阅读说明：本技术 一种基于sers光谱技术的白血病融合基因检测方法 (leukemia fusion gene detection method based on SERS spectroscopy technology ) 是由 冯尚源 王运燚 贾香港 林学亮 许云超 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明构建一个特异性检测BCR-ABL融合基因(b3a2)的生物传感器,能够实现超高灵敏度白血病融合基因定量检测。主要的技术思路是利用表面增强拉曼光谱(SERS)极高的检测灵敏度,通过组装二维SERS基底后利用融合基因DNA的互补配对将AgNPs与SERS基底上的银纳米球耦连起来形成纳米间隙,两个纳米球互相耦合导致纳米间隙中电磁场非常强,这样就可以构筑具有极强SERS效应的热点结构,进而使标记分子拉曼信号获得巨大增强,最终可以得到超高灵敏度的SERS光谱检测结果。该检测方法能够很好的解决目前临床上检测方法灵敏度低、特异性弱等问题,为准确诊断慢性髓系白血病提供一种简单、快速、有效的检测手段。(The invention constructs biosensors for specifically detecting BCR-ABL fusion genes (b3a2), and can realize the quantitative detection of the leukemia fusion genes with ultrahigh sensitivity, the main technical idea is to utilize the extremely high detection sensitivity of Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), couple AgNPs and silver nanospheres on an SERS substrate by utilizing the complementary pairing of fusion gene DNA after assembling a two-dimensional SERS substrate to form a nanogap, and the mutual coupling of the two nanospheres leads to the extremely strong electromagnetic field in the nanogap, so a hot spot structure with extremely strong SERS effect can be constructed, further the marked molecular Raman signal is greatly enhanced, and finally the SERS spectrum detection result with ultrahigh sensitivity can be obtained.)

一种基于SERS光谱技术的白血病融合基因检测方法

技术领域

本发明属于生物医学白血病基因检测领域，具体涉及一种基于SER技术实现白血病融合基因（b3a2）超灵敏检测的方法。

背景技术

近年来，全球白血病发病率逐年上升，其中在美国，白血病的发病率排在所有癌症发病率的第八位。在我国，白血病在男性发病率排名第八位，在青少年群体发病率和死亡率排名第一。目前，医学上根据白血病细胞分化程度分为急性和慢性白血病。慢性髓系白血病(CML)是慢性白血病的一种，它的病理形成机制是位于人体第9号和第22号染色体长臂之间的Philadelphi染色体发生易位。具体的分子机制是位于正常人体的9号染色体长臂的ABL基因和位于正常人体的22号染色体BCR基因在染色体易位后发生重组产生BCR-ABL融合基因。其中，ABL基因，也被称为ABL1基因，是一种原癌基因，在肿瘤细胞中会和多种基因产生融合，其中和BCR基因融合是最常见的一种。它编码的酪氨酸激酶类蛋白分布在细胞核和细胞质中，这类蛋白与细胞的分化、***和信息传递等紧密相关。ABL基因编码的蛋白具有特殊的激酶活性，结合外界因素诱导细胞发生代谢紊乱进而发展成癌症。BCR基因编码丝氨酸/苏氨酸激酶类似物。BCR基因和ABL基因融合后形成的融合基因所表达的产物有很强的酪氨酸激酶活性，该融合基因能够使细胞的相关蛋白质酪氨酸磷酸化程度发生变化，同时构成细胞骨架的微丝肌动蛋白性能也会发生变化，细胞内的信号传递也会受到干扰，同时细胞凋亡受到抑制，细胞周期发生变化，细胞***变强，细胞的存活时间变长。数据显示，超过90%的慢性髓系白血病的血细胞中都有BCR-ABL融合基因的存在，因此，BCR-ABL融合基因可以作为临床上的对慢性髓系白血病的诊断标准。目前临床上检测BCR-ABL融合基因的方法包括染色体检测、荧光原位杂交 (FISH) 技术、实时定量RT-PCR技术、巢式RT-PCR和基因芯片技术等，但是这些技术方法受限于灵敏度低、消耗时间长、需要较高的操作要求以及容易出现假阳性结果等原因。

