具体实施方式

一般技术和定义

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应被视为具有与本领域(如，细胞培养、细胞生物学、分子遗传学、神经科学、免疫学、药理学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常理解的相同含义。

除非另有说明，本发明所用的细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这些技术在以下来源文献中都有描述和解释，例如，J.Perbal，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)，John Wiley and Sons(1984)，Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编)，《基本分子生物学：一种实用方法》(Essential Molecular Biology：A Practical Approach)，第1卷和第2卷，IRLPress(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编)，《DNA克隆：一种实用方法》(DNA Cloning：APractical Approach)，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel等人，(编)，《最新分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括目前为止的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编)《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，(1988)，以及J.E.Coligan等人，(编)《最新免疫学实验指南》(CurrentProtocols in Immunology)，John Wiley&Sons(包括目前为止的所有更新)。

如本文所用，除非有相反的说明，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％。

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变化形式将被理解为意指包括所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

如在本申请中所使用的，术语“或”旨在表示包括性的“或”而不是排他性的“或”。即，除非另外指定或从上下文清楚地看出，“X采用A或B”旨在表示任何自然的包括性置换。即，如果X采用A；X采用B；或者X使用A和B，则在任何前述情况下满足“X采用A或B”。此外，A和B等中的至少一个通常意指A或B或A和B两者。此外，在本申请和所附权利要求中使用的冠词“一(a)”和“一(an)”通常可以被解释为表示“一个或多个”，除非另外指定或从上下文清楚地指示为单数形式。

如本文所用，术语“水凝胶亚单位材料”是指惰性合成聚合物(例如，PEG和/或PVA)，其是生物相容性的并且可以衍生化和/或交联以形成水凝胶。

如本文所用的术语“模块化合成水凝胶”是指包括以下的水凝胶：(a)已经衍生化以添加多个官能团以形成共价或非共价键合的聚合物支架；以及(b)将已经用多个官能团衍生化的肽或多肽(例如多肽、糖胺聚糖如肝素)与聚合物骨架连接以将其交联，多个官能团可以与其他肽(例如，细胞粘附肽)形成共价或非共价键。

如本文所用的术语“合成组织”或“合成脑微组织(SBM)”是指包括包埋在模块化合成水凝胶中的细胞群的3D构建体。

如本文所用，术语“肽”是指长度为2个至约50个氨基酸(例如4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40或45个氨基酸)的氨基酸的聚合物。术语肽包括未修饰的肽、磷酸化肽(例如，磷酸肽)和其它化学衍生的肽，但不是肽模拟物。

如本文所用，术语“多肽”或“蛋白”是指通常长度大于约50个氨基酸并且通常具有特征性二级和三级结构的氨基酸的聚合物。

如本领域技术人员将理解的，本文的合成组织将以治疗有效量施用。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的合成组织的足够量，其将在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是神经障碍的体征、症状或病因的缓解和/或减轻，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病症状的临床显著降低而没有不适当的不良副作用所需的合成组织的量。在任何个别情况下，适当的“有效量”可以使用诸如剂量递增研究的技术来测定。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。合成组织的“有效量”是有效实现期望的治疗改善而没有不适当的不良副作用的量。应理解，由于多种因素变化，“有效量”或“治疗有效量”可因受试对象而异，因素包括但不限于受试对象的年龄和一般状况、所治疗的病症、所治疗的病状的严重程度和开处方医师的判断。仅举例而言，治疗有效量可通过常规实验测定，包括但不限于剂量递增临床试验。

如本文所用的术语“小分子治疗剂”是指分子量低于2000道尔顿并被批准用于人治疗的药理学试剂。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指由医学专业人员对受试对象的直接治疗(例如，通过对受试对象施用治疗剂)或由至少一方(例如，医生、护士、药剂师或药品销售代表)通过以任何形式提供指令来实现的间接治疗，所述指令(i)指示受试对象根据所要求的方法自我治疗(例如，自己施用药物)或(ii)指示第三方根据所要求的方法治疗受试对象。还包括在术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”的含义内的是例如，通过在疾病的足够早期施用治疗剂以预防或减缓其进展来预防或减轻待治疗的疾病。

治疗方法

本文所述的一些方法包括通过施用治疗有效量的生物相容性合成组织来修复有需要的受试对象的神经系统组织，该生物相容性合成组织包括细胞群，细胞群包括(a)一种或多种神经系统细胞类型(例如神经元、神经祖细胞、星形胶质细胞或(b)多能细胞，其中细胞群包埋在模块化合成水凝胶内。本文所述的方法还包括通过上述合成组织给药来治疗神经障碍。通过使用模块化的合成水凝胶促进神经系统修复，以促进体外功能成熟和水凝胶基质内细胞的连接性。特别地，如本文，水凝胶基质部分地与细胞可切割肽交联，使得在培养中，基质通过成熟的细胞群逐渐重新配置，并且细胞外基质沉积以提供组织模拟环境。

