阅读说明：本技术 一种利用贻贝蒸煮液制备液体蛋白肥的方法 (method for preparing liquid protein fertilizer by using mussel cooking liquor ) 是由 王阳光 欧阳小琨 王南 杨立业 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及肥料制备技术领域,针对贻贝蒸煮液中重金属含量超标无法利用的问题,提供一种利用贻贝蒸煮液制备液体蛋白肥的方法,包括以下步骤：1)将蛋白酶和改性壳聚糖按(0.5-2.5):1的质量比加入水中,加热反应后过滤得到处理剂；2)将贻贝蒸煮液和处理剂按(1-1.5):1的质量比混合,pH 6-8,30-50℃下搅拌反应6-10 h,结束后得酶解液；3)将酶解液在70-90℃、1500-2500 r/min搅拌条件下反应4-7 h,离心得液体蛋白肥。本发明的改性壳聚糖既能作为蛋白酶的载体增大酶解反应的反应面积,提高酶解效率,还能吸收重金属,得到重金属含量极低的液体蛋白肥。(The invention relates to the technical field of fertilizer preparation, and provides methods for preparing liquid protein fertilizer by using mussel cooking liquor, aiming at the problem that the heavy metal content in the mussel cooking liquor exceeds the standard and cannot be utilized, which comprises the following steps of 1) adding protease and modified chitosan into water according to the mass ratio of (0.5-2.5) to 1, heating for reaction and filtering to obtain a treating agent, 2) mixing the mussel cooking liquor and the treating agent according to the mass ratio of (1-1.5) to 1, stirring for reaction at the temperature of 6-8 and 30-50 ℃ for 6-10 h to obtain an enzymatic hydrolysate, and 3) reacting the enzymatic hydrolysate for 4-7 h at the temperature of 70-90 ℃ and the stirring temperature of 2500 r/min, and centrifuging to obtain the liquid protein fertilizer.)

一种利用贻贝蒸煮液制备液体蛋白肥的方法

技术领域

本发明涉及肥料制备技术领域，尤其是涉及一种利用贻贝蒸煮液制备液体蛋白肥的方法。

背景技术

液体蛋白肥料是用废弃动植物蛋白制作的一种农作物肥料。液体蛋白肥中通常含有大量生物肽，氨基酸的含量尤为丰富，并且含有多种常量元素、微量元素、维生素等，这种肥料可以借助于与其他有效成分的协同作用，提高植物的抗病、抗逆性，能改善作物的品质，促进植物生长，是一种新型、环保型动植物蛋白肥料。

我国是一个海洋大国，海洋水产的捕捞加工相当发达，在海洋水产加工的过程中往往会产生大量的水产品加工副产物，这些水产品加工副产物通常被当作废弃物而遗弃。例如，贻贝蒸煮液是在贻贝加工成冷冻品或干制品过程中产生的副产物。酶加工1吨贻贝产品，就会产生约1.5吨的蒸煮液，目前一般直接排放。这些蒸煮液富含贻贝水溶性营养成分及生物活性物质，含有大量蛋白质、多糖等营养物质，直接排放会引起水质富营养化，对环境污染严重。因此开发和利用贻贝蒸煮液，既能充分利用资源，又能减少对环境的污染。但是因为贻贝是一类沿岸底栖双壳海洋贝类，分布广、活动性底、爆污时间长，对各种污染物及重金属都有较强的生物富集能力，影响贻贝蒸煮液的利用。

发明内容

本发明为了克服贻贝蒸煮液中重金属含量超标无法利用的问题，提供一种利用贻贝蒸煮液制备液体蛋白肥的方法，改性壳聚糖既能作为蛋白酶的载体增大酶解反应的反应面积，提高酶解效率，还能吸收重金属，得到重金属含量极低的液体蛋白肥。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用贻贝蒸煮液制备液体蛋白肥的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将蛋白酶和改性壳聚糖按(0.5-2.5):1的质量比加入水中，加热反应后过滤得到处理剂；

2）将贻贝蒸煮液和处理剂按(1-1.5):1的质量比混合，pH 6-8，30-50 ℃下搅拌反应6-10 h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70-90 ℃、1500-2500 r/min搅拌条件下反应4-7 h，离心得液体蛋白肥。

本发明将蛋白酶和改性壳聚糖混合反应得处理剂，蛋白酶会吸附在改性壳聚糖上从而增大酶解反应的反应面积，将处理剂加入贻贝蒸煮液中先酶解将蛋白质分解为便于吸收的氨基酸，再利用改性壳聚糖脱除反应液的重金属等杂质，得到重金属含量极低的液体蛋白肥。