表面增强拉曼散射(SERS)自问世以来，受到许多领域科学家的关注，主要是因为SERS光谱检测灵敏度高，特异性强，谱峰的半峰宽较窄且能够提供丰富的分子指纹信息，损害低，耗时短、操作简便且携带方便。目前，SERS已经广泛应用于疾病诊断、毒品检测、食品安全、材料表征等领域。我们小组最近也在SERS光谱疾病诊断方面做了许多研究工作。通常认为，SERS对待测物的信号增强机制来源于物理增强和化学增强，且物理增强贡献绝大部分。贵金属纳米材料因为具有表面等离激元共振效应而常常作为SERS信号增强基底，其中银纳米材料的等离激元共振效应较强且在实际应用中较多。研究发现，SERS效应最强的位置位于纳米颗粒之间的间隙，称为“热点”。合理的利用和构筑“热点”是当前SERS研究的前沿问题，也是推进SERS在更多领域应用的基础。一般认为，纳米材料对SERS信号增强效果的影响主要通过以下几个方面：颗粒的尺寸、形貌、分散性、均匀性以及与待测物的结合方式等。因此，一种易制得的、重现性好、灵敏度高、稳定性强和经济的SERS基底一直是从事SERS研究人员所追求的目标，同时也是阻碍推广到更多领域应用所面临的关键问题。

发明内容

相较于上述临床上检测BCR-ABL融合基因的方法，SERS刚好可以解决它们所面临的一些问题。本发明中，首先合成带负电的银纳米粒子(AgNPs)，同时用硅烷偶联剂修饰羟基化的二氧化硅片，然后将硅片放入水中质子化，再将带负电的AgNPs组装在二氧化硅片上。接着，再合成带正电的AgNPs，将与BCR-ABL融合基因的互补序列两段分别组装在二氧化硅片SERS基底上和带正电的AgNPs，组装在带正电的AgNPs的DNA片段修饰有Cy5拉曼标记分子。当目标序列BCR-ABL融合基因出现时，拉曼标记分子Cy5刚好位于两个银纳米球形成的“热点”位置，设置不同浓度的BCR-ABL融合基因(b3a2)标样，根据拉曼标记分子Cy5的SERS光谱强度变化可以实现BCR-ABL融合基因(b3a2)的高灵敏定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于SERS技术实现白血病融合基因（b3a2）检测的方法，包括如下步骤：

1）制备SERS基底

1-1）合成表面带负电的AgNPs：利用还原剂柠檬酸钠还原硝酸银合成胶体银：将体积为100mL，浓度是1mM的AgNO₃溶液在剧烈搅拌下加热煮沸沸腾后加入3mL的质量分数为1%柠檬酸钠。保持液体沸腾持续加热搅动60分钟，颜色变成黄绿色

1-2）制备表面羟基化的二氧化硅片：将二氧化硅片裁剪成4mm×4mm的大小，然后分别在丙酮、乙醇和超纯水中各超声10分钟。取出干燥后，将二氧化硅片浸泡在新鲜配制的食人鱼溶液（浓硫酸和30%过氧化氢的7:3比例下的混合液）中，并加热到150℃保持30分钟。冷却后，用超纯水清洗，放置晾干，即完成二氧化硅片的表面羟基化。

1-3）完成硅烷偶联剂氨基基团的质子化：取150μL硅烷偶联剂分散在150mL的乙醇中，然后将表面羟基化的二氧化硅片浸泡在该溶液中12h，取出后用大量水清洗取出未修饰上的硅烷偶联剂。将上述二氧化硅片晾干后放入超纯水中浸泡8h，即可完成硅烷偶联剂氨基基团的质子化。

