阅读说明：本技术 具有改善的醇生产的酵母 (Yeast with improved alcohol production ) 是由 C·E·G·帕扬 M·齐 于 2018-06-04 设计创作，主要内容包括：本文描述了与酵母细胞相关的组合物和方法,所述酵母细胞具有产生增加的醇生产的基因突变。此类酵母非常适合用于醇生产以减少发酵时间和/或增加产量。(Described herein are compositions and methods related to yeast cells having a genetic mutation that results in increased alcohol production. Such yeasts are well suited for alcohol production to reduce fermentation time and/or increase yield.)

具有改善的醇生产的酵母

技术领域

本发明的菌株和方法涉及具有基因突变的酵母，所述基因突变导致增加的乙醇生产。此类酵母非常适合用于醇生产以减少发酵时间和/或增加产量。

背景技术

许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区)，仅仅在美国，2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。

鉴于世界范围的大量的醇生产，即使发酵生物效率的微小提高也可产生可用醇量的巨大增加。因此，对更有效地生产醇的生物存在需求。

发明内容

描述了涉及具有能够增加醇生产的经修饰的酵母细胞的方法。所述组合物和方法的方面和实施方案描述于以下独立编号的段落中。

1.在一个方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生降低量的功能性Cpr1多肽，其中在等同发酵条件下与亲本细胞相比所述经修饰的细胞在发酵期间产生增加量的乙醇。

2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述遗传改变包括所述亲本细胞中存在的YDR155c基因的破坏。

3.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏是所述YDR155c基因全部或部分缺失的结果。

4.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏是一部分包含所述YDR155c基因的基因组DNA的缺失的结果。

5.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏是所述YDR155c基因诱变的结果。

6.在如段落2-5中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏与在所述YDR155c基因的遗传基因座处引入目的基因组合进行。

7.在如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述细胞不产生功能性Cpr1多肽。

8.在如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述细胞不产生Cpr1多肽。

9.在如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

10.在一些实施方案中，如段落1-9中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

11.在一些实施方案中，如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的备选途径。

12.在一些实施方案中，如段落1-11中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含所述亲本细胞中存在的YJL065基因的破坏。

13.在如段落1-12中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述细胞不产生功能性Dls1多肽。

14.在如段落1-13中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，所述细胞属于酵母属(Saccharomyces)物种。

15.在如段落1-14中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施方案中，在接种包含34％-35％溶解的固体且pH为4.8-5.4的水解的淀粉底物后24小时处，测量由所述经修饰的酵母细胞和所述亲本酵母细胞产生的乙醇的量。

16.在另一方面，提供了用于生产经修饰的酵母细胞的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入遗传改变，与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少或阻止了功能性Cpr1多肽的产生，从而产生经修饰的细胞，所述经修饰的细胞在等同发酵条件下在发酵期间与所述亲本细胞相比产生增加量的乙醇。

17.在如段落16所述的方法的一些实施方案中，所述遗传改变包括通过遗传操作破坏所述亲本细胞中的YDR155c基因。

18.在如段落16或17所述的方法的一些实施方案中，所述遗传改变包括使用遗传操作使所述亲本细胞中的YDR155c基因缺失。

19.在如段落16-18中任一项所述的方法的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏与在所述YDR155c基因的遗传基因座处引入目的基因组合进行。

20.在如段落16-19中任一项所述的方法的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏与在所述甘油途径和/或所述乙酰辅酶A途径中实施改变组合进行。

21.在如段落16-20中任一项所述的方法的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏与添加用于制备乙醇的备选途径组合进行。

22.在如段落16-21中任一项所述的方法的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏与破坏所述亲本细胞中存在的YJL065基因组合进行。

23.在如段落16-22中任一项所述的方法的一些实施方案中，所述YDR155c基因的破坏与引入编码碳水化合物加工酶的外源基因组合进行。

24.在如段落16-23中任一项所述的方法的一些实施方案中，所述经修饰的细胞来自酵母属物种。

25.在如段落16-24中任一项所述的方法的一些实施方案中，在接种包含34％-35％溶解的固体且pH为4.8-5.4的水解的淀粉底物后24小时处，测量由所述经修饰的酵母细胞和所述亲本酵母细胞产生的乙醇的量。