在一些实施方案中，用于修复受试对象的神经系统组织或用于治疗受试对象的神经障碍的方法包括向受试对象施用治疗有效量的通过包括以下步骤的方法获得的合成组织：

(i)将包括(a)一种或多种神经系统细胞类型，或(b)多能细胞的细胞群包埋在模块化合成水凝胶中；以及

(ii)培养包埋的细胞群一段时间。

在一些实施方案中，在培养期之后，其中包埋细胞群的模块化合成水凝胶在给药之前已经基本上降解。在一些实施方案中，在合成组织给药至给受试对象之前，约10％(按质量计)至基本上所有的模块化合成水凝胶已经降解，例如，15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或从约10％的合成水凝胶(质量)至基本上所有模块化合成水凝胶的其它百分比在给药至合成组织之前已经降解。

不受理论的约束，据信相对于先前的细胞疗法或外植体方法，使用此类合成组织极大地促进组分细胞定位和功能性整合到宿主神经系统组织中。此外，在一些情况下，可在通过包埋的细胞群引起的模块化合成水凝胶的降解同时通过包埋细胞群促进引起的细胞外基质蛋白的分泌来促进这种整合。

神经系统修复可能是必需的，例如，创伤(例如，头部损伤)、手术伤口(例如，脑肿瘤切除)、以及植入医疗装置(例如，迷走神经刺激器)。

适用于通过本发明的方法治疗的神经顺序的实例包括但不限于阿尔茨海默氏症、血管性痴呆、帕金森病、亨廷顿病、中风、缺血性中风、出血性中风、视神经疾病、脊髓损伤、周围神经损伤、脱髓鞘疾病、创伤性脑损伤、共济失调或额颞叶痴呆。在一些优选的实施方案中，待治疗的受试对象是患有帕金森病的人受试对象。

在一些实施方案中，待治疗的受试对象受到神经系统组织(例如，脑或脊髓组织)中发生的手术创伤或有与手术并发症相关的其它损伤。

上述每种病症的症状、诊断测试和预后测试是本领域已知的。参见，例如，《哈里森内科学》(Harrison’sPrinciples of Internal.,")第19版，第1卷和第2卷，2015，The McGraw-Hill Companies、Inc.。

如本文所用，术语“受试对象”可以是任何动物。示例性受试对象包括但不限于人、非人灵长类(例如，猕猴、树鼩、黑猩猩)。在一个实施方案中，受试对象是人。

许多动物模型可用于建立本文所述的用于治疗任何前述神经障碍的合成组织的治疗有效剂量范围。例如，已经建立了许多针对帕金森病(Blesa等人，2014)，针对中风(McCabe等人，2018)，针对阿尔茨海默病(Gotz等人，2018)，针对创伤性脑损伤(Hadjigeorgiou等人，2017)的动物模型。

在一些实施方案中，合成组织的治疗有效剂量包括约1×10⁵个细胞至约1×10⁹个细胞的细胞(例如神经元和神经胶质细胞)总数，例如3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、7×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、5×10⁶、8×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、7×10⁷、1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、5×10⁸、7×10⁸，或约1×10⁵个细胞至约1×10⁹个细胞的其它细胞总数。

在一些实施方案中，待施用的合成组织的治疗有效剂量包括约5×10⁵个细胞至约1×10⁷个细胞，例如约3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、7×10⁵、1×10⁶、3×10⁶、5×10⁶、8×10⁶，或约5×10⁵个细胞至约1×10⁷个细胞的其它数目的细胞。

在一些实施方案中，其中提供该合成组织的总给药体积的范围是从约0.2μl至约1000μl，例如，0.2μl、2μl、5μl、7μl、10μl、12μl、20μl、25μl、35μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、700μl、800μl，或从约0.2μl至约1000μl的另一总给药体积。

在一些实施方案中，合成组织以同时(或在短时间段内)施用的多个剂量或以适当的间隔施用，例如在约一天至约七(7)年的时间段内作为两个、三个、四个或更多个剂量。

前述范围仅仅是暗示性的，因为关于个别治疗方案的变量的数目是大的，并且与这些推荐值的相当大的偏差并不罕见。剂量可根据许多变量而改变，不限于待治疗的神经病症、神经系统组织内的给药部位的数目、所施用的细胞类型和本文的合成组织中使用的模块化合成水凝胶的特性。

在优选的实施方案中，合成组织的给药是通过局部给药途径进入中枢或周围神经系统部位。在一些实施方案中将合成组织构建体植入受试对象的脑、脊髓、视神经或周围神经中或邻近受试对象的脑、脊髓、视神经或周围神经。

在一些实施方案中，除了施用本文所述的合成组织之外，对待治疗的受试对象还施用本文的一种或多种外源生长因子、抗体或细胞穿透(CPP)融合蛋白。

用于治疗方法的合成组织

用于本文所述的方法中的合成组织包括在模块化合成水凝胶中在3D中培养的一种或多种神经系统细胞类型或多能细胞的群。

在一些实施方案中，待使用的模块化合成水凝胶包括神经系统细胞类型。用于在这样的模块化合成水凝胶内培养的合适的神经系统细胞类型包括但不限于神经元、神经祖细胞、神经胶质细胞及其任何组合。在一些实施方案中，合成组织包括神经元。