作为优选，所述步骤1）中改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，加入1-2倍物质的量的4-氯丁酸，再加入乙醇，30-40 ℃下反应4-6 h，反应结束后提取除杂，产物干燥至恒重得到改性壳聚糖。壳聚糖含有羟基、氨基和糖苷键等多种活性官能团，使其具有较强的与金属离子配位的能力。但是在目前的报道中，壳聚糖及其衍生物对钴离子的吸附性能不如对铜离子和镍离子等其他金属的吸附性能。本发明在壳聚糖上引入新的官能团得到改性壳聚糖，大大提高了对钴离子的吸附性能。

作为优选，所述改性壳聚糖还经过如下处理：称取改性壳聚糖，在水中加热搅拌，溶解后搅拌下依次滴加环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液，环氧氯丙烷的用量为改性壳聚糖质量的1%-3%，30-50 ℃下反应5-7 h，反应结束后提取除杂，产物干燥至恒重，得到交联改性壳聚糖。改性壳聚糖与环氧氯丙烷交联后可以得到不溶于酸、碱、水的交联络合吸附树脂，使它在应用过程中便于回收利用，同时在保证吸附效率的基础上降低生产成本，提高生产效率。更重要的是，控制好环氧氯丙烷的用量可以使网状结构的空隙与铜离子的直径相近，使得其在吸附铜离子时有孔隙吸附作用，吸附率得到提高。

作为优选，干燥条件为60-70 ℃下真空干燥。

作为优选，提取条件为加入1-3倍反应液体积的提取溶剂，搅拌、离心，用索氏提取器回流提取2-3 h。

作为优选，所述步骤1）中蛋白酶由木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以(0.2-0.8):1的体积比混合得到。木瓜蛋白酶和胰蛋白酶相互配合的酶解效率大于单独一种酶作用的酶解效率。

作为优选，液体蛋白肥中还加入含钾或磷元素的无机盐进行复配。液体蛋白肥的营养物质主要以氨基酸等为主，为了弥补其中钾、磷元素的缺乏，可以加入含钾或磷元素的无机盐，使配伍更合理，对作物和土壤具有改良作用。

因此，本发明具有如下有益效果：(1)改性壳聚糖既能作为蛋白酶的载体增大酶解反应的反应面积，还能吸收重金属；(2) 壳聚糖与4-氯丁酸反应后得到的改性壳聚糖大大提高了对壳聚糖钴离子的吸附性能；(3) 改性壳聚糖与环氧氯丙烷交联后可以得到不溶于酸、碱、水的交联络合吸附树脂，使它在应用过程中便于回收利用，同时在保证吸附效率的基础上降低生产成本，提高生产效率；更重要的是，控制好环氧氯丙烷的用量可以使网状结构的空隙与铜离子的直径相近，使得其在吸附铜离子时有孔隙吸附作用，吸附率得到提高；(4) 液体蛋白肥的营养物质主要以氨基酸等为主，为了弥补其中钾、磷元素的缺乏，可以加入含钾或磷元素的无机盐，使配伍更合理，对作物和土壤具有改良作用。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

改性壳聚糖的制备：将5 g脱乙酰度80%的壳聚糖溶解于50 mL的1% HCl溶液中，加入等摩尔的4-氯丁酸，再加入50 mL乙醇，30 ℃下反应6 h，在产物中加入100 mL乙醇，搅拌、离心，用索氏提取器回流提取2 h除去未反应的4-氯丁酸及副产物等杂质，产物在60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到水溶性的改性壳聚糖。

交联改性壳聚糖的制备：称取1 g上述改性壳聚糖，在50 mL水中加热搅拌，溶解后搅拌下依次滴加0.01 g环氧氯丙烷和50 mL的5% NaOH溶液，30 ℃下反应7 h，反应结束后将反应产物离心，水洗至中性，再用200 mL丙酮在索氏提取器中回流提取2 h除去未反应的环氧氯丙烷等杂质，产物在70 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到交联改性壳聚糖。

1）将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以0.2:1的体积比混合得到蛋白酶，将蛋白酶和上述交联改性壳聚糖按1:2的质量比加入水中，30 ℃下搅拌反应20 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂等质量混合，调pH 为6，在30 ℃下搅拌反应10h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应7 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量4%的氯化钾进行复配。

实施例2

改性壳聚糖的制备：将5 g脱乙酰度80%的壳聚糖溶解于50 mL的1% HCl溶液中，加入2倍物质的量的4-氯丁酸，再加入50 mL乙醇，40 ℃下反应4 h，在产物中加入200 mL乙醇，搅拌、离心，用索氏提取器回流提取3 h除去未反应的4-氯丁酸及副产物等杂质，产物在70 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到水溶性的改性壳聚糖。

