具体实施方式

在本说明书中，碳纳米材料包含碳纳米金刚石、碳纳米点。

纳米簇的制造所使用的碳纳米材料用高级烷基或高级烯基进行了修饰。有时将用这些官能团进行了修饰的碳纳米材料记载为“修饰碳纳米材料”。

本发明的修饰碳纳米材料包含0.0001～30质量％左右、优选包含0.001～20质量％左右、优选包含0.01～15质量％左右、优选包含0.05～10质量％左右的高级烷基或高级烯基。

高级烷基或高级烯基通过2价的连接基团连接于碳纳米材料。作为2价的连接基团，可以列举：-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、-NH-CO-NH-。

作为高级烷基，可以列举：己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、异十六烷基、十七烷基、十八烷基、异十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等直链或具有支链的C₆-C₂₄烷基，优选可以列举C₈-C₁₈烷基，更优选可以列举C₈-C₁₄烷基，进一步优选可以列举C₁₀-C₁₄烷基。

作为高级烯基，可以列举：己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基(棕榈油基)、异十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基(油烯基、Ole)、异十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基等直链或具有支链的C₆-C₂₄烯基，优选可以列举C₈-C₁₈烯基，更优选可以列举C₁₂-C₁₈烯基，进一步优选可以列举C₁₄-C₁₈烯基。

本发明的纳米簇的制造所使用的碳纳米材料可以进一步用聚亚烷基二醇进行了修饰。作为聚亚烷基二醇，可以列举：聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、聚乙二醇-聚丙二醇嵌段共聚物等。

利用高级烷基和/或高级烯基和聚亚烷基二醇进行的修饰前的碳纳米材料的初级粒子的平均粒径优选为10nm以下，更优选为1～10nm。

利用高级烷基和/或高级烯基、和聚亚烷基二醇进行了的修饰的碳纳米材料的初级粒子的平均粒径优选为12nm以下，更优选为1～12nm，进一步优选为3～12nm。

修饰前或修饰后的碳纳米材料的初级粒子的平均粒径可以通过动态光散射法进行测定，可以使用X射线衍射装置(商品名“S mart Lab”，Rigaku公司制)通过小角X射线散射测定(SAXS法)来确定。

本发明的纳米簇的制造所使用的碳纳米材料优选使用在表面具有大量OH、COOH、NH₂等官能团的碳纳米材料(以下，有时记载为“CNM”)。在表面具有大量OH、COOH、NH₂等基团的碳纳米材料是公知的，使用这样的材料、按照以下的路线图(1)～(10)，可以得到用高级烷基或高级烯基进行了修饰的碳纳米材料。

路线图

[化学式1]

[化学式2]

(式中，X表示Cl、Br或I。CNM表示碳纳米材料。n1表示1以上的整数。n2表示0以上的整数。R表示高级烷基或高级烯基。)

上述路线图(1)～(10)的反应可以按照通常方法进行，对于具有OH、NH₂或COOH的表面基团的碳纳米材料1g，使用1mg～过量的R-COX、R-NH₂、R-OH、R-X中的任意化合物，在0℃～溶剂沸腾的温度下反应1～24小时，由此可以得到目标产物。作为溶剂，可以列举：氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等卤代烃、甲苯等芳香族烃、四氢呋喃、乙醚、二异丙醚等。

