阅读说明：本技术 利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法 (Method for producing bostrycin by solid state fermentation of HCH285 strain ) 是由 王沫 揭晶 石乐 王璋倩 熊涛 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法,该方法将蕲艾内生真菌HCH285的二级种子液接种于固态发酵基质中培养,所述固态发酵基质为大米或土豆泥。该方法提高了发酵产物中bostrycin的含量,具有生产周期短、产量高、操作方便的特点。(The invention provides a method for producing bostrycin by solid state fermentation of HCH285 strains, which comprises the step of inoculating secondary seed liquid of Chinese mugwort endophytic fungi HCH285 into a solid state fermentation substrate for culture, wherein the solid state fermentation substrate is rice or mashed potato.)

利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法

技术领域

本发明涉及发酵技术领域，特别涉及一种利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法。

背景技术

恶性肿瘤，俗称癌症。第三次全国居民死因调查结果显示，恶性肿瘤疾病引起的死亡率在我国城市居民所有死亡原因中居第二位，占总死亡率的22.32％，且发病率和死亡率都呈现持续上升趋势。近20年来，我国城市居民恶性肿瘤死亡构成由原来的21.88％增长到26.33％。恶性肿瘤已经成为严重威胁人类生命和健康的重大疾病，且呈持续的增长趋势。虽然抗肿瘤药物的数量多，但临床上大部分抗肿瘤药物存在细胞毒性强、选择性差、价格昂贵等问题。因此，寻找疗效确切、毒副作用小、作用于新靶点的抗肿瘤药物不仅具有重大的科学意义，也具有实际的社会效益。

天然产物具有结构骨架多样性等特点，是现代抗肿瘤药物先导结构的重要来源之一。以往的天然抗肿瘤药物大多是从陆生植物和海洋动植物体中提取分离得到的。从植物和动物原料中提取天然抗肿瘤药物，受到季节、气候、地理位置等诸多条件的制约，且提取率低、成本较高、工艺复杂，发展潜力有限。而微生物资源丰富，培养成本低廉。利用微生物发酵生产药物具有生产周期短、产量高等优点，已经成为获得天然抗肿瘤药物的一种有效手段。

抗癌活性成分bostrycin是一种天然四氢蒽酮化合物，红色，较早由T.Noda课题组从bostryconema alpestre中分离出来，随后又相继有从Nigrospora oryzaet、Arthrinwmphaeospermumt和Alternaria eichhorIli等分离出bostrycin的报道，均报道其具多种抗肿瘤活性。中山大学附属第一医院郭禹标等人进行了初步体外实验，发现bostrycin能够抑制多种癌细胞增殖和促进其凋亡，包括鼻咽癌、***癌、结肠癌和乳腺癌。同时发现并证实bostrycin对人肺腺癌细胞株A549增殖有明显的抑制作用。中山大学生物科学技术学院陈冬妮等人研究发现，bostrycin的抗乳腺癌效果显著，其通过下调K/A信号途径诱导乳腺癌细胞凋亡。陈伟生通过体外试验，观察bostrycin对肺癌细胞株A549细胞增殖和凋亡的影响，并探讨了可能的作用机制。据文献报道，bostrycin能够抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长(Chen et al 2011，Chen et al 2012，陈冬妮2013)。国内外已有从植物中分离得到产bostrycin内生菌的报道，但这些报道主要集中在菌种的选育(筛选分离得到产bostrycin的内生菌)和液体摇瓶发酵(将筛选得到的内生菌液体发酵培养产bostrycin)。

本发明人所在的课题组之前筛选到了一株产bostrycin的蕲艾内生菌HCH285，专利号为“201710183008.X”，所述的菌株已于2017年2月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：球黑孢菌(Nigrospora sphaerica)HCH285，保藏编号为CCTCC NO：M2017061，地址：中国武汉武汉大学。如何开发一种利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法，使得最后发酵产物中bostrycin的得率高，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法，发酵产物中bostrycin的得率高，具有生产周期短、产量高等特点。

