一种还原型谷胱甘肽的检测方法
阅读说明：本技术 一种还原型谷胱甘肽的检测方法 (Detection method of reduced glutathione ) 是由 赵玉芬 王敏凝 蔡华欢 李福来 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：一种还原型谷胱甘肽的检测方法,涉及谷胱甘肽。提供简单有效、检测灵敏度高的一种还原型谷胱甘肽的检测方法。以合成的含二硫键的双官能团有机小分子作为连接分子,构建了表面修饰荧光分子的纳米金探针。结合荧光共振能量转移FRET技术和还原型谷胱甘肽能够还原二硫键的性质,实现对还原型谷胱甘肽的检测。与现有方法相比,检测方法简单有效,对还原型谷胱甘肽的检测灵敏度高,所用的试剂都廉价易得,且绿色环保。(The detection method of reduced glutathione relates to glutathione, provides a simple, effective and high detection sensitivity reduced glutathione detection method, takes the synthesized bifunctional organic micromolecules containing disulfide bonds as connecting molecules, constructs a nano-gold probe with a surface modified fluorescent molecule, combines the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) technology and the property that the reduced glutathione can reduce the disulfide bonds, and realizes the detection of the reduced glutathione.)
技术领域
本发明涉及谷胱甘肽，尤其是涉及一种还原型谷胱甘肽的检测方法。
背景技术
谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH)作为细胞内含量最丰富的非蛋白硫醇，是目前研究最广泛的小分子硫醇。细胞内大部分(＞95％)的谷胱甘肽以还原型GSH存在，而少部分为氧化型GSSG。生物体内还原型谷胱甘肽含量的异常变化，与阿尔茨海默症、囊性纤维化、肝脏损伤等多种疾病的发生有着密切的关系。因此，研究对还原型谷胱甘肽的检测方法，对疾病诊断、药物治疗等方面有着重要的意义。
目前已经开发的对还原型谷胱甘肽的检测方法有高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、表面增强拉曼(SERS)法和比色法等。高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳(CE)对GSH检测的灵敏度高，但耗时长且对仪器有一定的要求。表面增强拉曼(SERS)法和比色法检测时间较短，但是对GSH检测的灵敏度低，检出限一般在μM级别。因此开发一种简单有效、检测灵敏度高的还原型谷胱甘肽检测方法，具有重要的科学意义和临床应用价值。
中国专利CN201610764935.6公开一种基于电化学探针高灵敏度检测还原型谷胱甘肽的方法，利用稀土铈(IV)作为电化学探针，基于Ce(IV)和GSH进行氧化还原反应，Ce(IV)转化为Ce(III)时有电化学信号的变化，建立一种电化学传感器技术检测还原型谷胱甘肽的方法。在CHI660D电化学工作站完成，工作电极为金电极，对电极为铂电极，参比电极为银/氯化银电极，电化学测试为示差脉冲法，实验条件是支持电解质为1.0mol/L Na2SO4，溶液pH值为6，测试温度为25℃；使用DPV法分别测定其电流值的变化。电流值与所加GSH浓度成线性关系，通过计算得出GSH的检测浓度，检测限为0.05nmol·L-1。
