苯乙醇在促进植物生长、诱导植物抗病性、抑制植物病原菌生长和植物病害防治中的应用
阅读说明：本技术 苯乙醇在促进植物生长、诱导植物抗病性、抑制植物病原菌生长和植物病害防治中的应用 (Application of phenethyl alcohol in promoting plant growth, inducing plant disease resistance, inhibiting plant pathogenic bacteria growth and preventing and controlling plant diseases ) 是由 张福丽 刘畅 韩博 宋昊跃 吴长景 庞丽 余宁树 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及苯乙醇在促进植物生长、诱导植物产生抗病性、抑制植物病原菌生长和植物病害防治中至少一方面的应用。本发明从棘孢木霉次级代谢产物中分离提纯得到苯乙醇,该化合物可应用于促进植物生长及提高植物抗病性同时还能抑制植物病原菌生长,也可用于植物生长调节剂和生物农药的开发。(The invention relates to application of phenethyl alcohol in at least one aspect of promoting plant growth, inducing plant to generate disease resistance, inhibiting the growth of plant pathogenic bacteria and preventing and treating plant diseases. The phenethyl alcohol is obtained by separating and purifying the secondary metabolite of trichoderma asperellum, can be applied to promoting the growth of plants, improving the disease resistance of the plants, inhibiting the growth of plant pathogenic bacteria, and can also be applied to the development of plant growth regulators and biological pesticides.)
技术领域
本发明涉及苯乙醇在促进植物生长、诱导植物产生抗病性、抑制植物病原菌生长和植物病害防治中至少一方面的应用，尤其是关于一种利用棘孢木霉次级代谢产物中分离纯化得到的苯乙醇在促进植物生长、诱导植物产生抗病性、抑制植物病原菌生长以及植物病害防治中的新用途。
背景技术
木霉菌次级代谢产物的抑菌作用是木霉菌拮抗植物病原菌的机制之一。目前，对木霉菌次级代谢产物在抑制病原菌活性方面的报道比较多。相关研究表明，从哈茨木霉中分离到的化合物6-戊基-2H-吡喃-2-酮 (6-pentyl-2H-pyran-2-one，6-PP)、1,2-二溴-4-叔丁基苯(harzianopyridone)、 2(5H)-呋喃酮(2(5H)-furanone)和δ-癸内酯(δ-decanolactone)对菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)等植物病原菌均具有显著的抑制效果，其中6-PP在多种木霉菌菌株中被发现，包括深绿木霉(Trichodermaatroviride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)和绿色木霉(Trichoderma viride)等。