1-4）制备基底：取步骤1）新合成的银纳米粒子370μL，将质子化后的二氧化硅片浸泡在里面4h，取出用超纯水清洗，即可得到SERS基底。

2）合成表面带正电的AgNPS

取浓度为1.1×10^-3mol/L的AgNO₃溶液90ml，放入到锥形瓶中搅拌。分别取6×10^-2mol/L盐酸羟胺5ml，0.1mol/L氢氧化钠4.5ml，两者混合后迅速加入到90mlAgNO₃溶液中，锥形瓶中溶液由无色变为灰色。

3）SERS检测传感器的组装

3-1) 分别取20μL 1 μM的捕获序列和20 μL 1μM 信号序列放入到20μL的TCEP（5mM）和50μL Tris-HCl缓冲液(1M,PH=7.4)的混合溶液中来活化巯基。反应1小时后，用捕获序列溶液浸泡二氧化硅SERS基底，将信号序列溶液与一定量带正电AgNPs混合，同时在室温下静置过夜，再分别加入20μL 1 μM 6-巯基-1-己醇反应3h，然后用大量水分别清洗除去未特异性结合的序列，即完成巯基的修饰。

3-2) 将修饰有信号序列的带正电AgNPs溶液加入到二氧化硅SERS基底中，加入不同浓度的目标序列，反应4h后，清洗二氧化硅SERS基底，常温干燥后为接下来的SERS测量做准备。

捕获序列、信号序列和目标序列的碱基序列如下：

（1）捕获序列：

5’-SH-TTTTTCCCAACCCAACCCTCCTTGGAGTTCCAACGAGCGGCTTCACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGATGCTACTGGCCGCTGAAGGGCTT-3’；

（2）信号序列:

5’- Cy5-TTGAACTCTGCTTAAATC-SH-3’;

（3）目标序列：

GATTTAAGCAGAGTTCAA（融合点）AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAGGGTTGGGTTGGGAAAAA。

本发明的有益效果在于：本发明利用二氧化硅作为基板，采用带负电的银纳米粒子（AgNPs）作为表面增强拉曼散射检测的基底，经过后续处理形成一个特异性检测BCR-ABL融合基因（b3a2）的生物传感器。利用硅烷偶联剂修饰二氧化硅片，并使其质子化，吸附合成的带负电的银纳米粒子，最终通过银和氨基行成化学键牢固组装在二氧化硅片上构建二维SERS基底。将信号链和捕获链分别修饰在带正电的AgNPs和SERS基底上，加入带有Cy5拉曼标记分子的信号链后，三段链结合在一起形成一个SERS检测传感器，通过检测Cy5的拉曼光谱信号实现对BCR-ABL融合基因(b3a2)定量检测。同时，DNA的互补配可以将带正电的AgNPs与SERS基底上的AgNPs耦合起来与Cy5拉曼标记分子形成类似三明治结构纳米间隙，构筑具有极强SERS效应的“热点”结构，使等离激元共振的效果显著增强，进而使处于热点结构中的标记分子拉曼信号获得巨大增强，最终得到高灵敏SERS光谱检测结果。

附图说明

图1为SERS光谱检测BCR-ABL融合基因的实验示意图。

图2为带负电和带正电的AgNPs的紫外-可见吸收光谱及扫描电镜图；其中，（A）为带负电与带正电的AgNPs的紫外-可见吸收光谱，（B）为带负电的AgNPs的透射图，（C）为带正电的AgNPs的TEM图谱。

图3为组装有带负电AgNPs的二氧化硅片的扫描电镜图。

图4为R6G溶液SERS光谱检测的结果；其中（A）为点滴法与浸泡法测R6G的SERS光谱，（B）为点滴法检测测R6GSERS光谱611 cm^-1峰值强度变化，（C）浸泡法检测测R6G SERS光谱611 cm^-1峰值强度变化。

图5为BCR-ABL融合基因(b3a2)的SERS光谱定量检测结果；其中（A）为不同浓度的BCR-ABL融合基因(b3a2) SERS谱图，（B）为Lg(C_Target)和谱峰强度之间的线性关系。