取决于待治疗的具体病症，神经元的合适类型包括但不限于单胺能神经元、儿茶酚胺能神经元、谷氨酸能兴奋神经元、GABA能抑制神经元、运动神经元、胆碱能神经元或其任何组合。在一些优选的实施方案中，特别是在待治疗的受试对象患有帕金森病的情况下，合成组织中的细胞群包括A9亚型中脑腹侧多巴胺能神经元。在一些实施方案中，细胞群包括兴奋性神经元(例如，谷氨酸能神经元)和抑制性神经元(例如，GABA能神经元)。虽然不希望受理论的约束，但在本文所述的合成组织中兴奋性和抑制性神经元的存在被认为促进了功能性回路的形成，功能性回路相对于仅包括兴奋性或抑制性神经元的回路表现出更高的生理水平和活动模式。在一些实施方案中，在兴奋性和抑制性神经元都包括在细胞群中的情况下，它们以预定比率提供在合成组织内。在一些实施方案中，抑制性神经元与兴奋性神经元的比率为约1:20至约1:1，例如1:12、1:8、1:5、1:3、1:2，或抑制性神经元与兴奋性神经元的另一比率为约1:20至约1:1。在一些实施方案中，待施用的合成组织中抑制性神经元与兴奋性神经元的比率为约1:5。

在一些实施方案中，模块化合成水凝胶接种有包括多能神经祖细胞(NPC)或由其组成的细胞群。在一些实施方案中，NPC在给药前在模块化合成水凝胶中培养以促进分化成神经元、星形胶质细胞或其组合。在其它实施方案中，NPC允许在模块化合成水凝胶内增殖，并且是在给药前存在于合成组织中的普遍细胞类型，目的是允许NPC在合成组织给药后在体内发生分化。

包括在用于如本文所述给药的合成组织中的细胞可以作为原代细胞从多种来源获得，包括例如胎儿组织或成人组织。或者，这些细胞可通过多能的或多能细胞类型如诱导性多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞的分化而间接获得。在其它实施方案中，分化细胞也可以通过体细胞的直接谱系重编程获得。

在其它实施方案中，合成组织包括神经胶质细胞。合适类型的神经胶质细胞包括但不限于星形胶质细胞、髓鞘化神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞和Schwaan细胞)或小神经胶质细胞。在一些实施方案中，待施用的合成组织中的细胞群包括髓鞘化神经胶质细胞。在一些实施方案中，将包括髓鞘化神经胶质细胞的合成组织给予患有脊髓损伤或创伤性脑损伤的受试对象。

在一些实施方案中，待施用的合成组织中的细胞群包括神经元和神经胶质细胞两者。在一些实施方案中，合成组织包括预定比例的神经元和神经胶质细胞。神经胶质细胞与神经元的合适比率范围为约7:1至约1:5，例如约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或神经胶质细胞与神经元的另一种比率为约7:1至约1:5。

在一些实施方案中，细胞群进一步包括内皮细胞。虽然不希望受理论的束缚，但认为包括内皮细胞可促进合成组织中的血管生成，从而在体内植入时促进其存活。

具有所需谱系/细胞类型标志物的细胞的细胞分离可通过例如流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)或优选地使用与特异性抗体缀合的微珠的磁性细胞分选来实现。这些细胞可以例如使用磁激活细胞分选(MACS)技术，基于它们结合包括一种或多种特异性抗体例如抗CD56抗体的磁珠(例如直径为约0.5-100μm)的能力来分离颗粒的方法分离。磁性细胞分离可以使用例如AUTOMACS^TM分离器(Miltenyi)进行和自动化。可以对磁性微球进行各种有用的修饰，包括共价加入特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠与细胞混合以允许结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标志物的细胞。在一个实施方案中，然后可以分离这些细胞并与偶联了抗另外的细胞表面标志物的抗体的磁珠再混合。将细胞再次通过磁场，分离结合两种抗体的细胞。

在一些优选的实施方案中，当待施用的合成组织中的细胞群包括神经元时，在一定条件下培养合成组织足够的时间以表现出一种或多种与神经元成熟相关的功能特征。这些功能特性包括但不限于同源神经递质的分泌、生长因子的分泌、成熟神经元蛋白标志物的表达、神经递质受体的表面表达或亚细胞定位、内在电活性和突触连接性。

例如，可以测定成熟的A9成熟中脑多巴胺能神经元的多巴胺分泌、酪氨酸羟化酶的表达、多巴胺转运蛋白(DAT)的表达、转录因子FOXA2的表达、G蛋白调节的钾通道GIRK2的表达、转录因子Nurr1的表达和转录因子LMX1B的表达。

可通过测定谷氨酸转运蛋白(vGlut)转运蛋白、NMDA受体、AMPA受体和谷氨酰胺酶的表达来表征谷氨酸能神经元。GABA能神经元可通过测定GABA转运蛋白、GABA受体、谷氨酸脱羧酶(例如，GAD65或GAD67)的表达来表征。

可以通过测定转录因子HB9和/或胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达来证实运动神经元的身份。

电生理学成熟的特征通常在于在培养期间膜电位逐渐增加，输入电阻降低，这反映了细胞形状和相关树突分枝的增加的复杂性，诱发的和自发的动作电位的发展，以及自发的突触活动，例如AMPA和/或NMDA受体介导的兴奋性突触后电流的存在，和/或抑制性突触后电流。在一些实施方案中，待施用的合成组织的特征在于存在兴奋性和抑制性神经传递。