哈茨木霉T22的 azaphilone、T39的butenolide对引起油菜茎基溃疡病菌的十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、樟疫霉菌(Phytophthoracinnamomi)和灰霉病菌(Botrytis cinerea)具有明显的抑制作用。来自哈茨木霉的harzianic acid 对核盘菌(S.sclerotiorum)和畸雌腐霉(Pythium irregulare)抑制效果较显著。来自长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的麦角素A(ergokonin A) 对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)均具有抑制作用。Andrade等从长枝木霉(T.longibrachiatumRifai aggr)中分离的5-hydroxyvertinolide和 bislongiquinolide能够抑制咖啡美洲叶斑病菌(Mycenacitricolor)。还有研究表明长枝木霉中的10,11-dihydrocyclonerotriol、catenioblin C和sohirnone A 具有抑制稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)的活性。Shentu等在脐孢木霉(Trichoderma brevicompactum)的培养液中分离到了木霉素(trichodermin， 4β-乙酰氧基-12,13-环氧基-Δ9-毛皮烯)，该物质对立枯丝核菌(R.solani)、水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucmeris)和炭疽菌(Colletotrichumlindemuthianum)具有抑制作用，EC50分别为0.25μg/mL、2.02μg/mL和 25.60μg/mL。Vinale等从奶油木霉(Trichoderma cremeum)中分离得到一种十元内脂cremenolide，该化合物抑制了尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、灰霉病菌(B.cinerea)和茄核丝菌(R.solani)的径向菌丝生长。
木霉菌次级代谢产物不仅能起到抗生素的作用抑制植物病原菌生长，还能够起到生长调节剂的作用来促进植物生长和诱导植物对病原微生物产生系统抗性。来自奶油木霉的cremenolide对番茄幼苗生长具有显著促进作用。来源于哈茨木霉的harzianic acid浓度为100μg和10μg时抑制了油菜种子根和茎的生长，但是在浓度为100ng、10ng和1ng时具有明显的促进生长的作用。来源于哈茨木霉的harzianolide能够促进番茄、油菜和小麦的生长。6-PP除了能抑制病原菌的生长，还具有促进植物生长、调节根系结构、诱导植物产生系统抗性等功能。Garnica等研究表明，6-PP处理拟南芥根部，调控了生长素转运蛋白PIN信号转导元件TIR1、AFB2和AFB3，以及乙烯反应调节因子EIN2的响应。从哈茨木霉中分离得到的6-戊基-α-吡喃酮(6-pentyl-α-pyrone，6-PAP)能够抑制黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型的生长，并能诱导黄瓜对病原菌的抗病性。El-Hasan等发现6-PAP 在高浓度(200-300mg/L)浸种处理玉米种子时抑制了玉米种子的生长，但是相同的使用浓度在温室条件下促进了玉米的生长，并通过提高玉米体内的抗性酶活性来提高玉米的抗性。Pascale等从哈茨木霉M10和深绿木霉 P1分别分离得到harzianic acid和6-PP，发现两种化合物均可以减轻葡萄白粉病的发病率，增加葡萄的产量，同时还能提高葡萄的抗氧化能力。