阅读说明：本技术 一种合成l-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法 (method for synthesizing L-ascorbic acid-2-glucoside ) 是由 王珂 周友超 陈修 陈斌 朱东来 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生化合成技术领域,具体公开了一种合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法。该合成方法采用5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸为起始原料,先反应制得5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷,反应得到的反应液用强酸性阳离子交换树脂进行分离,5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷即可水解为L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷,然后再进行结晶、干燥,即得到L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品,结晶后剩余的料液循环使用。本发明的合成方法有效避免了副产物生成,降低了后续分离纯化难度,提高了L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品的纯度和收率。(The invention belongs to the technical field of biochemical synthesis, and particularly discloses methods for synthesizing L-ascorbic acid-2-glucoside, wherein 5, 6-O-isopropylidene-L-ascorbic acid is used as a starting material, 5, 6-O-isopropylidene-L-ascorbic acid-2-glucoside is prepared by reaction, reaction liquid obtained by the reaction is separated by using strong acid cation exchange resin, 5, 6-O-isopropylidene-L-ascorbic acid-2-glucoside can be hydrolyzed into L-ascorbic acid-2-glucoside, crystallization and drying are carried out, so that an L-ascorbic acid-2-glucoside product is obtained, and residual feed liquid after crystallization is recycled.)

一种合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明涉及生化合成技术领域，特别是涉及一种合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法。

背景技术

L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷(也即2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸)的结构式见式(Ⅰ)所示，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷作为L-抗坏血酸重要的衍生物，是卫生署公布认可的美白添加剂之一，是公认最为稳定的L-抗坏血酸衍生物。L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷是目前各大品牌化妆品产品中最常使用的美白成分。L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷不仅具有良好的美白效果，而且化学性质稳定、对皮肤无刺激，因此在国内外化妆品生产中被广泛使用。进入人体细胞的L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷经α-葡萄糖苷酶水解生成抗坏血酸和葡萄糖，因此L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷具有与抗坏血酸一样的还原性和抗氧化性，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的持续分解可为体内不断提供抗坏血酸。

目前已报道的关于L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的制备方法，采用的起始原料均为抗坏血酸或其盐类。申请号为201010571709.9的专利文件中公开了一种含2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶粉末的制造方法，含有淀粉和L-抗坏血酸的溶液经环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用，得到2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸生产率为35％以上的溶液。申请号为201610985353.0的专利申请中也公开了一种制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法，采用重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株发酵生产得到的蔗糖磷酸化酶为生物催化剂，以蔗糖为糖基供体，L-抗坏血酸为糖基受体，进行生物催化制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品。在该专利中还进一步指出，目前以抗坏血酸或其盐类为原料的制备方法，在L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的制备过程中会生成10％左右的5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸和6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸混合副产物，原因是由于葡萄糖基供体在糖基转移酶的作用下不仅与L-抗坏血酸的2位羟基反应，还能与其5位和6位羟基反应，因此不可避免的生成了5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸和6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸副产物。这两种副产物的分子量与目标产物L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷相同，因此纯化时很难将副产物分离，导致目标产物L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷难以从过饱和溶液中结晶析出。该专利针对该缺陷进行了改进，构建重组蔗糖磷酸化酶的工程菌株，以发酵所得菌体细胞为生物催化剂，在柠檬酸三钠缓冲液体系中，以蔗糖和L-抗坏血酸为原料制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，经实验验证反应产物主要为L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷。

本发明拟寻找一种新型反应底物作为起始物料来合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，以减少副产物的生成。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的合成方法，分离纯化简单，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品的纯度和收率高。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的方法，包括以下步骤：

(1)以5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸为反应原料，添加葡萄糖基供体，在糖基转移酶作用下进行生物转化反应；

(2)向步骤(1)反应结束后得到的反应液中加入葡萄糖淀粉酶进行水解反应，制备5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷；