交联改性壳聚糖的制备：称取1 g上述改性壳聚糖，在50 mL水中加热搅拌，溶解后搅拌下依次滴加0.03 g环氧氯丙烷和50 mL的5% NaOH溶液，50 ℃下反应5 h，反应结束后将反应产物离心，水洗至中性，再用100 mL丙酮在索氏提取器中回流提取3 h除去未反应的环氧氯丙烷等杂质，产物在60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到交联改性壳聚糖。

1）将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以0.8:1的体积比混合得到蛋白酶，将蛋白酶和上述交联改性壳聚糖按2.5:1的质量比加入水中，40 ℃下搅拌反应10 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂按质量比1.5:1混合，调pH 为7，在50 ℃下搅拌反应6 h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在80 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应5 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量1%的过磷酸钙进行复配。

实施例3

改性壳聚糖的制备：将5 g脱乙酰度80%的壳聚糖溶解于50 mL的1% HCl溶液中，加入1.5倍物质的量的4-氯丁酸，再加入50 mL乙醇，35 ℃下反应5 h，在产物中加入300 mL乙醇，搅拌、离心，用索氏提取器回流提取3 h除去未反应的4-氯丁酸及副产物等杂质，产物在60 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到水溶性的改性壳聚糖。

交联改性壳聚糖的制备：称取1 g上述改性壳聚糖，在50 mL水中加热搅拌，溶解后搅拌下依次滴加0.02 g环氧氯丙烷和50 mL的5% NaOH溶液，40 ℃下反应6 h，反应结束后将反应产物离心，水洗至中性，再用300 mL丙酮在索氏提取器中回流提取2 h除去未反应的环氧氯丙烷等杂质，产物在70 ℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到交联改性壳聚糖。

1）将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以0.5:1的体积比混合得到蛋白酶，将蛋白酶和上述交联改性壳聚糖等质量加入水中，30 ℃下搅拌反应15 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂按质量比1.2:1混合，调pH 为8，在40 ℃下搅拌反应8 h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在90 ℃、2500 r/min的搅拌条件下反应4 h，离心得液体蛋白肥。

实施例4

1）将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以0.2:1的体积比混合得到蛋白酶，将蛋白酶和实施例1的改性壳聚糖按1:2的质量比加入水中，30 ℃下搅拌反应20 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂等质量混合，调pH 为6，在30 ℃下搅拌反应10h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应7 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量4%的氯化钾进行复配。

实施例5

1）将木瓜蛋白酶和实施例1的交联改性壳聚糖按1:2的质量比加入水中，30 ℃下搅拌反应20 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂等质量混合，调pH 为6，在30 ℃下搅拌反应10h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应7 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量4%的氯化钾进行复配。

实施例6

1）将胰蛋白酶和实施例1的交联改性壳聚糖按1:2的质量比加入水中，30 ℃下搅拌反应20 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂等质量混合，调pH 为6，在30 ℃下搅拌反应10h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应7 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量4%的氯化钾进行复配。

对比例1

1）将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以0.2:1的体积比混合得到蛋白酶，将蛋白酶和脱乙酰度80%的壳聚糖按1:2的质量比加入水中，30 ℃下搅拌反应20 min后过滤得到处理剂；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和处理剂等质量混合，调pH 为6，在30 ℃下搅拌反应10h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应7 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量4%的氯化钾进行复配。

对比例2

1）将木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以0.2:1的体积比混合得到蛋白酶；

2）将1.18 g/mL的贻贝蒸煮液和蛋白酶等质量混合，调pH 为6，在30 ℃下搅拌反应10h，结束后得酶解液；

3）将酶解液在70 ℃、1500 r/min的搅拌条件下反应7 h，离心得液体蛋白肥；

4）液体蛋白肥中加入其质量4%的氯化钾进行复配。

实验结果：

分析上表，对比例2未用壳聚糖，无法除去贻贝蒸煮液中的重金属，对比例1用了未改性的壳聚糖，与实施例相比，本发明所用改性壳聚糖对钴、铜的脱除效果得到改善。酶解效率通过氨基酸态氮含量来表征，实施例5和实施例6采用了单独的蛋白酶，酶解效果不如采用复合酶的酶解效果。通过比较对比例2和实施例1可以看出，改性壳聚糖的存在还能促进酶解。实施例4和实施例1相比，因为未对改性壳聚糖进行交联处理，其对铜的吸附性能较差，推测是因为改性壳聚糖与环氧氯丙烷交联后使网状结构的空隙与铜离子的直径相近，使得其在吸附铜离子时有孔隙吸附作用，吸附率得到提高；另外，实施例4再生后的吸附量降幅约为5%，高于实施例1 的1%，说明改性壳聚糖与环氧氯丙烷交联后得到的交联络合吸附树脂，使它在应用过程中便于回收利用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。