在一些优选的实施方案中，当要施用特定类型的神经元(例如，多巴胺能神经元)时，可以在确保细胞适于给药之前评估神经元进行同源神经递质的突触释放的能力。例如，多巴胺从培养的多巴胺能神经元的释放或乙酰胆碱从胆碱能神经元的释放可以通过多种标准技术中的任一种来评估，例如，ELISA。在一些实施方案中，合成组织包括分泌同源神经递质的神经元。在一些实施方案中，在合成组织中施用的神经元分泌多巴胺、乙酰胆碱或5-羟色胺。

在一些实施方案中，待施用的合成组织最初接种有包括多能神经祖细胞(NPC)或由其组成的细胞群。在一些实施方案中，NPC在给药前在模块化合成水凝胶中培养以促进分化成神经元、星形胶质细胞或其组合。在其它实施方案中，NPC允许在模块化合成水凝胶内增殖，并且是在给药前存在于合成组织中的普遍细胞类型，目的是允许NPC在给药后在体内发生分化。

在其它实施方案中，待包括在合成组织中的细胞群包括多能细胞。合适的多能细胞包括但不限于间充质干细胞。

在一些实施方案中，包括如上所述的模块化合成水凝胶和细胞群的合成组织在制造后立即施用或在没有培养期的情况下施用以允许细胞成熟/增殖/分化。

在一些实施方案中，在包括如上所述的模块化合成水凝胶和细胞群的合成组织的初始形成之后，将所得合成组织培养一段时间以允许包埋群中的细胞分化、成熟和/或增殖。在一些实施方案中，培养期为约7天至约120天，例如约14天、21天、28天、40天、50天、60天、70天、80天，或另一细胞培养期为约7天至约90天的。在一些优选的实施方案中，将合成组织培养约14天至约60天。本领域技术人员将理解，在合成组织给药之前的合适培养期将基于多种因素来确定，包括但不限于存在于初始细胞群中的神经系统细胞、期望的神经元成熟水平和允许细胞在合成组织内增殖的必要性。例如，当初始(接种)细胞群主要包括将在体外分化的NPC时，所需的培养期将长于用预分化细胞接种时的培养期，因为NPC通常必须经历延长的培养期以获得分化的神经元，并且对于星形胶质细胞甚至更长。已知许多方案，特别是对于人细胞，用于NPC的神经元分化和模式化。参见，例如，Studer等人，(2012)，Shi等人，(2012)；以及对于神经胶质分化，例如，Santos等人，(2017)。

在一些实施方案中，合成组织中的细胞群包括基因修饰的细胞。在一些实施方案中，这样的经基因修饰的细胞表达一种或多种外源蛋白，包括但不限于一种或多种光敏离子通道、化学基因工程蛋白、报告蛋白、光遗传学探针蛋白、生长因子、转录因子、抗体和细胞因子，细胞因子包括促炎和抗炎细胞因子。在其它实施方案中，经基因修饰的细胞表达外源RNA，外源RNA包括例如外泌体mRNA和非编码RNA(例如miRNA)。

在一些实施方案中，待施用的合成组织中的细胞群包括相对于待治疗的受试对象为同种异体的细胞。在其它实施方案中，合成组织中的细胞群包括自体细胞。在其它实施方案中，细胞群包括自体和同种异体细胞。

如本领域普通技术人员将理解的，神经系统中的细胞群经常被发现以特定的空间模式和/或回路分布。例如，哺乳动物新皮质被分成具有不同比例的细胞类型和连接性的六层，细胞类型和连接性是其功能的基础。因此，在一些实施方案中，包埋在如本文所述的模块化合成水凝胶内的细胞群非均匀地分布在模块化合成水凝胶的体积内。在一些实施方案中，在细胞群将非均匀分布的情况下，细胞群具有预定的空间分布。这样的预定空间分布的示例包括但不限于具有不同细胞类型或不同细胞类型比例和/或连接性的细胞的层、簇或同心球。在一些实施方案中，合成组织作为在通过植入给药之前具有预定形状的构建体提供。在一些优选实施方案中，在该方法利用具有预定形状的合成组织的情况下，基于要植入合成组织构建体的宿主组织内部部位的形状来定制该预定形状。在一些实施方案中，合成组织构建体的预定形状是通过3D组织印迹获得的。在一些实施方案中，本文的方法包括对合成组织构建体进行3D组织印迹的步骤。

在其它实施方案中，合成组织以合成组织微粒的形式提供，在本文中也被称为“合成脑微组织珠”(SBM)。在一些实施方案中，这样的组织微粒具有约1μm至约2000μm的直径，例如约1.5μm 10μm、20μm、30μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、1000μm、1200μm、1500μm、1700μm，或从约1μm至约2000μm的另一直径。

在一些实施方案中，当待施用的合成组织以组织微粒的形式提供时，这样的组织微粒包括至少两种不同的微粒群，其在以下特征中的至少一个方面彼此不同：细胞类型、细胞类型的比例、细胞类型的空间分布、水凝胶亚单位材料、连接的肽或多肽、外源生长因子。在一些实施方案中，将这样的具有不同特性的组织微粒的多个群一起施用。在其它实施方案中，在彼此不同的时间点施用组织微粒的多个群，例如以约1天至约2个月的时间间隔，例如，3天、7天、14天、21天、1个月、40天、50天，或约1天至约2个月的另一时间间隔。