Mónica 等在拟康氏木霉中分离到一种物质aspinolides C，发现该物质的使用可以显著诱导番茄体内JA通路的PINI、PINII和TomLoxA基因的表达。根据之前研究者的发现，对于木霉菌次级代谢产物的挖掘主要集中在抑制病原菌活性的分析上。而且，木霉菌次级代谢产物的功能不是单一的，可以拥有一个或多个有益的功能。目前，将木霉菌次级代谢产物应用于促进植物生长和诱导植物产生抗病性的研究还比较少，因此对木霉菌次级代谢产物的研究有待进一步探索。
农作物病害是农业生产上对农作物产量的重大威胁。为防治和减少病害的发生，部分地区长期施用农药。我国耕地面积占全球的8％，但化学农药的施用量却占了全球的三分之一。在减少农药施用的前提下使作物不减产，还需要提高植物自身的抗病性，从而达到抗病的效果。木霉菌作为一种重要的生防菌被广泛的应用于农业生产中。目前，在木霉菌中已发现了几百种具有不同功能的次级代谢产物，但是关于这些次级代谢产物的活性分析主要集中在抑菌活性、抗肿瘤活性、细胞毒性等生物活性的初步探索上，应用于植物生长调节和抗性方面的研究还相对较少。
苯乙醇是一种芳香醇，被广泛的应用于增塑剂、防腐剂、香料、肥皂、药物、染料等制造工业生产中，相关报道表明苯乙醇具有多种生物活性，包括抗菌、抗癌、抗炎、神经保护和抗哮喘等活性。在促进植物生长和提高植物抗病性方面鲜有报道。全球苯乙醇年产量约在1万吨，其中大部分是由苯或苯乙烯通过化学合成获得的。化学合成方法不但造价高，而且对环境不友好，并且会产生不需要的副产物，合成效率较低。物理提取法可以从植物中提取天然的苯乙醇，但由于植物资源有限、提取效率低等原因，不能满足市场的大规模需求。微生物转化法合成苯乙醇，不仅能够满足市场需求，而且得到的产品天然安全，正在成为合成天然苯乙醇的新趋势。微生物转化法生产苯乙醇的菌株主要有酵母菌、真菌和细菌，其中常用的有酿酒酵母(Rattus norvegicus)和大肠杆菌(Escherichia coli)。利用木霉菌株产生苯乙醇的报道相对较少，如曾婀娜等人用里氏木霉在以麸皮、脱脂米糠、葡萄糖等为培养基质的发酵物中分离得到了β-苯乙醇。但是尚未有将苯乙醇应用于促进植物生长和提高植物抗病性方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供苯乙醇在促进植物生长、诱导植物产生抗病性、抑制植物病原菌生长和植物病害防治中至少一方面的应用。本发明从棘孢木霉次级代谢产物中分离提纯得到苯乙醇，该苯乙醇可应用于促进植物生长及提高植物抗病性同时还能抑制植物病原菌生长。该化合物可用于植物生长调节剂和生物农药的开发。
为了实现上述目的，本发明提供苯乙醇在促进植物生长、诱导植物产生抗病性、抑制植物病原菌生长和植物病害防治中至少一方面的应用。
根据本发明一种优选实施方式，所述苯乙醇为棘孢木霉源苯乙醇，所述棘孢木霉源苯乙醇从棘孢木霉发酵物中分离得到，结构如式I所示。
根据本发明，优选地，所述棘孢木霉源苯乙醇由包括如下步骤的制备方法得到：将棘孢木霉(Trichoderma asperellum)进行发酵培养，得到含有苯乙醇的发酵物，将发酵物进行分离纯化，得到所述棘孢木霉源苯乙醇。
根据本发明，优选地，所述棘孢木霉为棘孢木霉CBS 433.97；保藏号为ACCC30536，购自中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)。
根据本发明，优选地，所述分离纯化包括萃取、柱层析和高效液相制备。
根据本发明，优选地，所述棘孢木霉源苯乙醇由包括如下步骤的制备方法得到：
1)将所述棘孢木霉CBS 433.97进行大米固体发酵培养，获得发酵物；
2)将所述发酵物用乙酸乙酯超声浸提、过滤，滤液经减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；