具体实施方式

以下将结合具体实施例与附图对本发明做进一步说明。

1.试剂

硝酸银(AgNO₃)、盐酸羟胺(HO-NH₂•HCl)、硫酸(H₂SO₄)、无水乙醇、盐酸(HCl)购于国药集团化学试剂有限公司，硅烷偶联剂（γ-氨丙基三乙氧基硅烷）购于山东优索化工科技有限公司，二水合柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)、氢氧化钠(NaOH)、30%过氧化氢(H₂0₂)购于西陇科学股份有限公司，4-氨基苯硫酚(4-ATP)、三（2-羧乙基）膦(TCEP)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，6-巯基-1-己醇(MCH)购于百灵威科技有限公司，罗丹明6G(R6G)购买于Sigma公司，二氧化硅片购于江苏飞舟玻塑有限公司,本实验用到的DNA序列购于上海生工生物工程股份有限公司。所有试剂都为分析级，未进一步纯化。

2.表面带负电AgNPs合成

采用Lee和meisel(Lee P C, Meisel D. Adsorption and surface-enhanced Ramanof dyes on silver and gold sols[J]. The Journal of Physical Chemistry, 1982,86(17): 3391-3395.)等制备胶体银的方法，利用还原剂柠檬酸钠还原硝酸银合成胶体银。本发明体积为100mL，浓度是1mM的AgNO₃溶液在剧烈搅拌下加热煮沸沸腾后加入3mL的质量分数为1%柠檬酸钠。保持液体沸腾持续加热搅动60分钟，颜色变成黄绿色。

3.SERS基底的制备

1) 将二氧化硅片裁剪成4mm×4mm的大小，然后分别在丙酮、乙醇和超纯水中各超声10分钟。取出干燥后，将二氧化硅片浸泡在新鲜配制的食人鱼溶液（浓硫酸和30%过氧化氢的7:3比例下的混合液）中，并加热到150℃保持30分钟。冷却后，用超纯水清洗，放置晾干，即完成二氧化硅片的表面羟基化。

2) 取150μL硅烷偶联剂（γ-氨丙基三乙氧基硅烷）分散在150mL的无水乙醇中，然后将表面羟基化的二氧化硅片浸泡在该溶液中12h，取出后用大量水清洗取出未修饰上的硅烷偶联剂。

3) 将上述二氧化硅片晾干后放入超纯水中浸泡8h，完成硅烷偶联剂氨基基团的质子化。取步骤2新合成的表面带负电的银纳米粒子370μL，将质子化后的二氧化硅片浸泡在里面4h，取出用超纯水清洗。

4.表面带正电AgNPS合成

取浓度为1.1×10^-3mol/L的AgNO₃溶液90ml，放入到锥形瓶中搅拌。分别取6×10^-2mol/L盐酸羟胺5ml，0.1mol/L氢氧化钠4.5ml，两者混合后迅速加入到90mlAgNO₃溶液中，锥形瓶中溶液由无色变为灰色。

5.SERS检测传感器的组装

1) 分别取20μL 1 μM的捕获序列和20 μL 1μM 信号序列放入到20μL的TCEP（5mM）和50μL Tris-HCl缓冲液的混合溶液中来活化巯基。反应1小时后，用捕获序列溶液浸泡二氧化硅SERS基底，将信号序列溶液与500μL带正电AgNPs混合，同时在室温下静置过夜。

2) 分别加入20μL 1 μM6-巯基-1-己醇反应3h，然后用大量水分别清洗除去未特异性结合的序列，即完成巯基的修饰。将修饰有信号序列的带正电AgNPs溶液加入到二氧化硅SERS基底中，加入不同浓度的目标序列（10^-6到10^-12七个浓度梯度的BCR-ABL融合基因(b3a2)的标样），反应4h后，清洗二氧化硅SERS基底，常温干燥后进行拉曼光谱检测。所用拉曼光谱仪为Renishaw inVia Raman microscope (Renishaw plc, UK)，激光是波长为785nm半导体激光器。