根据特定的给药部位、期望的定位以及要治疗的神经病症，在一些实施方案中，合成组织微粒作为水性悬浮液施用，水性悬浮液具有大于100Pa，例如约120Pa至约700Pa，例如约150Pa、200Pa、300Pa、400Pa、500Pa、550Pa、600Pa的粘度，或约120Pa至约700Pa的另一粘度水平。

在一些实施方案中，提供合成组织用于在生物相容性的二次模块化合成水凝胶层内给药。在一些实施方案中，本文的方法还包括在待施用的合成组织周围形成二次模块化合成水凝胶的步骤。通常，二次模块化合成水凝胶层将具有比它所包围的合成组织更低的粘度。虽然不希望受理论束缚，但据信二次模块化合成水凝胶层可减少细胞远离组织给药部位的分散并促进所施用的合成组织在周围宿主神经系统组织内的整合。

模块化合成水凝胶

本文的方法利用了模块化合成水凝胶的优点，如本文指，模块化合成水凝胶是细胞外基质(ECM)激发的聚合物水凝胶，其结合了惰性合成水凝胶聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)与细胞粘合剂和/或细胞可降解肽交联剂，和多官能化连接多肽(例如，聚马来酰亚胺衍生的糖胺聚糖)以形成模块化合成水凝胶。这样的水凝胶提供了对多官能组分的反应性和特异性以及聚合物网络性质(例如，刚度)的精确且独立的控制，如在例如Tsurkan等人(2013)中描述的。这种水凝胶的一个重要优点是，尽管最初为本文方法中使用的细胞提供合适的粘附基底，但它们允许水凝胶支架内连接肽的至少一部分逐步切割。因此，随着时间的推移，沉积到模块化水凝胶中的细胞分泌的ECM增强模块化合成水凝胶的组织模拟的3D网络性质，以促进包埋的细胞群的分化和功能成熟。

水凝胶亚单位材料

用于产生互穿合成水凝胶聚合物的合适的水凝胶亚单位材料包括但不限于聚乙二醇(PEG)、透明质酸、明胶、硫醇改性的透明质酸、丙烯酸酯化的透明质酸、硫醇改性的硫酸软骨素、硫醇改性的明胶、丙烯酸共聚物、聚偏二氟乙烯、壳聚糖、聚氨酯异氰酸酯、聚藻酸盐、乙酸纤维素、聚砜、聚乙烯醇和聚丙烯腈中的一种或多种。在一些实施方案中，模块化合成水凝胶中的水凝胶亚单位材料包括多臂(AKA“星形”)聚合物。在其它实施方案中，模块化合成水凝胶中的水凝胶亚单位材料包括线性、双官能、Y形或叉形聚合物中的任一种。在一些实施方案中，模块化合成水凝胶中的水凝胶亚单位材料包括PEG。在一些实施方案中，模块化合成水凝胶包括starPEG。在其它实施方案中，模块化合成水凝胶包括线性PEG。在其它实施方案中，模块化合成水凝胶中的水凝胶亚单位材料包括透明质酸。

通常，用于产生本文所述方法中使用的模块化合成水凝胶的水凝胶亚单位材料用马来酰亚胺基团或其它官能团官能化以允许在温和条件下通过迈克尔加成反应经由末端硫醇基团与一个或多个第一连接肽缀合，如Tsurkan等人(2013)。所得水凝胶聚合物-肽缀合物可以通过第一连接肽中的含硫醇的半胱氨酸基团与马来酰亚胺官能化的第二连接肽或多肽如马来酰亚胺官能化的糖胺聚糖(GAG)(例如，马来酰亚胺-肝素)进一步反应。

连接肽和多肽

在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用的模块化合成水凝胶包括连接至一种或多种水凝胶亚单位材料(例如，PEG)的一种或多种肽或多肽(“连接肽”)。这样的肽通过它们通过含硫醇的半胱氨酸基团与马来酰亚胺或类似官能团反应以在水凝胶支架材料或已经如本领域已知的用马来酰亚胺衍生化的肽上形成共价连接的能力提供交联功能。此外，这样的肽任选地包括其它官能团，例如细胞粘附和蛋白酶切割位点。

因此，在一些实施方案中，模块化合成水凝胶包括与一种或多种组成水凝胶亚单位材料连接的一种或多种肽。在一些优选的实施方案中，一种或多种连接肽包括至少第一和第二肽或多肽。在一些实施方案中，至少一个连接肽或多肽是酶可切割的。在一些实施方案中，至少一个连接肽或多肽可被金属蛋白酶切割。

在一些实施方案中，第一连接肽包括以下金属蛋白酶切割识别序列：

GPQGIWGQGGCG(SEQ ID NO:1)

其它合适的酶切割识别序列是本领域已知的。虽然不希望受理论的束缚，但认为包括允许交联肽的细胞介导的酶切割的序列促进了驻留细胞形成更像体内的细胞外基质，并促进了它们的分化或成熟。

在一些实施方案中，至少一种连接肽或多肽包括细胞结合序列。合适的细胞结合序列包括层粘连蛋白衍生的细胞结合序列和RGD基序肽。在一些实施方案中，细胞结合序列包括以下氨基酸序列之一：