中国专利CN201310449795.X公开一种还原型谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：将含纳米金颗粒的溶液和氯金酸溶液分别用缓冲溶液稀释后再混合，然后加入表面活性剂溶液混匀，向所得混合溶液中加入待测溶液，静置5min～10min后，再加入H2O2水溶液形成反应体系并启动反应，反应完成后，对所得产物体系的紫外可见吸收光谱进行检测，根据检测所得产物体系的紫外可见吸收光谱中520nm处的吸光度变化定性判断待测溶液中是否含有还原型谷胱甘肽，通过已测定的线性回归方程定量检测待测溶液中还原型谷胱甘肽的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供简单有效、检测灵敏度高的一种还原型谷胱甘肽的检测方法。
本发明包括以下步骤：
1)以2-氨基乙硫醇(C2H7NS)和3-巯基丙酸(C3H6O2S)为原料，在H2O2和氨水的参与下，合成两端分别为氨基和羧基的含二硫键的双官能团有机小分子(Linker)，然后异硫氰酸荧光素(FITC)和双官能团有机小分子(Linker)在有机溶剂中反应，生成Linker-FITC，通过离心浓缩，去除多余的反应溶剂；
2)制备纳米金颗粒，加入聚赖氨酸(ε-Polylysine,PLL)静置过夜反应，通过离心除去游离的聚赖氨酸后，加入水重悬，得到表面修饰聚赖氨酸的纳米金([email protected])；
3)通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)反应活化Linker-FITC上的羧基，进而与[email protected]上的氨基发生缩合反应，经过离心除去体系中未反应的(Linker-FITC)，将沉淀用超纯水重新分散，得到最终用于检测纳米金探针([email protected]/Linker-FITC)；
4)不同浓度梯度的GSH与纳米金探针恒温水浴中反应后，取100mL反应体系加入96孔酶标板进行荧光光谱检测，测定得到GSH标准曲线，检出限为1nM。
在步骤1)中，所述含二硫键的双官能团有机小分子(Linker)的结构式如下：
所述2-氨基乙硫醇(C2H7NS)和3-巯基丙酸(C3H6O2S)的当量比为1︰1；
所述异硫氰酸荧光素(FITC)和双官能团有机小分子(Linker)的当量比为1.2︰1；
所述有机溶剂可采用甲醇和三乙胺混合溶液，甲醇和三乙胺的当量比为100︰1；
所述反应的反应温度可为35～40℃，反应时间可为6～8h，离心浓缩条件为40℃，2h。
在步骤2)中，所述制备纳米金颗粒可采用柠檬酸盐还原法，具体步骤可为：向圆底烧瓶中加入100mL的超纯水和磁子，油浴加热至120℃，微沸状态下加入1mL 1％的氯金酸溶液，打开磁力搅拌。搅拌均匀，至溶液微沸后迅速加入750μL 57mg/mL的柠檬酸钠溶液；维持温度在120℃左右反应20min，观察到溶液颜色慢慢变成深酒红色，停止加热，即完成了纳米金颗粒的合成；
所述纳米金颗粒的粒径可为17～18nm；所述加入聚赖氨酸可采用体积百分浓度为0.1％的聚赖氨酸；所述水可采用超纯水；所述纳米金颗粒和聚赖氨酸的反应体积比可为1︰(3～5)。离心条件可为5000～6000rpm，20min。
在步骤3)中，所述反应中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)当量比可为1︰1，活化条件为室温下旋转反应15～30min。所述缩合反应温度可为4℃，反应时间可为1～2h。
在步骤4)中，所述不同浓度梯度的GSH浓度范围为10mM～50nM；
所述不同浓度梯度GSH与纳米金探针溶液的体积比为1︰50，使得最终反应体系中GSH浓度范围为200mM～1nM；
所述恒温水浴的温度可为37℃，反应时间可为2h。
本发明涉及一种基于双官能团有机小分子修饰的纳米金探针用于检测还原型谷胱甘肽(GSH)的新方法。即以合成的含二硫键的双官能团有机小分子作为连接分子，构建了表面修饰荧光分子的纳米金探针。结合荧光共振能量转移(FRET)技术和还原型谷胱甘肽能够还原二硫键的性质，实现对还原型谷胱甘肽的检测。
与现有方法相比，本发明的检测方法简单有效，对还原型谷胱甘肽的检测灵敏度高，本发明中所用的试剂都廉价易得，且绿色环保。
附图说明
图1为检测还原型谷胱甘肽GSH的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明包括以下步骤：
1)以2-氨基乙硫醇(C2H7NS)和3-巯基丙酸(C3H6O2S)为原料，在H2O2和氨水的参与下，合成两端分别为氨基和羧基的含二硫键的双官能团有机小分子(Linker)，然后异硫氰酸荧光素(FITC)和双官能团有机小分子(Linker)在有机溶剂中反应，生成Linker-FITC，通过离心浓缩，去除多余的反应溶剂；