经上述路线图(1)～(10)得到的化合物(Ia)～(Ij)可以进一步通过使未反应的各官能团(OH、COOH、NH₂)与聚亚烷基二醇化试剂(R²-Y²-X²；这里，R²表示包含聚亚烷基二醇部分的基团，Y²表示单键或2价的间隔基团，X²表示NH₂、OH、COOH、N-羟基琥珀酰亚胺)反应而以聚亚烷基二醇进行修饰。作为2价的间隔基团，可以列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚苯基(1,2-、1,3-、1,4-)、-CH₂CH₂O-、-CH₂CH₂CH₂O-、-CH₂CH₂CH₂CH₂O-、-CH₂CH₂NH-、-CH₂CH₂CH₂NH-、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH-、-CH₂CH₂CONH-、-CH₂CH₂CH₂CONH-、-CH₂CH₂CH₂CH₂CONH-、-CH₂CH₂NHCO-、-CH₂CH₂CH₂NHCO-、-CH₂CH₂CH₂CH₂NHCO-、-CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂COO-、-CH₂CH₂CH₂COO-、-CH₂CH₂CH₂CH₂COO-、-CH₂CH₂OCO-、-CH₂CH₂CH₂OCO-、-CH₂CH₂CH₂CH₂OCO-等，可列举这些间隔基团中的单独1种、或者将2种以上组合而成的基团。在导入聚亚烷基二醇的反应中，相对于化合物(Ia)～(Ij)1g，使用100mg～过量的聚亚烷基二醇化试剂，在0℃～溶剂沸腾的温度下反应1～24小时，由此可以得到目标的碳纳米材料，所述目标的碳纳米材料是用高级烷基和/或高级烯基进行了修饰、并且用聚亚烷基二醇进行了修饰的碳纳米材料。作为溶剂，可以列举：氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等卤代烃、甲苯等芳香族烃、四氢呋喃、乙醚、二异丙醚等。

本发明的纳米簇可以通过将用高级烷基和/或高级烯基、并根据需要进一步用聚亚烷基二醇基进行了修饰的碳纳米材料悬浮于水或缓冲液等适当的水性介质、并进行超声波照射，从而进行自组装而制作。在超声波照射后，可以通过离心分离等纯化操作去除未形成团簇的未反应的官能团修饰碳纳米材料，从而将自组装纳米簇分离。

本发明的纳米簇可以通过悬浮于包含有效成分的适当溶剂中而与有效成分进行复合。有效成分存在于纳米簇的表面或内部。作为有效成分，可以列举：生理活性物质、标记物质、精油、香料、有机色素等。

作为标记物质，可以列举：荧光素、俄勒冈绿(Oregon Green)、曙红、赤藓红等荧光素类；四甲基罗丹明衍生物、德克萨斯红衍生物、罗丹明B碱性、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G等罗丹明类；香豆素类；丹酰型(二甲基氨基萘磺酸型)荧光色素；NBD型色素；芘；R-藻红蛋白、藻蓝蛋白(phlophycocyanin)、别藻蓝蛋白等藻胆蛋白；BODIPY衍生物；Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5等Cy(注册商标)色素；Alexa Fluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、680、700、750等Alexa(注册商标)Fluor等。这些标记物质可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为精油，可以列举：甜橙、苦橙、苦橙叶(petitgrain)、柠檬、葡萄柚、酸橙、佛手柑、橘、橙花、薄荷、留兰香、薰衣草、洋甘菊、迷迭香、桉树、鼠尾草、罗勒、玫瑰、天竺葵、茉莉花、依兰、茴芹、茴香、八角茴香、丁香、肉桂、姜、肉豆蔻、小豆蔻、蛇麻草、日本雪松、柏树、香根草、广藿香(patchouli)、赖百当(labdanum)等，这些精油可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为香料的成分，可以列举：l-薄荷醇、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、莰烯、柠檬烯等单萜烯、巴伦西亚橘烯、雪松烯、石竹烯、长叶烯等倍半萜烯、1,3,5-十一碳三烯、丁醇、戊醇、异戊醇、己醇、异戊烯醇、(Z)-3-己烯-1-醇、2,6-壬二烯醇、芳樟醇、香叶醇、香茅醇、四氢月桂烯醇、法呢醇、橙花叔醇、雪松醇、苯甲醇、苯乙醇、糠醇、乙醛、异戊醛、己醛、辛酸、壬醛、癸醛、(E)-2-己烯醛、2,4-辛二烯醛、香茅醛、柠檬醛、苯甲醛、肉桂醛、香草醛、乙基香草醛、糠醛、胡椒醛、2-庚酮、2-十一烷酮、1-辛烯-3-酮、乙偶姻、二乙酰、2,3-戊二酮、麦芽酚、乙基麦芽酚、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮、羟基酮、香芹酮、薄荷酮、诺卡酮等萜烯酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、β-大马酮、树莓酮酮、玫瑰醚(rose oxide)、芳樟醇氧化物、薄荷呋喃、茶螺烷、甲基胡椒酚、茴香烯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸熏衣草酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸苄酯、水杨酸甲酯、γ-癸内酯、γ-十二内酯、δ-癸内酯、δ-十二内酯、7-癸烯-4-内酯、2-癸烯-5-内酯、丁酸、4-甲基-3-戊烯酸、辛酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、吲哚、粪臭素、吡啶、烷基取代吡嗪、邻氨基苯甲酸甲酯、甲硫醇、糠基硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、二糠基二硫醚、异硫氰酸烯丙酯等，这些香料可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为有机色素，可以列举：胭脂树橙色素、胭脂虫红色素、红曲霉色素、β-胡萝卜素、木槿色素、硫化黄、可可色素、核黄素、叶绿素、焦糖、胭脂树橙、胭脂红、虫胶酸、巴西红木红、藏红花素、紫草素、紫苏素、芦丁等。