SIKVAVGWCG(SEQ ID NO:2)

YIGSRGCG(SEQ ID NO:3)

在一些实施方案中，至少一种连接肽或多肽包括可转化的官能团，例如马来酰亚胺基团或硫醇基团。

在一些实施方案中，至少一种连接肽是糖胺聚糖(GAG)。在一些优选的实施方案中，GAG为肝素或肝素衍生物(例如，硫醇改性的肝素)。具有反应性基团如马来酰亚胺或硫醇的连接肽和多肽的官能化(包括区域选择性官能化)是本领域已知的，如描述于例如Tsurkan等人(2013)。

在一些实施方案中，模块化合成水凝胶包括PEG和肝素。在其它实施方案中，模块化合成水凝胶包括PEG和胶原。在其它实施方案中，模块化合成水凝胶包括PEG和透明质酸。在其它实施方案中，模块化合成水凝胶包括PEG以及肝素、胶原和透明质酸的组合

在其它实施方案中，模块化合成水凝胶包括聚藻酸盐和透明质酸盐、肝素和胶原中的至少一种。

在一些实施方案中，基于模块化合成水凝胶的总重量，在模块化合成水凝胶中PEG和肝素、胶原和/或透明质酸的组合浓度为约0.05％(w/w)至约98％(w/w)，例如，0.1％、0.2％、0.4％、0.5％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％的浓度或从约0.05％至约98％的另一浓度(w/w)。在一些优选的实施方案中，当模块化合成水凝胶包括starPEG(或连接肽的肝素)和肝素(或连接肽的肝素)时，starPEG与肝素的摩尔比为约0.5至约1.5，例如，0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1.0、1.2、1.2、1.3或从约0.55至约1.5的starPEG与肝素的另一摩尔比。在一个优选的实施方案中，starPEG与肝素的摩尔比为约0.75至1.0。

本领域技术人员将理解，在模块化合成水凝胶中包埋和培养的细胞，特别是用酶可切割连接肽官能化的细胞，将随着时间分泌细胞外基质，细胞外基质将在给定的培养期间增加总合成水凝胶质量的比例。因此，在一些实施方式中，基于模块化合成水凝胶的总重量，细胞外基质的浓度在约0.05％(w/w)至约98％(w/w)的范围内，例如，0.1％、0.2％、0.4％、0.5％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％或从约0.05％至约98％的另一浓度(w/w)。

用于从模块化合成水凝胶释放的任选试剂

在一些实施方案中，在本文的方法中使用的模块化合成水凝胶不仅充当包埋细胞的仿生支架，而且充当生长因子、抗体、细胞因子或细胞穿透肽(CPP)融合蛋白的释放(例如，控制释放)的载体。

因此，在一些实施方案中，待施用的合成组织还包括一种或多种外源生长因子、抗体或细胞穿透肽(CPP)融合蛋白。本领域已知的生长因子包括生长因子或生长因子样分子，或诱导分化/去分化的分子。用于包括在上述合成组织中的合适的外源生长因子包括但不限于以下一种或多种BDNF、VEGF、IGF1、bFGF/FGF2、Ang1、Ang 2、BMP 2、BMP 3a、BMP 3b、BMP4、BMP 5、BMP 6、BMP 7(OP-1)、CTNF、EGF、EPO、aFGF/FGF1、bFGF/FGF2、G-CSF、GDF10、GDF15、GDNF、GH、GM-CSF、HB-EGF、LIF、NGF、NT-3、NT4/5、骨桥蛋白、PDGFaa、PDGFbb、PDGFab、P1GF、SCF、SDF1/CXCL12和TGFβ。合适的抗体包括但不限于抗α-突触核蛋白、Aβ寡聚体、Tau寡聚体、纤维蛋白和toll样受体(TLR)4中的任一种的抗体。合适的细胞因子包括但不限于显示抑制脑内炎症反应的细胞因子，例如，IL-10、IL-4、IL-6、IL-11、IL-1α、IL-1β、IL-18和IL-13。

在一些实施方案中，合成组织包括CPP-转录因子融合蛋白。特别感兴趣的是CPP-转录因子，其可以将细胞从一个谱系转化为另一个谱系，例如，将神经胶质细胞转化为神经元。参见，例如，Hu等人(2014)，Xu等人(2017)。合适的CPP转录因子包括Ascl1、Brn2、Nurr1、Foxa2、Ngn2、Lmx1a、Pitx3和Otx2中的一种或多种的CPP融合体。适用于产生CPP融合蛋白的各种CPP是本领域已知的，如描述于，例如，Peraro等人(2018)和Kaitsuka等人(2015)。

在其它实施方案中，合成组织还包括一种或多种类型的外源外泌体。用于治疗各种神经病症的合适类型的外源外泌体的实例已经在本领域中举例说明。参见，例如，Xia等人(2019)。