本发明这样实现：

本发明提供一种利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法，将蕲艾内生真菌HCH285的二级种子液接种于固态发酵培养基中培养，所述固态发酵培养基的基质为大米或土豆泥。

优选地，所述固态发酵基质为大米，所述方法的具体步骤为：将蕲艾内生真菌HCH285的二级种子液接种于大米发酵基质中，于22℃～26℃下，发酵培养9～18d，加入的二级种子液的体积为大米基质质量(所述大米基质质量为所用土豆的质量)的5～40％，单位为mL/g；所述大米发酵培养基的初始加水量的体积为大米基质质量的40％～90％，初始pH值为3～8。

优选地，所述固态发酵基质为土豆泥，所述方法的具体步骤为：将蕲艾内生真菌HCH285的二级种子液接种于土豆泥发酵基质中，于16℃～28℃下，发酵培养20～50d，加入的二级种子液的体积为土豆泥基质质量(所述土豆泥基质质量即为发酵时加入的土豆泥所用土豆的质量)的1.25～20％，单位为mL/g；所述土豆泥发酵培养基的初始pH值为5～7。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种利用HCH285菌株固态发酵生产bostrycin的方法，采用采用固态发酵，且固态发酵培养基的基质为大米或土豆泥时具有产物含量高、发酵时间短的特点。其中基质为大米时，发酵产物中bostrycin的含量与培养基基质的比值高达16.09％。其中基质为土豆泥时，鲜土豆每200g制得的固体培养基，发酵产物中bostrycin的含量最高可达0.92mg。

附图说明

图1为大米发酵培养基中初始加水量对发酵产物中bostrycin含量的影响结果；

图2为大米发酵培养基中水的初始pH值对发酵产物中bostrycin含量的影响结果；

图3为大米发酵培养基中接种量对发酵产物中bostrycin含量的影响结果；

图4为大米发酵培养基中培养时间对发酵产物中bostrycin含量的影响结果；

图5为土豆泥发酵培养基培养温度对发酵产物中bostrycin含量的影响；

图6为土豆泥发酵培养基发酵基质的初始pH值对发酵产物中bostrycin含量的影响；

图7为土豆泥发酵培养基接种量对发酵产物中bostrycin含量的影响；

图8为土豆泥发酵培养基培养时间对发酵产物中bostrycin含量的影响。

具体实施方式

实施例1

一、HCH285的采用大米发酵培养基固态发酵产bostrycin的方法，包含以下步骤：

步骤1、菌种活化

将蕲艾内生真菌HCH285接种于PSA平板培养基(将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半个小时左右，用4层纱布滤去马铃薯，然后加入蔗糖20g和琼脂15g，加水补足至1000mL，搅拌溶解后分装于锥形瓶，在121℃高压蒸汽下灭菌20min，活化前分装于培养皿中。)于22～26℃培养至菌落较密，菌落为红色。

步骤2、一级种子液的制备

将活化好的平板种子，利用孔径为0.9cm的打孔器打2孔菌丝，然后接种于PSB液体培养基(将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半个小时左右，用4层纱布滤去马铃薯，然后加入蔗糖20g，加水补足至1000mL，搅拌溶解后分装于锥形瓶，在121℃高压蒸汽下灭菌20min，装量为100mL/250mL。)中进行培养，摇床转速150～200r/min，于22～26℃培养48～72h，至溶液成为鲜红色。

步骤3、二级种子液的制备

用移液器吸取上述一级种子液1～3mL于PSB液体培养基，中进行培养，摇床转速150～200r/min，于22～26℃培养24～48h，至溶液成为鲜红色。

步骤4、固态发酵

用移液器吸取上述二级种子液适量至固态发酵培养基，精密称取大米20g于锥形瓶中，再按体积计算加入蒸馏水，初始加水量的体积为大米质量的60％，初始pH为自然，封口，在121℃高压蒸汽下灭菌20min，按体积计算加入二级种子液为固态发酵培养基质量的20％，于22～26℃发酵培养12d，发酵过程中每天翻动以便于更好地发酵，至大米成为红色粒状且颜色均匀，得发酵产物。