3)将所述乙酸乙酯总浸膏用硅胶柱层析分离，得到含有所述木霉源苯乙醇的柱层析组分；所述硅胶柱层析分离优选依次采用石油醚、二氯甲烷、甲醇进行梯度洗脱；
4)将所述含有木霉源苯乙醇的柱层析组分进行HPLC分离。
根据本发明一种
具体实施方式
，将上述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CBS433.97接种于大米培养基中进行发酵培养，室温(25-30℃) 静置培养34天。将发酵好的发酵物(体积约为2L)放入体积为4L的玻璃罐中，加入2L乙酸乙酯，超声波超声30min(乙酸乙酯萃取与超声重复3次)。收集乙酸乙酯萃取液并用旋转蒸发仪进行减压浓缩(45℃)，得到物质即为总浸膏，4℃冰箱保存备用。采用正相硅胶柱层析的方法，石油醚-二氯甲烷-甲醇洗脱体系获得了22组流分，通过半制备液相色谱仪在7 号流分中分离纯化得到化合物苯乙醇(40％甲醇，流速10mL/min，检测波长：210nm，500mg，tR＝23.9min)。通过核磁共振色谱技术度化合物结构进行鉴定，所得化合物结构式为式(Ι)所示，鉴定为苯乙醇。
根据本发明另一种实施方式，所述苯乙醇为含有棘孢木霉源苯乙醇的棘孢木霉发酵物的提取物。
根据本发明，优选地，所述提取物由包括以下步骤的方法制得：
i)将所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CBS 433.97进行大米固体发酵培养，获得发酵物；
ii)将所得发酵物用乙酸乙酯超声浸提、过滤，滤液经减压浓缩至干，得到乙酸乙酯总浸膏；
iii)将所述乙酸乙酯总浸膏用硅胶柱层析分离，得到含有所述木霉源苯乙醇的柱层析组分，即为所述提取物。
本发明中所述植物优选为小麦和苦瓜。
本发明所述新用途中，促进植物生长包括促进小麦和苦瓜幼苗的生长。
本发明所述新用途中，抑制植物病原菌生长包括抑制小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)PH-1和苦瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌苦瓜转化型(Fusariumoxysporum f.sp.Momordicae)的生长以及抗氧化酶系统。
本发明所述新用途中，诱导植物产生抗病性包括诱导小麦对赤霉病产生抗病性；诱导苦瓜对苦瓜枯萎病产生抗病性。
本发明所述新用途中，植物病害防治包括采用喷施预防的方法减轻了小麦赤霉病的发病率，当苯乙醇浓度为300mg/L时，在温室中对赤霉病的防效为62.28％，在大田中对赤霉病的防效为36.53％。
本发明中，所述苯乙醇应用于上述用途时，优选采用溶液形式，其浓度为0.1-300mg/L；具体地，当应用于促进植物生长时，其浓度为0.1-10 mg/L，当应用于病害防治的温室和田间实验时，其浓度为10-300mg/L。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的如式(Ι)所示的化合物具有明显的促进小麦株高和根长；促进苦瓜株高、根长、根数和叶片大小的作用。
2.本发明所述的如式(Ι)所示的化合物具有明显的抑制小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)PH-1和苦瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌苦瓜转化型(Fusariumoxysporum f.sp.Momordicae)的生长以及抗氧化酶系统。
3.本发明所述的如式(Ι)所示的化合物具有明显的诱导小麦和苦瓜产生抗病性、显著上调小麦抗病相关基因表达的作用。
4.本发明所述的如式(Ι)所示的化合物具有明显的防治小麦赤霉病和苦瓜枯萎病的作用。
