧杯中加入100倍体积0.1M pH7.4 PBS透析缓冲液，放在磁力搅拌器上，2-8℃进行透析。至少更换透析液1次，每次至少透析4-5小时。
(4)配制
加入20mL工作稀释液，使其工作浓度为1μg/mL，制得第二试剂，备用。
3、14-3-3 eta蛋白校准品的制备：
1.1校准品稀释液的配制：称取HEPES 4.77g、NaCl 1.7g，添加纯化水160g混匀30min，使用1M的浓盐酸和1M的NaOH溶液调pH值至7.4±0.2，继续添加Proclin300 0.1g、BSA 30g、1M MgCl2 0.5mL、0.1M MgCl2 0.1mL，搅拌30min后添加纯化水定重至200g，复测pH值后，2-8℃备用。
1.2校准品的配制：用校准品稀释液按照比例梯度稀释成工作校准品，再由由工作校准品标定出产品校准品抗体浓度，完成校准品的制备。
4、实验操作：
将上述组份组装成14-3-3 eta蛋白测定盒后，装载在由博阳生物科技(上海)有限公司生产的LiCA500全自动光激化学发光免疫分析仪上，设置检测步骤：
1)加样Tip头吸取20μL校准品至反应微孔板中；
2)加样Tip头吸取25μL试剂Ⅰ至反应微孔板中；
3)加样Tip头吸取25μL试剂Ⅱ至反应微孔板中；
4)水平振荡混匀20秒后37℃孵育17min；
5)加样Tip头吸取175μL包含链霉亲和素修饰的感光微粒的混合液(仪器配套)至反应微孔板中；
6)水平振荡混匀20秒后37℃孵育15min；
7)在仪器产生的680nm激发光照射下，感光微粒被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子。该高能态的活性氧离子在近距离被发光微粒俘获，从而传递能量以激活发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出612nm的高能级红光，用单光子计数器测定这些高能级光子；
8)根据校准品的信号值，按照五参数拟合方法拟合出标准曲线，得出信号值与14-3-3 eta蛋白浓度之间的方程式；
9)同样再按照步骤1)-7)检测待测样品，由8)中的方程式计算得出待测样品中14-3-3 eta蛋白浓度。
5、实验结果
5.1检验工作校准品的线性范围
检验工作校准品的线性范围，结果见表1。
表1
从表1可以看出，标准曲线度拟合方程R2＞0.99。在0.2-20ng/mL的测量范围内具有非常好的线性。
5.2灵敏度
用低浓度样品重复20次测值，结果见表2。从表2可以看出，其检测结果精密度为7.42％，所以功能灵敏度可达0.2ng/mL。当样品中含有0.2ng/mL检测目标物时，便能产生区别于正常人群(零浓度样品)的信号值，具备高度灵敏性。
表2
5.3评价结果
采用所制备的试剂盒评价46例类风湿病例组样品和50例正常对照组样品，结果见表3、图1，同时，对其他关节炎样品进行检测，结果见表4和图1。
表3
表4
结论：健康体检组样品中14-3-3η蛋白浓度均低于0.2ng/mL，类风湿关节炎组中有19例样品检测14-3-3η蛋白浓度高于0.2ng/mL，表明14-3-3η亚型蛋白在关节炎患者中高水平表达，在RA患者血清被检测出显著增高。同时，在检测其他关节炎样品时，14-3-3η蛋白浓度均低于0.2ng/mL，因此认为14-3-3η蛋白检测结果与临床诊断类风湿相关，提示检测此蛋白可提高对类风湿性关节炎的诊断，帮助临床对RA的确诊。
实施例2：采用本发明的用于检测待测样品中的14-3-3η蛋白的试剂盒来检测检测待测样品中的14-3-3η蛋白
1、检测待测样品中的14-3-3η蛋白的试剂盒主要组成成分如下：
第一试剂：2×50测试/盒，1.5mL/瓶×2瓶；2×100测试/盒，3.0mL/瓶×2瓶。含抗14-3-3 eta蛋白抗体包被的发光微粒、磷酸盐缓冲液、蛋白稳定剂、防腐剂，2℃-8℃避光保存。
第二试剂：2×50测试/盒，1.5mL/瓶×2瓶；2×100测试/盒，3.0mL/瓶×2瓶。含生物素标记的抗14-3-3 eta蛋白抗体、磷酸盐缓冲液、蛋白稳定剂、防腐剂，2℃-8℃避光保存。
校准品(冻干粉)：2×50测试/盒，0.5mL/瓶，共6瓶；2×100测试/盒，0.5mL/瓶，共6瓶。含重组抗原14-3-3 eta蛋白、新生牛血清、冻干保护剂。六个浓度水平分别为：0ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL，具体浓度见定值单，2℃-8℃保存。
低水平质控品(冻干粉)：2×50测试/盒，0.5mL/瓶，共2瓶；2×100测试/盒，0.5mL/瓶，共2瓶。含重组抗原14-3-3 eta蛋白、新生牛血清、防腐剂，靶值浓度为：(0.20±0.05)ng/mL，批特异，质控品质控范围详见定值单，2℃-8℃保存。
高水平质控品(冻干粉)：2×50测试/盒，0.5mL/瓶，共2瓶；2×100测试/盒，0.5mL/瓶，共2瓶。含重组抗原14-3-3 eta蛋白、新生牛血清、防腐剂，靶值浓度为：(5.0±1.0)ng/mL，批特异，质控品质控范围详见定值单，2℃-8℃保存。
其它必需材料(见表5)
表5
2、待测样品准备：
(1)待测样品为血清；
(2)按照通用的静脉穿刺措施来收集所有的血液样本；
(3)确保离心处理前样本已经充分凝集；
(4)如在室温条件下，样本在塞紧的试管内保存不超过8小时；短期使用，可于2℃-8℃中保存3天；需长期储存的样本，可在-20℃稳定3个月，避免反复冻融，在解冻后要充分混合；
(5)脂血样本推荐使用超速离心法离心。
3、检验方法
本实施例中的试剂盒可对14-3-3 eta蛋白进行定量测定，检测时请使用校准品进行定标，质控品进行质控。