与有效成分复合化后的本发明的纳米簇，在对哺乳动物(人、小鼠、大鼠、仓鼠、马、牛、猪、山羊、绵羊、兔、犬、猫等)的生物体内或皮肤给药或适用时，会缓慢地释放出有效成分。因此，与有效成分复合化后的本发明的纳米簇作为医药品或药物组合物、化妆品、口腔用组合物是有用的。作为化妆品，可以列举：粉底、扑面粉、润肤乳、乳液、口红、化妆水、美容液、按摩霜、保湿霜、面膜、洗面奶、洗发水、护发素、养发剂、身体粉等。作为口腔用组合物，可以列举：漱口药、漱口水、牙膏、牙粉、口香糖、饴糖、软糖、汽水糖等。作为医药品的剂型，可以列举：片剂、胶囊剂、含片剂、丸剂、咀嚼片、注射剂、栓剂、糖浆剂、软膏剂、硬膏剂等。另外，本发明的纳米簇会缓慢地释放出有效成分，因此作为有效成分的递送载体是有用的。

生理活性物质包含药物、核酸、蛋白质。作为药物，可以列举：抗肿瘤剂、抗高血压剂、抗低血压剂、抗精神病剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗躁狂剂、抗焦虑剂、镇静剂、催眠剂、抗癫痫剂、阿片激动剂(opioid agonist)、哮喘治疗剂、麻醉剂、抗心律不齐剂、关节炎治疗剂、抗痉挛剂、ACE抑制剂、减充血剂、抗生素、抗心绞痛剂、利尿剂、抗帕金森氏病剂、支气管扩张剂、抗利尿剂、利尿剂、抗高血脂剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、止吐剂、抗感染剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病剂、抗过敏剂、解热剂、抗痛风剂、抗组胺剂、止痒剂、骨调节剂、心血管剂、降胆固醇剂、抗疟疾剂、止咳剂、祛痰剂、粘液溶解剂、鼻塞用药剂、多巴胺激动剂、消化道用药剂、肌肉松弛剂、神经肌肉阻滞剂、副交感神经激动剂、前列腺素、兴奋剂、食欲抑制剂、甲状腺剂或抗甲状腺剂、激素、抗偏头痛剂、抗肥胖剂、抗炎剂等。优选的药物为抗肿瘤剂。作为抗肿瘤剂，可以列举：激素治疗剂(例如，磷雌酚、己烯雌酚、氯烯雌醚(chlorotrianserine)、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、美帕曲星、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗雌激素(例如，枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬等)、口服避孕药制剂、美雄烷、二氢睾内酯、氨鲁米特、LH-RH激动剂(例如，醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、乙炔雌二醇磺酸酯、芳香化酶抑制剂(例如，盐酸法倔唑、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏罗唑、福美司坦等)、抗雄激素(例如，氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制剂(例如，非那雄胺、爱普列特等)、肾上腺皮质激素类药剂(例如，地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙等)、雄激素合成抑制剂(例如，阿比特龙等)、类视黄醇及延缓类视黄醇代谢的药剂(例如，利阿唑等)等，其中，可以列举：LH-RH激动剂(例如，醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等))、烷化剂(例如，氮芥、氮芥N-氧化物盐酸盐(nitrogen mustard N-oxide hydrochloride)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替哌、卡波醌、甲磺英丙舒凡、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、米尔法兰、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、曲他胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、溴丙哌嗪、依托格鲁、卡铂、顺铂、米帕、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵(dibrospidium hydrochloride)、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、替莫唑胺、曲奥舒凡、曲磷胺、净司他丁苯马聚合物、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)、比折来新)、代谢拮抗剂(例如，巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、依诺他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytarabineocfosphate)、盐酸环胞苷、5-FU类药剂(例如，氟尿嘧啶、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨、乙嘧替氟等)、氨基喋呤、亚叶酸钙(calcium