5.本发明所述的如式(Ι)所示的化合物由微生物转化法合成，可实现大规模生产，而且得到的产品天然安全。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1和图2分别示出了本发明从棘孢木霉(Trichoderma asperellum) CBS 433.97发酵物乙酸乙酯提取物中分离得到的苯乙醇的1H NMR谱图和13C NMR谱图。
图3示出了木霉源苯乙醇对小麦幼苗生长的影响；a)小麦幼苗生长状况，b)小麦生长指标。注：不同小写字母表示p＜0.05水平下差异显著，柱形图数值为3次重复的平均值±SD。
图4示出了木霉源苯乙醇对禾谷镰刀菌PH-1菌落生长的抑制作用；a) 不同浓度的苯乙醇在培养不同天数对禾谷镰刀菌PH-1的抑菌率，b)禾谷镰刀菌PH-1培养不同天数的生长情况。注：不同小写字母表示在p<0.05 水平下差异显著，柱形图数值为3次重复的平均值±SD。
图5示出了木霉源苯乙醇对病原菌胁迫下小麦生理指标的影响；a)PPO 活性，b)POD活性，c)游离脯氨酸含量d)MDA含量。注：不同小写字母表示p＜0.05水平下差异显著，柱形图数值为3次重复的平均值±SD。
图6示出了木霉源苯乙醇对小麦抗病相关基因的影响；a)LTP-1，b： P5CS，c)PR1.1，d)PR4，e)Chi1，f)Glu1。注：不同小写字母表示p ＜0.05水平下差异显著，柱形图数值为3次重复的平均值±SD。
图7示出了木霉源苯乙醇处理后小麦赤霉病发病程度。
图8示出了不同浓度苯乙醇处理下大田小麦赤霉病发病程度。
图9示出了木霉源苯乙醇对苦瓜幼苗生长的影响；a-c)苦瓜幼苗生长状况，d)苦瓜幼苗根长，e)苦瓜幼苗根数，f)苦瓜株高，g)苦瓜幼苗叶片大小。注：不同小写字母表示p＜0.05水平下差异显著，柱形图数值为3 次重复的平均值±SD。
图10示出了木霉源苯乙醇对尖孢镰刀菌菌落生长的抑制作用；a)不同浓度的苯乙醇在培养不同天数对尖孢镰刀菌的抑菌率，b)尖孢镰刀菌培养不同天数的生长情况。注：不同小写字母表示在p<0.05水平下差异显著，柱形图数值为3次重复的平均值±SD。
图11示出了木霉源苯乙醇对病原菌胁迫下苦瓜生理指标的影响；a) PPO活性，b)POD活性，c)游离脯氨酸含量，d)MDA含量。注：不同小写字母表示p＜0.05水平下差异显著，柱形图数值为3次重复的平均值± SD。
图12示出了不同浓度苯乙醇处理下温室苦瓜枯萎病发病程度(盆栽)。
图13示出了不同浓度苯乙醇处理下温室苦瓜枯萎病发病程度(植株)。
图14示出了不同浓度苯乙醇处理下温室苦瓜枯萎病发病程度(维管束)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行所用试剂或仪器未标明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
在以下实施例中，所称木霉源苯乙醇，系本发明从棘孢木霉 (Trichodermaasperellum)CBS 433.97发酵物乙酸乙酯提取物中分离得到，并首次发现其促进植物生长和提高植物抗病性的功能。
实施例1：微生物发酵培养与苯乙醇的制备
1.发酵培养与发酵物的提取处理
1)生产菌株
本实施例中用于发酵生产苯乙醇的产生菌是棘孢木霉(Trichodermaasperellum)CBS 433.97，购自中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)，保藏号为ACCC30536。
2)发酵培养
按微生物培养的常用方法，在无菌条件下用接种环在菌落边缘挑取一块棘孢木霉CBS 433.97菌丝体于PDA培养基中间，28℃倒置培养3天。用直径为6mm的打孔器在活化好的平板菌落边缘打取一块菌饼接种于100 mL PD培养基中，28℃、180rpm震荡培养7天。在超净工作台中用无菌纱布对棘孢木霉CBS 433.97培养液进行过滤，在光学显微镜下用血球计数板对棘孢木霉CBS 433.97滤液中的孢子进行计数，然后用无菌蒸馏水稀释滤液至孢子含量为2×108个/mL的孢子悬液，将制备好的大米培养基每瓶中加入1mL上述的孢子悬液，室温(25-30℃)静置培养34天。