4、试剂配制
试剂开瓶即可使用；校准品、质控品需用0.5mL蒸馏水或去离子水溶解，平衡至环境温度且混匀后使用。
5、实验条件
检测过程由博阳生物科技(上海)有限公司生产的LiCA 500自动光激化学发光分析系统全自动完成并输出检测结果。具体流程步骤如下：
(1)在反应孔中分别加入25μL样品或校准品、质控品；
(2)在反应孔中依次加入25μL第一试剂和25μL第二试剂；
(3)37℃温育15分钟；
(4)加入第三试剂175μL；
(5)37℃温育10分钟；
(6)激光照射微孔并计算每孔发光光子量；
(7)根据标准曲线，计算样品浓度。
6、校准程序
初次实验时，以人14-3-3 eta蛋白测定试剂盒内校准品对仪器进行校准，校准周期为28天。
校准方法为：
(1)使用LiCA 500自动光激化学发光分析系统的操作软件，进入人14-3-3 eta蛋白测定试剂盒校准程序，用校准品1-校准品6进行复孔测定并校准。
(2)提交校准任务。
(3)由仪器自动操作。
7、质量控制程序
使用本实施例试剂盒配套质控品。实验时应该进行质控品的检测，单孔测定，检测结果应在要求的质控范围内，如超出范围，则本次实验结果不可信，必须重新检测，必要时重新校准。
8、实验结果的计算
采用LiCA 500自动光激化学发光检测仪软件的数据处理程序(拟合类型：三次样条插值拟合)，直接给出样品的浓度值。
9、参考区间
本实施例试剂盒的正常范围的上限为0.2ng/mL。
按以下原则解释结果：≥0.2ng/mL为阳性，＜0.2ng/mL为阴性。
10、实验结果
经过实验，本实施例的试剂盒的性能指标如下：
空白限：不高于0.1ng/mL。
准确度：将已知浓度的抗原加入到血清样本中，制成高、低浓度(在试剂盒测定线性区间内)的回收样本，其回收率在(85％-115％)范围内。
线性：试剂盒在0.1ng/mL-20.0ng/mL范围内，试剂盒剂量-反应曲线线性相关系数(r)不低于0.990。
精密度：分析内精密度：变异系数(CV)不大于10.0％；
批间精密度：变异系数(CV)不大于15.0％。
校准品、质控品瓶间差：变异系数(CV)不大于10.0％。
质控品赋值有效性：测定结果均应在本试剂盒规定的范围之内。
特异性：浓度为200ng/mL的六个蛋白14-3-3α/β，14-3-3γ，14-3-3δ/ζ，14-3-3ε，14-3-3θ/τ，14-3-3σ在本试剂盒上的测定结果，计算交叉反应率低于0.1％，结果见表6。
表6
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京科美生物技术有限公司
<120> 检测14-3-3 eta蛋白的化学发光免疫检测试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> （14-3-3eta蛋白）
<400> 1
Met Thr Met Asp Lys Ser Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu
1 5 10 15
Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Ala Val Thr
20 25 30
Glu Gln Gly His Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val
35 40 45
Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile
50 55 60
Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Gln Gln Met
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Cys
85 90 95
Asn Asp Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Pro Asn Ala Thr
100 105 110
Gln Pro Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe
115 120 125
Arg Tyr Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Asp Asn Lys Gln Thr Thr Val
130 135 140
Ser Asn Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys
145 150 155 160
Glu Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe
165 170 175
Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser
180 185 190
Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu
195 200 205
Asn Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg
210 215 220
Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Glu Asn Gln Gly Asp Glu Gly Asp
225 230 235 240
Ala Gly Glu Gly Glu Asn
245