捕获序列、信号序列和目标序列的碱基序列如下：

（1）捕获序列：

5’-SH-TTTTTCCCAACCCAACCCTCCTTGGAGTTCCAACGAGCGGCTTCACTCAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGATGCTACTGGCCGCTGAAGGGCTT-3’；

（2）信号序列:

5’- Cy5-TTGAACTCTGCTTAAATC-SH-3’;

（3）目标序列：

GATTTAAGCAGAGTTCAA（融合点）AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAGGGTTGGGTTGGGAAAAA。

本发明通过紫外-可见吸收光谱和扫描电镜来表征合成的带负电和带正电的AgNPs。图2（A）是带负电的AgNPs的紫外－可见吸收光谱，其等离激元共振峰的位置在412nm，而带正电的AgNPs的离激元共振峰的位置在423nm。从TEM图中可以看到，带负电的AgNPs平均粒径在77±5nm（图2B），带正电AgNPs平均粒径在27±10nm（图2C）。

由于硅烷偶联剂修饰在二氧化硅片上后，有一个氨基暴露在外面，质子化处理后使得二氧化硅片表面带正电，与带负电的AgNPs相互吸引，最后与氨基成键，提高了组装的效率。从图3中可以看出，带负电的AgNPs均匀的组装在二氧化硅片上，由于带负电的AgNPs之间相互排斥，粒子间分散排列，保持着一定的间距，粒子聚集较少，同时整个二氧化硅片上粒子组装的密度大。

为了使本发明中的得到的实验数据更具可靠性和重复性，我们对使用两种方法测试得到的罗丹明(R6G) SERS光谱进行比较。使用制备好的二氧化硅SERS基底，分别采取浸泡和点滴两种方法检测10^-6mol/L的R6G，最后R6G溶液SERS光谱检测的结果如图4所示。图4（A）中，黑色曲线是点滴的方法得到的SERS光谱，红色曲线是浸泡的方法得到的R6G溶液SERS光谱，每个光谱是取自十个随机点的平均值。图4（B）是点滴法中随机取十个点R6G溶液SERS光谱对应的611cm^-1峰值强度变化，图4（C）是浸泡法中随机取十个点R6G溶液SERS光谱对应的611 cm^-1峰值强度变化情况，其中611cm^-1峰值可归属为C-C-C环的面内弯曲振动模型。综合图4中的三张数据图，虽然点滴法的谱峰强度更强，但是从相对标准偏差(RSD)上分析，滴法受到“咖啡环”效应的影响较大，而浸泡法受到“咖啡环”效应的影响较小。所以本研究后续数据采用的都是浸泡法。同时，RSD数据上也验证了本研究中SERS基底较好的均匀性和重现性。

本研究取了10^-6到10^-12七个浓度梯度的BCR-ABL融合基因(b3a2)的标样，进行BCR-ABL融合基因(b3a2)的SERS光谱定量检测，得到结果如图5所示。选取691cm^-1波数位置的Cy5SERS光谱特征峰与目标链浓度进行线性拟合，得到拉曼信号强度I与目标链浓度的对数Lg(C_-Target)之间的线性关系：

I=5.9832×10^-4Lg(C_-Target)+0.00822，经计算，这种检测方法的检测限(LOD)可达到42.28fM，而据报道称实时荧光定量PCR检测方法的检测限为10^-5~10^-6 M，相比较下我们的方法检测限提高了8个数量级。所以本方法可以实现BCR-ABL融合基因(b3a2)超灵敏SERS光谱检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建师范大学

<120> 一种基于SERS光谱技术的白血病融合基因检测方法

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttcccaa cccaaccctc cttggagttc caacgagcgg cttcactcag accctgaggc 60

tcaaagtcag atgctactgg ccgctgaagg gctt 94

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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