2.提取处理与乙酸乙酯浸膏的制备
将发酵好的发酵物(体积约为2L)放入体积为4L的玻璃罐中，加入 2L乙酸乙酯，超声波超声30min(乙酸乙酯萃取与超声重复3次)。收集乙酸乙酯萃取液并用旋转蒸发仪进行减压浓缩(45℃)，得到乙酸乙酯总浸膏62g，4℃冰箱保存备用。
3.乙酸乙酯浸膏的柱层析分离与含有木霉源苯乙醇的柱层析组分的制备
将上述乙酸乙酯浸膏62g用二氯甲烷-甲醇(v/v 1:1)200mL溶解，加入180g层析硅胶吸附拌样，减压蒸干后，添加到预装硅胶玻璃减压柱(360 g硅胶，柱床)上，用石油醚→二氯甲烷→甲醇系统进行梯度洗脱层析，得到22组馏分，其中7号馏分中含有苯乙醇。
4.苯乙醇的HPLC制备
通过半制备液相色谱仪在7号馏分中分离得到苯乙醇(40％甲醇，流速10mL/min，检测波长：210nm，500mg，tR＝23.9min)，分离所得苯乙醇的1H NMR谱图如图1所示，13C NMR谱图如图2所示。
实施例2：木霉源苯乙醇对小麦的促生作用
挑选籽粒饱满的小麦种子用45℃温水浸泡2小时，然后将小麦种子均匀的放入无菌的培养皿(90mm)中，培养皿底部铺有一层滤纸片，每个皿 50颗小麦种子。将苯乙醇分别配制成0.1mg/L、1mg/L、10mg/L的溶液，吸取5mL配制好的各个浓度的溶液分别加入到培养皿中，对照为等量蒸馏水，每个处理3个重复。室温培养一段时间后测量根长、株高和根数。结果如图3所示。
用不同浓度的苯乙醇处理小麦种子后，在小麦发芽后第8天时，测量小麦幼苗的根数、根长和株高来评估苯乙醇是否对小麦具有促进生长的作用。当苯乙醇浓度为0.1-10mg/L时，对小麦根数无明显影响(图3的b)，显著的促进了小麦的根和株高的生长(p＜0.05)，当苯乙醇浓度为10mg/L 时，促进效果最明显，根长增长了23％(图3的b)，株高增长了19.2％。(图3的b)。
实施例3：木霉源苯乙醇提高小麦抗赤霉病
1)木霉源苯乙醇对禾谷镰刀菌PH-1菌丝生长的影响
采用含药培养基法，将木霉源苯乙醇加入PDA培养基(45-55℃)中，配制成浓度为0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的含药培养基，倒板。在培养3天的病原菌平板的边缘打取一个6mm的菌饼，接种于含药培养基中央，28℃培养，并记录菌落直径，每组实验3个重复。
由图4可以看出，苯乙醇对禾谷镰刀菌具有抑制作用，并且随着浓度的升高抑制效果增强。当苯乙醇浓度为300mg/L时，在禾谷镰刀菌生长第 2-4天的抑制率分别为28.24％、30.82％和24.55％(图4的a)
2)木霉源苯乙醇对小麦生理指标的影响
采用实施例2中的方法对小麦种子进行处理，室温培养72h后将小麦苗移栽到花盆中，每盆200g土，在盆中生长3天后，用接种针将小麦苗胚轴中间刺破，滴加10μL PH-1菌液(孢子数为2×107个/mL)。在小麦接种病原菌后7天测定小麦叶片内的PPO、POD活性、游离脯氨酸含量和丙二醛含量。
小麦幼苗接种小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌PH-1后第7天，测定小麦叶片的PPO和POD活性，游离脯氨酸含量和丙二醛含量。苯乙醇处理对小麦的PPO活性无显著影响(图5的a)，苯乙醇浓度为10mg/L时，增加了小麦的POD活性(图5的b)，增加了小麦叶片内的脯氨酸含量(图5的c)，同时减少了丙二醛的含量(图5的d)，POD活性提高了148.3％，游离脯氨酸含量提高了16.4％，丙二醛与对照相比减少了6.9％。