leucovorin)、硫鸟嘌呤(tabloid)、甘氨硫嘌呤(butocin)、甲酰四氢叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、噻唑羧胺核苷、氨莫司汀)、抗癌抗生素(例如，放线菌素D、放线菌素C、丝裂霉素C、色霉素A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光辉霉素、肉瘤霉素(sarkomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星)、植物来源的抗癌剂(例如，依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊甙、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、喜树碱、盐酸伊立替康)、免疫治疗剂(BRM)(例如，溶链菌(picibanil)、云芝多糖(krestin)、裂裥多糖、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴毒素、BCG疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、云芝多糖(polysaccharide)K、丙考达唑)、抑制细胞生长因子及其受体的作用的药剂(例如，曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin)(商标)；抗HER2抗体)、ZD1839(易瑞沙)、格列卫(GLEEVEC)等抗体药物)。作为成为抗肿瘤剂的对象的癌的种类，可以列举：结肠/直肠癌、肝癌、肾癌、头颈癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆囊/胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、骨骼/软组织肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑瘤等，优选可以列举：结肠/直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌、肝癌。

作为核酸，没有特别限制，可以是DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂合体等中的任意核酸。另外，核酸可以使用1～3链中的任意核酸，优选为单链或双链。核酸可以是作为嘌呤碱或嘧啶碱的N-糖苷的其它类型核苷酸、或者具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如，市售的肽核酸(PNA)等)或含有特殊键的其它低聚物(其中，该低聚物含有核苷酸，所述核苷酸具有允许存在可在DNA、RNA中观察到的碱基对、碱基附着的配置)等。进一步，可以是被附加了公知的修饰的核酸，例如具有该领域已知的标记的核酸、加帽的核酸、甲基化的核酸、用类似物取代1个以上天然核苷酸而得到的核酸、进行了分子内核苷酸修饰的核酸、例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有带电荷的键或含硫键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、例如蛋白质(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽等)、糖(例如，单糖等)等具有侧链基团的核酸、具有插层化合物(例如，吖啶、补骨脂素等)的核酸、含有螯合物(例如，金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)的核酸、含有烷化剂的核酸、具有经修饰的键的核酸(例如，α异头型的核酸等)。作为优选的核酸，可以举出siRNA等RNA。

siRNA是指由与靶基因的mRNA、或初始转录产物的核苷酸序列或其部分序列(优选为编码区域内)(初始转录产物的情况下包含内含子部分)同源的核苷酸序列和其互补链形成的双链寡RNA。siRNA中包含的与靶核苷酸序列同源的部分的长度通常约为18个碱基以上、例如为约20个碱基左右(代表性地为约21～23个碱基长度)的长度，只要可以引起RNA干扰则没有特别限定。另外，siRNA的全长也通常约为18个碱基以上、例如为约20个碱基左右(代表性地为约21～23个碱基长度)的长度，只要可以引起RNA干扰则没有特别限定。