模块化合成水凝胶的产生

将水凝胶前体分子，例如图3所示的缀合半胱氨酸封端的星形-PEG和肝素-马来酰亚胺缀合物溶解在PBS或其它合适的溶液/缓冲液中，并在低温或冰上储存。将冷却的溶液合并并轻轻混合以允许进行凝胶形成。凝胶形成可在数秒至数分钟内发生。可以根据需要调节前体起始溶液的浓度以保持期望的固体含量。起始溶液，混合和随后的处理/分配步骤可以通过手动、半自动或完全自动化的程序来实现。应当理解，机器人可用于例如精确地运行多个步骤并且具有非常小的体积，用于喷雾聚合和3D打印应用，以及用于保持溶液/凝胶无菌性。具体地，可以使用液体处理机器人仪器进行反应，该液体处理机器人仪器能够例如分配、组合和混合和/或分配离散体积的起始材料。如本文所述，另外的材料包括细胞和生物活性分子，例如生长因子、抗体、小分子、细胞穿透肽等。通过确保本领域已知的细胞活力的最佳条件来维持细胞活力。在这方面适当考虑的因素包括pH、温度、气体交换因素、浓度和使用的具体介质。

细胞群可以在分离后培养一段时间并在根据所需的成熟状态选择的条件下培养。例如，可以将细胞培养少于24小时，或最多约4-6个月。在一些实施方案中，在制造微珠之前不培养细胞。不同细胞类型或处于成熟/分化不同阶段的细胞类型的混合物可以一起培养或分开培养。一旦形成合成组织，可根据应用进行进一步的培养/成熟方案。

在一个实施方案中，为了允许施用包括细胞群的合成组织而不损伤已经形成的脆弱组织，以非常小的体积制造它们。合成组织可以产生微珠/微粒的形式，包括约0.2μl体积的微粒。内部微粒可以单独培养或与具有相同或不同组成/形状/尺寸的其它微粒一起培养。

例如，可以将包括细胞群的微粒直接浇铸在组织培养板的底部或其他合适的表面上。

实施例

实施例1-用于治疗帕金森病的合成脑微组织(SBM)的制备和用途

分离后培养人胎儿星形胶质细胞和中脑多巴胺能神经元。在合成脑微组织制备之前，根据制造商的说明书用(Invitrogen)处理培养的细胞以获得单细胞悬浮液，并且收集在细胞分离培养基、Neurobasal^TM培养基中，并且在160-180(170)×g下离心10min。将细胞以8×10⁶细胞/ml的浓度再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以获得细胞-PBS溶液。然后将细胞-PBS溶液与PBS-肝素溶液以1∶1(v/v)比率(“细胞-HEP”溶液)和任选的额外组分(例如细胞因子、生长因子、浓度在0.01nM至10000nM等之间的小分子等)混合。PBS-肝素溶液中的肝素分子用分子量为15,000g/mol的六个马来酰亚胺基团(HEP-HM6)官能化，如Tsurkan等人(2013)所述并且在图2中示意性地示出。通过将在每个臂上具有(总分子量为15,500g/mol)的用酶可切割肽序列官能化的四臂(starPEG)溶解在PBS(“StarPEG缀合物溶液”)中来获得交联溶液。starPEG连接的肽内的含硫醇的半胱氨酸残基可用于通过迈克尔加成与HEP-HM6缀合物上的马来酰亚胺基团反应。通过将细胞-HEP-HM6溶液与StarPEG缀合物溶液混合来引发水凝胶交联。水凝胶基质组分(StarPEG缀合物和HEP-HM6)以约0.75：1的starPEG缀合物：HEP-HM6(对应于交联度为0.75)的摩尔比组合。

在所形成的微组织中，固体物质的总含量应为约4％(不包括细胞)。基于上述方案，根据以下步骤形成0.2μl(0.2微升)体积的微组织：

1.将比例为30：70的IP衍生的人中脑多巴胺能神经元和人iPS衍生的星形胶质细胞以2×10⁶/ml重悬于PBS中。

2.将0.0448mg的HEP-HM6溶于5μl的PBS中。

3.0.0347mg的StarPEG-MPP缀合物溶于10μl的PBS中。

4.将这些溶液混合在一起，并且使用液体处理机器人将约20,000×0.2μl滴快速地排列到疏水性表面(例如，聚乙烯膜)上。水凝胶形成在大约40秒内完成。

5.将水凝胶微珠单独置于384孔培养板中，各孔含有20μl培养基(ScienCellResearch Laboratories，货号1801)，补充有1％生长因子培养基(SRL，货号1852)和1％青霉素/链霉素溶液(SRL，货号0503)。每隔一天饲养细胞/更换培养基。

6.将微珠在37℃，5％CO₂，95％空气中培养21天。

7.在培养期和渐进的细胞介导的水凝胶合成基质分解之后，所得到的“合成脑微组织珠”(“SBMs”)发展出许多独特的特性：约70％(按重量计)的细胞分泌的细胞外基质的组成；约100Pa至约700Pa之间的刚度；存在多于200个的网络，每个网络包括至少三个互连的神经元，并且具有多于5个的分支(通过与其他网络的连接)。

8.将这些SBM汇集并且以1∶1(v/v)比率与starPEG-MMP缀合物和HEP-HM6的溶液混合，这在20μl(10μl的SBM和10μl的starPEG-MMP-HEP-HM6溶液)的总体积中形成具有交联比＝0.2的二次合成水凝胶层。一旦被引入组织，二次水凝胶层帮助组分SBM定位，并且还提供合适的界面基底用于连接性和相互作用以在移植的SBM中的细胞和周围组织中的细胞之间发展，从而促进SBM长期功能整合到宿主脑中。