3)木霉源苯乙醇对小麦抗病基因的影响
采用2)中方法在小麦接种病原菌后7天，进行相关抗病基因表达分析。 6个相关抗病基因分别为：TaActin、TaLTP-1、TaP5CS、TaChi1、TaPR1.1、TaPR4 TaGlu1。
苯乙醇处理后，6个基因的表达量均上调，但是不同浓度的苯乙醇处理对各个基因的表达量的影响不同。当苯乙醇浓度为10mg/L时，LTP-1、P5CS 和Glu1的表达均上调，与对照相比分别提高了5.36倍、2.9倍和6.7倍(图 6的a-b，f)。当苯乙醇浓度为1mg/L时，PR4和Chi1的表达上调，与对照相比分别提高了52.13倍和18.74倍(图6的d-e)。当苯乙醇浓度为0.1 mg/L时，PR1.1的表达上调，与对照相比提高了312.7倍(图6的c)。
实施例4：木霉源苯乙醇对小麦苗期赤霉病的防效
1)小麦赤霉病病麦粒的制备
将小麦种子用蒸馏水浸泡2小时，然后将种子装入锥形瓶中进行灭菌， 121℃，15min。然后在锥形瓶中接种1mL小麦赤霉病病原菌孢子悬液，孢子悬液的制备方法与实施例1中的方法一致，在28℃培养箱中培养7天，每天晃动一次，放置4℃冰箱保存备用。
2)将苯乙醇分别配制成浓度为10mg/L、100mg/L、300mg/L的药液备用
3)小麦苗期赤霉病防效试验
将小麦种子用50℃的温水浸泡2小时，然后均匀的种在花盆中，每盆 20颗小麦种子，待小麦发芽7天后，将步骤2)中不同浓度的苯乙醇溶液喷施于小麦叶片，每组3个重复，每3盆喷施药液10mL，阳性对照为250 mg/L恶霉灵，阴性对照为水。喷洒药液1天后将病麦粒接种于小麦根部，每株一颗病麦粒，根据小麦幼苗叶鞘发病情况对发病程度进行分级，病情指数及防效计算方法见公式①和②：
0级：无症状；
1级：外层叶鞘有明显的褐色或黑褐色斑，病斑小于1/2直径；
3级：外层叶鞘有明显的褐色或黑褐色斑，病斑大于1/2直径，但内层叶鞘无症状；
5级：内层叶鞘有明显的褐色或黑褐色斑，病斑小于1/2直径；
7级：内层叶鞘有明显的褐色或黑褐色斑，病斑大于1/2直径，但植株不死苗；
9级：植株死苗。
不同浓度苯乙醇处理后小麦的发病情况如图7所示，当苯乙醇浓度为 300mg/L时，小麦的发病率、病斑大小和病情指数与水处理相比均具有显著性差异，依次降低了66.08％、40％和62.28％，小麦的发病率、病斑大小与恶霉灵相比具有显著性差异，依次降低了40％和47.98％(表1)。
表1苯乙醇对小麦苗期赤霉病防效分析
注：恶霉灵浓度为250mg/L，不同小写字母表示p＜0.05水平下差异显著。
实施例5：木霉源苯乙醇对小麦大田赤霉病的防效
小麦扬花期时，在大田中的小麦穗部和叶部喷施不同浓度的苯乙醇溶液，2天后在小麦穗部喷施小麦赤霉病孢子悬液，孢子悬液的制备方法与实施例1中的方法一致，田间随机区组设计，每小区面积1m2，每个处理3 个重复。20天后各小区采用5点取样法，每点抽取20-30个麦穗，逐个记载发病程度发病情况，计算小麦病情指数，病情指数与防效的计算公式见①和②，分级标准如下：
0级：无症状；
1级：发病小穗占全穗的1/4以下；
2级：发病小穗占全穗的1/4-1/2；
3级：发病小穗占全穗的1/2-3/4；
4级：发病小穗占全穗的3/4以上。
不同浓度苯乙醇处理田间小麦后，小麦赤霉病发病情况见图8，小麦病情指数和苯乙醇对小麦赤霉病发病情况见表2。结果表明，苯乙醇浓度为 300mg/L时，小麦的病情指数为35.81，与水处理相比，对小麦赤霉病的防效为36.53％，与恶霉灵的病情指数和防效相比无显著性差异。
表2苯乙醇对小麦成株赤霉病的防效分析
注：恶霉灵浓度为250mg/L，不同小写字母表示p＜0.05水平下差异显著。
实施例6：木霉源苯乙醇对苦瓜的促生作用
将苦瓜种子用45℃温水浸泡5小时，然后将苦瓜种子平铺在湿纱布上，再在上面覆盖一层湿纱布，28℃黑暗培养至胚根长出，然后用上述药液分别浸泡苦瓜种子12h，将苦瓜种子转移至花盆中，每盆200g土。