关于靶核苷酸序列与siRNA中包含的与其同源的序列的关系，可以100％一致，也可以有碱基的突变(可以是至少70％、优选80％、更优选90％、最优选95％以上的同一性的范围内)。

siRNA可以在5’或3’末端具有由5个碱基以下、优选由2个碱基构成的、未形成碱基对的添加的碱基。该添加的碱基可以是DNA也可以是RNA，在使用DNA时，可以提高siRNA的稳定性。作为这样的添加的碱基的序列，可以列举例如：ug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等序列，但并不限定于此。

siRNA可以是相对于任意的靶基因的siRNA。siRNA优选为其表达增加以与对象疾病的发病和/或恶化相关的基因作为标靶的siRNA，更具体而言，可以举出相对于该基因的反义核酸以进行到了临床阶段或临床前阶段的基因、新发现的基因作为标靶的siRNA等。

siRNA可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

作为蛋白质，可以列举：酶、受体、抗体、抗原、干扰素、白细胞介素等细胞因子等。

本发明的纳米簇的平均粒径为1～1000nm左右，优选为3～800nm左右，更优选为5～500nm左右，进一步优选为10～300nm左右，特别为30～250nm左右。

作为纳米簇的ζ电位，优选为5～30mV左右，更优选为10～25mV左右。

在本发明的纳米簇与有效成分进行了复合的情况下，相对于纳米簇100质量份，包含5～50质量份左右、优选包含10～20质量份左右的有效成分。

实施例

以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1

＜实验方法＞

1.充分利用了羧基化纳米金刚石的超粒子复合体的合成

羧基化纳米金刚石(NDc)(粒径：4-5nm)按照日本特开2017-202940或日本特开2016-113333的记载、通过爆轰法而制备。合成的NDc通过硝酸进行纯化，在氢气氛围下进行烧制。利用有机元素分析装置(Micro Corder JM10；J-Science Lab Co.,Ltd,Kyoto,Japan)进行了NDc的元素分析，结果可知C(86.92％)、H(0.44％)、N(2.29％)。利用珠磨机(Sand Grinder LSG-4U；Aimex Co.,Ltd,Tokyo,Japan)使纯化后的NDc分散在蒸馏水中。接着，将NDc分散水溶液进行离心分离，将不溶于水的ND除去。将得到的上清溶液(NDc-ori)用于随后的实验。将1ml的NDc-ori分散水溶液(ND浓度＝56mg ml^-1)、任意的末端氨基化烷基分子(50μl的正辛胺(Oct(C8))、50μl的油胺(Ole(C18))、10mg的十二胺(Dod(C12))(均从FUJIFILM Wako Pure Chemical,Osaka,Japan购入))、10mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC)(FUJIFILM Wako Pure Chemical)加入9ml的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)缓冲液(pH6.0、100mM)，使用槽式超声波照射装置(输出功率＝80W、振荡频率＝40kHz)(USD-2R；AS ONE,Osaka,Japan)照射了5分钟。在室温下利用搅拌器剧烈搅拌1.5小时后，对混合物进行离心分离，用Milli-Q水清洗3次。将10ml的Milli-Q水加入至通过离心分离得到的沉淀物，通过使用脉冲型超声波照射装置(VCX-600；Sonics,Danbury,CT,USA)照射10分钟超声波，使其再分散。将该羧基化纳米金刚石超粒子(NDc-SP)分散液用于随后的实验。得到的羧基化纳米金刚石超粒子(NDc-SP)分散液为Oct(C8)-NDc-SP、Dod(C12)-NDc-SP、Ole(C18)-NDc-SP这3种，它们均构成了纳米簇(图2(b)、图2(c))。通过紫外-可见光-近红外分光光度计(V-730BIO；Jasco,Tokyo,Japan)确定了最终产物中的ND浓度为约5.6mg ml^-1。另外，通过热重分析(Q 500；TA Instruments,New Castle,DE,USA)确定了NDc-SP(团簇)中的Oct(C8)、Dod(C12)、Ole(C18)分别为约13％w/w、约17％w/w、约35％w/w。