(3)步骤(2)得到的含5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的反应液采用强酸性阳离子交换树脂分离，之后分离液结晶析出L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品，析出产品后的剩余料液返回步骤(1)循环使用。步骤(1)和步骤(2)的反应均在避光、避氧条件下进行。

优选地，所述葡萄糖基供体的用量为所述5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸质量的50～60％；和/或，所述糖基转移酶的用量为：每克所述5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸添加糖基转移酶650～700U；和/或，所述葡萄糖淀粉酶的用量为：每克所述5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸添加葡萄糖淀粉酶11500～12000U。

优选地，步骤(1)反应时还添加抗氧剂，所述抗氧剂的用量优选为5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸质量的6％～10％。

进一步优选地，所述抗氧剂为半胱氨酸。

作为一种优选的实施方式，所述5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸由L-抗坏血酸与丙酮反应制得。进一步优选地，将L-抗坏血酸与丙酮按照L-抗坏血酸：丙酮＝1g:(5ml～10ml)的比例投料，采用乙酰氯、***、氯化亚锡中的任一种或几种为催化剂催化反应制备5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸。其中，催化剂进一步优选为乙酰氯；L-抗坏血酸和丙酮的比例优选为VC：丙酮＝1g:(6ml～8ml)；在20～50℃的水浴中，优选为30～40℃的水浴中，反应2～5h，优选反应时间4～5h。

优选地，所述葡萄糖基供体为β-环糊精、胶凝淀粉、可溶性淀粉、麦芽糊精中的任一种或几种。

优选地，所述糖基转移酶为α-葡萄糖苷酶、环糊精葡萄糖苷转移酶、α-淀粉酶中的任一种或几种。

更优选地，所述葡萄糖基供体为β-环糊精。所述糖基转移酶为环糊精葡萄糖苷转移酶。

优选地，所述葡萄糖淀粉酶为α-1,4-葡萄糖水解酶。

优选地，所述强酸性阳离子交换树脂是以苯乙烯-二乙烯基共聚物为基体的磺酸基阳离子交换树脂。

将析出产品后的剩余料液返回步骤(1)循环使用时，由于此料液中仍含有反应物料，如葡萄糖基供体、糖基转移酶、葡萄糖淀粉酶以及5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸原料，因此可以根据剩余料液的实际成分组成，减少甚至不再添加葡萄糖基供体、糖基转移酶、葡萄糖淀粉酶等。

本发明提供了一种L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的合成方法，反应式如下。5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸先进行反应制备5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，反应得到的反应液用强酸性阳离子交换树脂进行分离，5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷即可水解为L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，然后进行结晶、干燥，即得到L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品，结晶后剩余的料液循环使用。

采用5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸作为反应原料，其5位和6位羟基通过形成异丙叉基进行保护，降低了反应活性，主要由2位羟基发生反应，避免了5-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸和6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸副产物的生成，因此降低了后续分离纯化难度，提高了L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品的纯度和收率，同时也提高了结晶收率。并且，通过将分离结晶后的剩余料液循环使用，还可以提高各原料的利用率，降低生产成本。本发明提供的L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的合成方法，所得L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品的纯度≥99％，产品结晶收率大于90％。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

在250ml带搅拌和温度计的干燥三口圆底烧瓶中，加入25g的L-抗坏血酸、150ml的丙酮，并将反应体系置于30℃水浴中，开启搅拌，在强力搅拌下，加入2ml的乙酰氯，反应2h后，再次加入2ml的乙酰氯，继续反应2h后，抽滤，减压干燥，得到白色针状固体，即为5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸产品，分子量216.19，测试熔点为217℃(dec.)。