在苦瓜发芽后第14天时，测量苦瓜幼苗的根数、根长和株高来评估苯乙醇是否对苦瓜具有促进生长的作用。当苯乙醇浓度为0.1-10mg/L时，显著提高了苦瓜根长、株高和根数(p＜0.05)，对苦瓜的根长和叶片大小无显著性影响。当浓度为1-10mg/L时，促生作用最显著，株高增加了24.56％(图9的f)；当浓度为10mg/L时，根数增加了48.72％(图9的e)。
实施例7：木霉源苯乙醇提高苦瓜抗枯萎病
1)木霉源苯乙醇对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响
采用含药培养基法，将木霉源苯乙醇加入PDA培养基(45-55℃)中，配制成浓度为0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的含药培养基，倒板。在培养3天的病原菌平板的边缘打取一个6mm的菌饼，接种于含药培养基中央，28℃培养，并记录菌落直径，每组实验3个重复。
由图10可以看出，苯乙醇对尖孢镰刀菌具有抑制作用，但是抑菌率不明显。当苯乙醇浓度为300mg/L时，在尖孢镰刀菌生长第2-4天时的抑制率分别为7.51％、7.56％和5.52％(图10的a)。
2)木霉源苯乙醇对苦瓜生理指标的影响
采用实施例6中的方法对苦瓜进行处理，之后采用浸根法对苦瓜接种病原菌，将苦瓜根部浸泡在病原菌悬液中半小时，将苦瓜苗再移栽到土中。接种病原菌14天后测定苦瓜叶片内的PPO和POD活性、游离脯氨酸含量和丙二醛含量。
苦瓜植株接种苦瓜枯萎病病原菌后第14天，测定苦瓜叶片的PPO和 POD活性，游离脯氨酸含量和丙二醛含量。当苯乙醇处理后对苦瓜的PPO 活性无显著影响，降低了POD活性(图11的a-b)。苯乙醇浓度为10mg/L 时，提高了苦瓜叶片的游离脯氨酸含量(图11的c)，升高了20.02％。但是，苦瓜叶片内的丙二醛含量与对照相比也提高了，提高了23.39％(图11的d)。
实施例8：木霉源苯乙醇对苦瓜苗期枯萎病的防效
将苦瓜种子用50℃的温水浸泡4小时，放在无菌的湿纱布上，28℃培养24-48小时过后，将发芽的苦瓜种子种在花盆中，每盆1颗苦瓜种子，待苦瓜发芽7天后，将不同浓度的苯乙醇溶液喷施于苦瓜叶片，每12盆喷施药液10mL，阳性对照为250mg/L恶霉灵，阴性对照为水。喷洒药液1 天后将苦瓜枯萎病病原菌接种于苦瓜根部，根据苦瓜幼苗发病情况对发病程度进行分级，对病情指数及防效进行计算，结果如表1所示：
苦瓜发病程度：Ⅰ级：1-2片叶子明显发黄；
Ⅱ级：子叶发黄并萎蔫，维管束轻度变色；
Ⅲ级：子叶枯死，真叶发黄，维管束褐色；
Ⅳ级：全株萎蔫或枯死，维管束枯死。
表3
组别
300mg/L
100mg/L
10mg/L
恶霉灵
水
病情指数
50.00
60.00
60.00
60.00
80.00
防效(％)
37.50
25.00
25.00
25.00
通过不同浓度的苯乙醇喷施对苦瓜枯萎病进行防治，结果显示，苯乙醇能够有效减轻苦瓜的发病程度，当苯乙醇浓度为300mg/L时，效果最显著，对苦瓜枯萎病的防效为37.5％，病情指数比恶霉灵低16.67％，比水低 37.5％。说明通过在苦瓜叶片表面喷施苯乙醇可以诱导苦瓜产生抗病性，有效防治苦瓜枯萎病。
图12示出了不同浓度苯乙醇处理下温室苦瓜枯萎病发病程度(盆栽)。图13示出了不同浓度苯乙醇处理下温室苦瓜枯萎病发病程度(植株)。图 14示出了不同浓度苯乙醇处理下温室苦瓜枯萎病发病程度(维管束)。由各图可以看出，喷施苯乙醇可以诱导苦瓜产生抗病性，有效防治苦瓜枯萎病。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
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