[email protected](C8)-NDc-SP和[email protected](C12)-NDc-SP复合体通过以下的方法进行制备。将由通过离心分离进行了清洗的Oct(C8)-NDc-SP或Dod(C12)-NDc-SP构成的沉淀物与10mg的CPT(FUJIFILM Wako Pure Chemical)在10ml的Milli-Q水中混合，照射了10分钟脉冲超声波。[email protected]通过将10mg的CPT、1ml的NDc-or水溶液、9ml的Milli-Q水混合并照射10分钟脉冲超声波而制备。[email protected](C8)-NDc-SP和[email protected](C12)-NDc-SP复合体均构成了纳米簇(图4(b)、图4(c)、图4(d))。[email protected]、[email protected]、[email protected]是使用56mg的聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMEM)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)、56mg的pluronicF127(F127)(FUJIFILM Wako Pure Chemical)、或56mg的N-(氨丙基聚乙二醇)氨基甲酰基二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)(Sunbright DSPE-020PA；Yuka Sangyo,Tokyo,Japan)来代替ND沉淀物，通过同样的方法制备的。

2.充分利用了氨基化纳米金刚石的超粒子复合体的合成

氨基化纳米金刚石(NDa)(粒径：4-5nm)按照已知的制备方法合成(V.V.Danilenko,Combust.,Explos.Shock Waves 2005,41,577；V.Y.Dolmatov,J.Superhard Mater.2008,30,233；V.Y.Dolmatov,V.Myllymaki and A.Vehanen,J.Superhard Mater.2013,35,143.)。将合成的NDa用硝酸纯化，在氢气氛围下进行烧制。NDa的元素分析[含量为C(92.20％)、H(0.74％)及N(2.30％)]通过有机元素分析装置(Micro Corder JM10；J-Science Lab Co.,Ltd,Kyoto,Japan)进行了分析。利用珠磨机(Sand Grinder LSG-4U；Aimex Co.,Ltd,Tokyo,Japan)使纯化后的NDa分散在蒸馏水中。接着，对该NDa分散液进行离心，将不溶于水的ND除去。将得到的上清分散液(NDa-ori)用于随后的实验。使用槽式超声波照射装置(输出功率：80W、振荡频率：40kHz)(USD-2R；AS ONE,Osaka,Japan)在9ml的MES缓冲液(pH6.0,100mM)中对1ml的NDa-ori分散液(ND浓度＝30mgml^-1)、10mg的羧基封端烷基链(辛酸钠(NaOc(C8))、月桂酸钠(NaLA(C12))、或油酸钠(NaOle(C18))(均从FUJIFILM Wako Pure Chemical购入)、10mg的WSC进行5分钟超声波照射，从而使其溶解。将该混合物在室温下用搅拌器进一步剧烈搅拌1.5小时后，使用离心分离用Mill-Q水清洗3次，去除了未反应物质。通过使用脉冲型超声波照射装置对由离心分离得到的颗粒照射10分钟超声波，使其再分散于10ml的Mill-Q水。得到的氨基化纳米金刚石超粒子(NDa-SP)分散液为NaOc(C8)-NDa-SP、NaLA(C12)-NDa-SP、NaOle(C18)-NDa-SP这3种，它们均构成了纳米簇(图6(c)、图6(d))。

将该NDa-SP分散液用于后续的实验。另外，NDa-SP分散液中的ND浓度(～3mg ml^-1)通过UV-Vis-NIR分光光度计进行了测定した(图7(a))。另外，NDa-SP中的NaOc(C8)(～8％w/w)、NaLA(C12)(～17％w/w)、NaOle(C18)(～24％w/w)使用热重分析(TGA)(Q 500；TAInstruments,New Castle,DE,USA)进行了估算。