所述含二硫键的双官能团有机小分子(Linker)的结构式如下：
所述2-氨基乙硫醇(C2H7NS)和3-巯基丙酸(C3H6O2S)的当量比为1︰1；所述异硫氰酸荧光素(FITC)和双官能团有机小分子(Linker)的当量比为1.2︰1；所述有机溶剂可采用甲醇和三乙胺混合溶液，甲醇和三乙胺的当量比为100︰1；所述反应的反应温度可为35～40℃，反应时间可为6～8h，离心浓缩条件为40℃，2h。
2)制备纳米金颗粒，加入聚赖氨酸(ε-Polylysine,PLL)静置过夜反应，通过离心除去游离的聚赖氨酸后，加入水重悬，得到表面修饰聚赖氨酸的纳米金([email protected])；所述制备纳米金颗粒可采用柠檬酸盐还原法，具体步骤可为：向圆底烧瓶中加入100mL的超纯水和磁子，油浴加热至120℃，微沸状态下加入1mL 1％的氯金酸溶液，打开磁力搅拌。搅拌均匀，至溶液微沸后迅速加入750μL 57mg/mL的柠檬酸钠溶液；维持温度在120℃左右反应20min，观察到溶液颜色慢慢变成深酒红色，停止加热，即完成了纳米金颗粒的合成；所述纳米金颗粒的粒径可为17～18nm；所述加入聚赖氨酸可采用体积百分浓度为0.1％的聚赖氨酸；所述水可采用超纯水；所述纳米金颗粒和聚赖氨酸的反应体积比可为1︰(3～5)。离心条件可为5000～6000rpm，20min。
3)通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)反应活化Linker-FITC上的羧基，进而与[email protected]上的氨基发生缩合反应，经过离心除去体系中未反应的(Linker-FITC)，将沉淀用超纯水重新分散，得到最终用于检测纳米金探针([email protected]/Linker-FITC)；所述反应中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)当量比可为1︰1，活化条件为室温下旋转反应15～30min。
所述缩合反应温度可为4℃，反应时间可为1～2h。
4)不同浓度梯度的GSH与纳米金探针恒温水浴中反应后，取100mL反应体系加入96孔酶标板进行荧光光谱检测，测定得到GSH标准曲线，检出限为1nM。所述不同浓度梯度的GSH浓度范围为10mM～50nM；所述不同浓度梯度GSH与纳米金探针溶液的体积比为1︰50，使得最终反应体系中GSH浓度范围为200mM～1nM；所述恒温水浴的温度可为37℃，反应时间可为2h。
实施例1空白对照荧光强度F0的测定
在1.5mL EP管中加入392μL的纳米金探针溶液后，加入8μL的纯水，混合均匀，置于37℃恒温水浴中避光反应2h。用移液枪吸取100μL的反应体系加入96孔酶标板中，平行3组。酶标仪设置参数为：Mode:FL Spectrum；Wavelength:510～600nM；PMT：Auto；选取波长522nm处的荧光强度值，3组荧光强度值取平均即得到空白对照荧光强度F0。
实施例2 GSH体系终浓度180nM的荧光强度Fc(GSH)＝180nM的测定
在1.5mL EP管中加入392μL的纳米金探针溶液后，加入8μL浓度为9μΜ的GSH溶液，混合均匀，置于37℃恒温水浴中避光反应2h。用移液枪吸取100μL的反应体系加入96孔酶标板中，平行3组。酶标仪设置参数为：Mode:Spectrum；Wavelength:470～600nM；PMT：Auto；选取波长522nm处的荧光强度值，3组荧光强度值取平均即得到GSH体系终浓度180nM的荧光强度Fc(GSH)＝180nM。
实施例3 GSH体系终浓度10nM的荧光强度Fc(GSH)＝10nM的测定
在1.5mL EP管中加入392μL的纳米金探针溶液后，加入8μL浓度为0.5μΜ的GSH溶液，混合均匀，置于37℃恒温水浴中避光反应2h。用移液枪吸取100μL的反应体系加入96孔酶标板中，平行3组。酶标仪设置参数为：Mode:Spectrum；Wavelength:470～600nM；PMT：Auto；选取波长522nm处的荧光强度值，3组荧光强度值取平均即得到GSH体系终浓度10nM的荧光强度Fc(GSH)＝10nM。
本发明测定得到GSH与纳米金探针反应的标准曲线参见图1。从图1中可以看出对GSH检测的线性范围为10～180nM。