上述发酵产物经甲醇超声提取可得天然红色色素粗提物，再经制备液相可得bostrycin。通过高效液相色谱分析，发酵产物中bostrycin的得率。

实施例2-实施例6

实施例2-实施例6中的均为称取大米20g于锥形瓶中，不同的是初始加水量的体积与大米质量的比值分别为40％、50％、70％、80％、90％，其他培养条件均同实施例1。

实施例7-实施例12

实施例7-实施例12中的初始pH分别为3、4、5、6、7、8，其他培养条件均同实施例1。

实施例13-实施例16

实施例13-实施例16中的接种量分别为5％、10％、30％、40％，其他培养条件均同实施例1。

实施例17-实施例25

实施例17-实施例25中的培养时间分别为9d、10d、11d、13d、14d、15d、16d、17d、18d外，其他培养条件均同实施例1。

对比例1

该对比例中除接种量改为50％外，其他培养条件均同实施例1。

对比例2-对比例8

对比例2-对比例8中培养时间分别为1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d，其他培养条件同实施例1。

实验例1

1、分别提取并统计实施例1-实施例6所得的发酵产物中bostrycin的得率，其中

表1-不同初始加水量对固态发酵工艺的影响

由表1可知，当初始加水量为60％(实施例1)时，发酵产物中bostrycin的含量最高。

2、分别统计实施例1、实施例7-12所得的发酵产物中bostrycin的得率，如表2所示。

表2-不同初始pH值对固态发酵工艺的影响

由表2可知，当初始pH值调节为6.0(实施例12)时，发酵产物中bostrycin的含量最高。

3、分别统计实施例1、实施例13-16、对比例1所得的发酵产物中bostrycin的得率，如表3所示。表3数据说明接种量对HCH285固体发酵的影响，以20g大米为基质，接种量(V/V)分别为5％、10％、20％、30％、40％、50％，在适当条件下进行发酵培养，测定发酵产物中HCH285的含量分别为9.30％、12.10％、16.09％、15.97％、12.91％、4.73％。由表3可以看出，当接种量为20％时，发酵产物中bostrycin的含量最高。

表3不同接种量所得发酵产物中bostrycin的得率

4、分别统计实施例1、实施例17-25、对比例2-9所得的发酵产物中bostrycin的含量以及得率，如表4所示。表4数据说明培养时间对HCH285固体发酵的影响。以20g大米为基质，培养时间(d)分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，在适当条件下进行发酵培养，测定发酵产物中HCH285的含量分别为0.08％、0.47％、2.28％、2.62％、6.07％、7.15％、7.80％、8.28％、10.38％、11.29％、14.61％、16.09％、15.49％、14.67％、14.36％、14.24％、13.68％、13.66％，结果见表4所示。由表4可以看出，当培养时间为12d时，发酵产物中bostrycin的含量最高。

表4不同培养时间所得发酵产物中bostrycin的得率

综上所述，本发明将蕲艾内生真菌HCH285的二级种子液接种于固态发酵培养基中，于22℃～26℃下，发酵培养9～18d，加入的二级种子液的体积为固态发酵培养基质量的5～40％；所述固态发酵培养基的基质为大米，初始加水量的体积为大米质量的40％～90％；初始pH值为3～8。具有产物含量高、发酵时间短的特点。

实施例26

一、HCH285的采用土豆泥发酵培养基固态发酵产bostrycin的方法，包含以下步骤：

步骤1、菌种活化

将蕲艾内生真菌HCH285接种于PSA平板培养基(将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半个小时左右，用4层纱布滤去马铃薯，然后加入蔗糖20g和琼脂15g，加水补足至1000mL，搅拌溶解后分装于锥形瓶，在121℃高压蒸汽下灭菌20min，活化前分装于培养皿中。)于22～26℃培养至菌落较密，菌落为红色。