取5g的β-环糊精，置于65ml浓度为86g/L的5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸水溶液中，之后再加入0.70g的半胱氨酸，然后于37℃水浴中保温10min，之后将料液pH调节至5～6，加入10ml(600U/ml)的环糊精葡萄糖苷转移酶，将反应体系置于摇床中，避光避氧条件下，保温37℃反应24h后，保持pH在5.5左右；之后将料液升温至42℃，加入1ml的α-1,4-葡萄糖水解酶(10万U/ml)，继续反应3小时，反应完毕；将反应所得料液经过强酸性阳离子交换树脂分离，强酸性阳离子交换树脂是以苯乙烯-二乙烯基共聚物为基体的磺酸基阳离子交换树脂，所得分离液中L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷折纯5.71g，结晶、干燥，实际得到L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷白色粉末5.20g，测试熔点158.8℃，比旋度+187.1°，质量百分比含量(HPLC)为99.5％，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的结晶收率为90.6％。结晶后的料液主要成分有抗坏血酸、少量β-环糊精、半胱氨酸和环糊精葡萄糖苷转移酶，可以循环使用。

在反应体系中加入少量抗氧剂如半胱氨酸，可以在糖基转移反应过程中及反应结束后保护未反应的5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸，以提高5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸原料的利用率，降低成本，提高产品质量。

如果以L-抗坏血酸为起始原料，先制备得到5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸，之后再采用上述方法制备L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，同样，向反应液中加入少量抗氧剂，可以延缓L-抗坏血酸氧化，防止其氧化变色，减少L-抗坏血酸在反应过程中的损失，进一步提高L-抗坏血酸的利用率。

实施例2

本实施例使用实施例1得到的结晶后的料液，向实施例1得到的结晶后的料液中加入4g的β-环糊精、4.34g的5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸，之后再加入0.70g的半胱氨酸，然后于37℃水浴中保温10min，之后将料液pH调节至5～6，加入8ml(600U/ml)的环糊精葡萄糖苷转移酶，将反应体系置于摇床中，避光避氧条件下，保温37℃反应24h后，保持pH在5.5左右；之后将料液升温至42℃，加入1ml的α-1,4-葡萄糖水解酶(10万U/ml)，继续反应3小时，反应完毕；将反应所得料液经过强酸性阳离子交换树脂分离，强酸性阳离子交换树脂是以苯乙烯-二乙烯基共聚物为基体的磺酸基阳离子交换树脂，所得分离液中L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷折纯5.61g，结晶、干燥，实际得到L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷白色粉末5.11g，测试熔点158.6℃，比旋度+187.8°，质量百分比含量(HPLC)为99.2％，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的结晶收率为90.3％。结晶后的料液再循环使用。

实施例3

本实施例使用实施例2得到的结晶后的料液，向实施例2得到的结晶后的料液中加入3g的β-环糊精、3.35g的5,6-O-异丙叉基-L-抗坏血酸，之后再加入0.70g的半胱氨酸，然后于37℃水浴中保温10min，之后将料液pH调节至5～6，加入6ml(600U/ml)的环糊精葡萄糖苷转移酶，将反应体系置于摇床中，避光避氧条件下，保温37℃反应24h后，保持pH在5.5左右；之后将料液升温至42℃，加入1ml的α-1,4-葡萄糖水解酶(10万U/ml)，继续反应3小时，反应完毕；将反应所得料液经过强酸性阳离子交换树脂分离，强酸性阳离子交换树脂是以苯乙烯-二乙烯基共聚物为基体的磺酸基阳离子交换树脂，所得分离液中L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷折纯5.50g，结晶、干燥，实际得到L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷白色粉末5.01g，测试熔点158.5℃，比旋度+187.5°，质量百分比含量(HPLC)为99.0％，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的结晶收率为90.2％。

实施例3结晶后料液残留抗坏血酸折纯1.71g，实施例1至3的抗坏血酸总利用率为80.9％。

通过以上实施例可以看出，本发明实施例2和实施例3通过循环使用结晶后的料液，所得L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品质量稳定，L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷产品中L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷含量≥99％，结晶收率＞90％，抗坏血酸总利用率＞80％。