ND表面上的氨基使用Kaiser test kit(60017-1EA；Sigma-Aldrich)、按照已知的方法(Yue Yu et al.Nanoscale 10,8969-8978(2018).)进行了定量(图7(c))。

各种NDa-SP的表面张力通过Mitsui Chemical Analysis&Consulting Service(Tokyo,Japan)、使用表面张力仪(CBVP-Z；Kyowa Interface Science Co.)进行了测定(图7(c))。

PEG修饰的NDa-SP(PEG-NDa-SP)通过以下方法合成(图8)。将1ml的MES缓冲液(pH6.0、500mM)加入10ml的NaOc(C8)-NDa-SP水溶液或10ml的NaLA(C12)-NDa-SP。进行离心分离(15000rpm、10分钟)，小心地去除透明的上清溶液。接着，向离心分离后的颗粒中加入包含20mg的α-琥珀酰亚胺氧基戊二酰基-ω-甲氧基聚氧乙烯(α-succinimidyloxyglutaryl-ω-methoxy,polyoxyethylene)(SUNBRIGHT ME-050GS；Yuka Sangyo,Tokyo,Japan)(050GS)或20mg的六聚甘油八(琥珀酰亚胺氧基戊二酰基)聚氧乙烯(hexaglycerol octa(succinimidyloxyglutaryl)polyoxyethylene)(8-ArmPEG-SCM；Funakoshi,Tokyo,Japan)(8Arm)的5ml的DMSO(FUJIFILM Wako Pure Chemical)。将混合物进行30分钟超声波照射后，在室温下剧烈搅拌过夜。最后，将1ml的MES缓冲液(pH6.0、100mM)加入反应液，通过Milli-Q水和离心分离清洗3次。通过在10ml的Milli-Q水中对得到的颗粒照射10分钟脉冲超声波，使其再分散。将合成的050GS包覆NaOc(C8)-NDa-SP(050GS-NaOc(C8)-NDa-SP)水溶液(ND浓度：～3mg ml^-1)和8Arm包覆NaLA(C12)-NDa-SP(8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP)(ND浓度：～3mg ml^-1)用于随后的实验。它们构成了纳米簇(图10(b)、图11(a)、图11(b))

[email protected](C8)-NDa-SP和[email protected](C12)-NDa-SP复合体通过以下的方法制备。向通过离心分离进行了清洗的050GS-NaOc(C8)-NDa-SP或8Arm-NaLA(C12)-NDa-SP的颗粒中加入包含10mg紫杉醇(PTX)(FUJIFILM Wako Pure Chemical)的10ml的Milli-Q水，照射10分钟脉冲超声波。直到使用前，对得到的混合物在4℃下进行了保存。Abraxane从Taiho Pharmaceutical公司购入，未实施化学修饰等处理而直接用于实验。它们构成了纳米簇(图10(b)、图11(a)、图11(b))。

3.ND-SP的物性分析

合成的ND-SP的结构及形态使用高分辨率透射电子显微镜(TEM)(加速电压：120kV)(EM-002B；Topcon,Tokyo,Japan)进行了分析(图2(c)、图6(c)、图6(d)、图11(a))。

ND-SP的粒径(流体力学直径)通过动态光散射法(DLS)(Photal FPAR-1000；Otsuka Electronics,Osaka,Japan)求出(图2(b)、图6(b)、图10(b))。

ND-SP的分光学分析及ND-SP复合体中的ND、CPT、PTX浓度通过紫外-可见光-近红外分光光度计(V-730BIO；Jasco,Tokyo,Japan)进行了估算(图2(a)、图3(a)、图4(b)、图6(a)、图7(a)、图7(b)、图9(a)、图9(b)、图10(a)、图10(c)、图11(b))。