步骤2、一级种子液的制备

将活化好的平板种子，利用孔径为0.9cm的打孔器打2孔菌丝，然后接种于PSB液体培养基(将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半个小时左右，用4层纱布滤去马铃薯，然后加入蔗糖20g，加水补足至1000mL，搅拌溶解后分装于锥形瓶，在121℃高压蒸汽下灭菌20min，装量为100mL/250mL。)中进行培养，摇床转速150～200r/min，于22～26℃培养48～72h，至溶液成为鲜红色。

步骤3、二级种子液的制备

用移液器吸取上述一级种子液1～3mL于PSB液体培养基，中进行培养，摇床转速150～200r/min，于22～26℃培养24～48h，至溶液成为鲜红色。

步骤4、固态发酵

用移液器吸取上述二级种子液适量至固体发酵培养基(精密称取去皮后的鲜土豆200g，切块，加入自来水1L(初始加水量50ml/g)，自然pH，煮沸15～25min，滤去汁液；将煮熟的土豆块捣碎成泥，装入1L玻璃锥形瓶中，再加入20g蔗糖或葡萄糖，混匀，封口，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。每瓶加入二级种子液10mL(接种量为5％，mL/g)，于24℃、静置发酵培养30d，至土豆泥基质整体为红色且颜色均匀，得发酵产物。

上述发酵产物经甲醇超声提取可得天然红色色素粗提物，再经制备液相可得bostrycin。通过高效液相色谱分析，发酵产物中bostrycin的得率。

实施例27-实施例31

实施例27-实施例31的发酵培养温度分别为12d、16d、20d、28d、32d，其他培养条件均同实施例26。

实施例32-实施例37

实施例32-实施例37的土豆泥培养基的初始pH分别为3.02、3.99、5.01、7.02、7.95、9.00，其他培养条件均同实施例26。

实施例38-实施例41

实施例38-实施例41中接种量分别为1.25％(mL/g)、2.5％(mL/g)、10％(mL/g)、20％(mL/g)，其他培养条件均同实施例26。

实施例42-实施例52

实施例42-实施例52中发酵培养时间分别为5、10、15、20、25、35、40、45、50、55、60d，其他培养条件均同实施例26。

对比例10

该对比例中发酵培养时间为0d，其他培养条件均同实施例26。

实验例2

1、分别提取并统计实施例26-31所得的发酵产物中bostrycin的含量如表。

表5-不同温度培养所得发酵产物中bostrycin的含量

由表5可知，在其他条件相同的情况下(初始pH值为自然，接种量10mL/200g，于24℃发酵培养30d)培养温度为24℃时，所得次生代谢产物中bostrycin的含量最高。

2、分别提取并统计实施例32-37所得的发酵产物中bostrycin的含量如表6所示。

表6-不同初始pH值所得发酵产物中bostrycin的含量

由表6可知，在其他条件相同的情况下(接种量10mL/200g，于24℃发酵培养30d)基质的初始pH值为自然(6.00-6.35)时，所得次生代谢产物中bostrycin的含量最高。

3、分别提取并统计实施例38-41所得的发酵产物中bostrycin的含量如表7所示。

表7-不同接种量所得发酵产物中bostrycin的含量

由表7可知，在其他条件相同的情况下(初始pH值为自然，于24℃发酵培养30d)接种量10mL/200g时，所得次生代谢产物中bostrycin的含量最高。4、分别提取并统计实施例42-52所得的发酵产物中bostrycin的含量如表8所示。

表8-不同培养时间所得发酵产物中bostrycin的含量

由表8可知，在其他条件的情况下(初始pH值为自然，接种量10mL/200g，于24℃)发酵培养30d所得次生代谢产物中bostrycin的含量最高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。