9.然后将汇集的SBM-二次水凝胶装载到医疗装置(例如，微型注射器)的储器中并且通过立体定位给药降约2μl的SBM-水凝胶以约0.2μl/分钟(Duty和Jenner，2011)的速率递送到麻醉的(6-羟基多巴胺(6-OHDA))大鼠的黑质中。

实验计划和要评估的具体终点

表1

实施例2-用于治疗中风的合成脑微组织(SBM)的制备和用途

分离后培养人胎儿星形胶质细胞。在合成脑微组织制备之前，根据制造商的说明书用(Invitrogen)处理培养的细胞以获得单细胞悬浮液，并且收集在细胞分离培养基、Neurobasal^TM培养基中，并且在160-180×g下离心10min。将细胞以8×10⁶细胞/ml的浓度再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以获得细胞-PBS溶液。然后将细胞-PBS溶液与PBS-透明质酸(HAL)溶液以1∶1(v/v)比例(“细胞-HAL”溶液)和任选的其它组分(例如细胞因子、生长因子或小分子)混合。PBS-HAL溶液中的HAL分子用8个分子量为17,000g/mol的马来酰亚胺基团(HAL-HM8)官能化。通过将在每个端上具有(总分子量为17,000g/mol)的用酶可切割肽序列官能化的线性PEG(“LPEG”)溶解在PBS(“LPEG缀合物溶液”)中来获得交联溶液。PEG连接的肽内的含硫醇的半胱氨酸残基可用于通过迈克尔加成与HAL-HM8缀合物上的马来酰亚胺基团反应。通过将细胞-HAL-HM8溶液与PEG混合来引发水凝胶交联。水凝胶基质组分(LPEG缀合物和HAL-HM8)以约1至2的PEG-缀合物:HAL-HM8的摩尔比组合。

在所形成的微组织中，固体物质的总含量应为约4％(不包括细胞)。基于上述方案，根据以下步骤形成0.2μl体积微组织：

1.将比例为30:70的hiPSC衍生的人神经祖细胞(NPC)和hiPSC衍生的星形胶质细胞以2×10⁶/ml重悬于PBS中。

2.将0.5mg的HAL-HM8溶于10μl的PBS中。

3.0.5mg的LPEG-MPP缀合物溶于10μl的PBS中。

4.将这些溶液混合在一起，并且使用液体处理机器人将约20,000×0.2μl滴快速地排列到疏水性表面(例如，聚乙烯膜)上。水凝胶形成在大约40秒内完成。

5.将水凝胶微珠单独置于384孔培养板中，各孔含有20μl培养基(SRL，货号1801)，补充有1％生长因子培养基(SRL，货号1852)和1％青霉素/链霉素溶液(SRL，货号0503)。每隔一天饲养细胞/更换培养基。

6.将微珠在37℃，5％CO₂，95％空气中培养30天。

7.在培养期和渐进的细胞介导的水凝胶合成基质分解之后，所得到的“合成脑微组织珠”(“SBMs”)发展出许多独特的特性：约70％(按重量计)的细胞分泌的细胞外基质的组成；约100Pa至约3000Pa之间的刚度；存在多于200个的网络，每个网络具有多于5个的分支(通过与其他网络的连接)；和超过12,000个不同的神经投影。

8.将这些SBM汇集并且以1:1(v/v)比率与LPEG-MMP缀合物和HAL-HM8的溶液混合，这在20μl(10μl的SBM和10μl的LPEG-MMP-HAL-HM8溶液)的总体积中形成具有交联比＝0.2的二次合成水凝胶层。一旦引入到体内组织中，二次水凝胶层帮助定位组分SBM，并且还提供合适的界面基底以在移植的SBM中的细胞与周围组织中的宿主细胞之间建立连接性和相互作用，从而促进SBM长期功能性整合到宿主脑中。

9.然后将汇集的SBM-二次水凝胶装载到医疗注射装置(例如，微型注射器)的储器中，并且通过立体位给药将约2μl的SBM-水凝胶递送到麻醉小鼠的皮质中，通过如在(Yu等人，2015)的光致变色中风模型中描述的，在该麻醉小鼠中诱导缺血性中风。

10.将SBM-水凝胶注射到在光诱导的缺血性血块周围产生的坏死脑区域中。

实验计划和要评估的具体终点的汇总表

本领域技术人员将理解，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如具体实施例中所示的本发明做出许多变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

本申请要求2018年10月26日提交的AU 2018904068的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

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包括在本说明书中的文件、动作、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了提供本发明的上下文。不应视为承认这些内容中的任何或全部形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其存在于本申请的每个权利要求的优先权日之前。

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序列表

<110> 特萨拉治疗私人有限公司

<120> 神经系统细胞疗法

<130> 529045PCT

<140> AU

<141> 2019-10-25

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金属蛋白酶切割位点1

<400> 1

Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Gly Gly Cys Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金属蛋白酶切割位点2

<400> 2

Ser Ile Lys Val Ala Val Gly Trp Cys Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 金属蛋白酶切割位点3

<400> 3

Tyr Ile Gly Ser Arg Gly Cys Gly

1 5