4.细胞培养和细胞毒性评价

人骨肉瘤细胞(U2OS)、人卵巢腺瘤细胞(SKOV3)、人正常二倍体成纤维细胞(TIG3)由日本研究生物资源收藏细胞库(the Japanese Collection of ResearCHBioresourcesCell Bank(Tokyo,Japan))获得，在包含10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、庆大霉素、青霉素-链霉素(100IU ml^-1)、Hank’s平衡盐溶液(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)的杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Gibco,Grand Island,NY,USA)中进行了培养。细胞在37℃、5％的CO₂气体氛围下的加湿室中进行了培养。

细胞生存率使用结晶紫染色(FUJIFILM Wako Pure Chemical)和Cell CountingKit(CCK)-8(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)并按照它们的手册进行了评价。将细胞接种于96孔板(5×10³细胞孔^-1)，温育过夜。接着，使细胞暴露于药物或纳米复合体分散溶液中，用新鲜的培养液进行清洗后，在CCK-8溶液中温育。最后，通过用酶标仪(Infinite M200 PRO；Tecan,Mannedorf,Switzerland)测定450nm的吸光度，计算出细胞生存比例(图4(a)、图4(c)、图4(d)、图7(d)、图12(a)、图12(b)、图12(c))。

5.血液检查

全血细胞计数(CBC)及生化参数由Japan SLC和Oriental Yeast Co.(Tokyo,Japan)测定。具体而言，从尾静脉对10周龄的雌的BALB/cSlc小鼠(n＝5；平均体重＝21g；Japan SLC)给药200μl的各种样品[包含ND-SP的无菌水(NDc-SP：1.12mg kg^-1；NDa-SP：30mgkg^-1)、PBS缓冲液或无菌水]。在给药纳米复合体后4周后采集了血液样品(表1～4)。

6.数据的统计分析

数据中的±表示标准偏差，n表示使用的样品数。数据的统计分析使用了Student氏t检验(Student’s t-test)。*、**、***分别表示<0.05、<0.005、<0.001的p值。

[表1]

注射PBS或Dod(C12)-NDc-SP四周后的小鼠的血液检查结果

[表2]

注射PBS或Dod(C12)-NDc-SP四周后的小鼠的生化检查结果

缩写符号：WBC，白细胞；RBC，红细胞；HGB，血红蛋白；HCT，血细胞比容；MCV，平均细胞体积；MCH，平均细胞血红蛋白量；MCHC，平均细胞血红蛋白浓度；PLT，血小板；CRP，C-反应蛋白；TP，总蛋白；ALB，白蛋白；BUN，血尿素氮；CRE，肌酐；AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；LDH，乳酸脱氢酶；AMY，淀粉酶；CK，肌酸激酶。

在对小鼠的尾静脉给药Dod(C12)-NDc-SP分散液或PBS后，考察了4周后的全血细胞计数(CBC)及生化参数，结果是没有在样品之间观察到有意义的差异。该结果表明Dod(C12)-NDc-SP具有很高的生物体适应性。

[表3]

注射PBS或PEG-NDa-SP四周后的小鼠的血液检查结果

[表4]

注射PBS或PEG-NDa-SP四周后的小鼠的生化检查结果

缩写符号：WBC，白细胞；RBC，红细胞；HGB，血红蛋白；HCT，血细胞比容；MCV，平均细胞体积；MCH，平均细胞血红蛋白量；MCHC，平均细胞血红蛋白浓度；PLT，血小板；CRP，C-反应蛋白；TP，总蛋白；ALB，白蛋白；BUN，血尿素氮；CRE，肌酐；AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；LDH，乳酸脱氢酶；AMY，淀粉酶；CK，肌酸激酶。

在对小鼠的尾静脉给药分散有PEG-NDc-SP的无菌水或仅给药无菌水之后，考察了4周后的全血细胞计数(CBC)及生化参数，结果是没有在样品之间观察到有意义的差异。该结果表明PEG-NDc-SP具有很高的生物体适应性。