26.在另一方面，提供了通过如段落16-25中任一项所述的方法产生的经修饰的酵母细胞。

根据说明书，本文的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面和实施方案将是显而易见的。

具体实施方式

I.概述

本发明的组合物和方法涉及经修饰的酵母细胞，与它们的亲本细胞相比，所述经修饰的酵母细胞展示了增加的乙醇生产。当用于乙醇生产时，所述经修饰的细胞可提高产量和/或缩短发酵时间，从而增加了乙醇的供应量，供世界消费。

II.定义

在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。

如本文所使用的，“丁醇”是指单独的丁醇异构体1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、和/或异丁醇(也称为2-甲基-1-丙醇)或其混合物。

如本文所使用的，“酵母细胞”酵母菌株，或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。

如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。

如本文所使用的，短语“基本上无活性”或相似短语意指特定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。

如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。

如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，该术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施方案中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施方案中，同源蛋白诱导与参考蛋白相似的一种或多种免疫应答。在一些实施方案中，将同源蛋白工程化以产生具有所希望活性的酶。

序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:2444；威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics Computer Group)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Thompson等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。

例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。该方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS 5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了该比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M'5、N'-4、以及两条链的比较作为默认值。

如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。

如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。

如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白或菌株。

如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。

如本文所使用的，“基因缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中除去。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。

如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何基本上阻止宿主细胞中细胞产生功能性基因产物(例如，蛋白)的基因或化学操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、***、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。

如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、***或化学修饰。

如本文所使用的，“主要遗传决定子”是指基因或其遗传操作，所述基因或其遗传操作对于在不存在其他基因或其遗传操作的情况下赋予特定表型是必要和充分的。然而，特定基因对于赋予特定表型是必要和充分的，这并不排除通过进一步的遗传操作可以实现对表型产生另外的作用的可能性。

如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性性质等)的蛋白，并且其未被诱变、截短或以其他方式修饰的废除或减少该活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。

如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(通常是蛋白)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有减少的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。

如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以防止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白质/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以防止产生特定蛋白质”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。

如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即生物化学途径)，泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间产物的通量的任何基因或化学操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。

如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。

如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。

如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

℃ 摄氏度

AA α-淀粉酶

bp 碱基对

DNA 脱氧核糖核酸

DP 聚合度

ds或DS 干固体

EtOH 乙醇

g或gm 克

g/L 克/升

GA 葡糖淀粉酶

GAU/g ds 葡糖淀粉酶单元/克干固体

H₂O 水

HPLC 高效液相色谱

hr或h 小时

kg 千克

M 摩尔的

mg 毫克

mL或ml 毫升

ml/min 毫升/分钟

mM 毫摩尔的

N 正常

nm 纳米

PCR 聚合酶链式反应

ppm 份/百万份

SAPU/g ds 蛋白酶单元/克干固体

SSCU/g ds 真菌α-淀粉酶单元/克干固体

Δ 与缺失有关

μg 微克

μL和μl 微升

μM 微摩尔的

III.具有降低的或消除的Cpr1活性的经修饰的酵母细胞

在一个方面，提供了经修饰的酵母细胞，该经修饰的酵母具有遗传改变，所述遗传改变使得经修饰的菌株的细胞与其他方面相同的亲本细胞相比产生减少量的功能性Cpr1多肽(可替代地称为Cpr1p或YDR155c多肽)。Cpr1是一种162个氨基酸的肽基-脯氨酰顺反异构酶，可加速蛋白质折叠。Cpr1定位于细胞核，并被认为在染色质结构、细胞***和运输中具有多种作用(Hasumi，H.和Nishikawa,T.(1993)Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1161:161-67；Brown,C.R.等人,(2001)J.Biol.Chem[生物化学杂志].276:48017-26和Arevalo-Rodriguez,M.和Heitman,J.(2005)Eukaryot.Cell[真核细胞]4:17-29。

申请人已经发现，具有影响Cpr1功能的遗传改变的酵母在发酵中展示了增加的乙醇生产，可提高产量、缩短发酵时间或两者。更短的发酵时间允许醇生产设施在给定的时间段内进行更多的发酵，以提高生产率。更短的发酵时间和更高的发酵温度还降低了发酵期间污染的风险，并且取决于环境条件，减少了冷却发酵反应以维持酵母活力的需要。

功能性YDR155c蛋白量的减少可能是由于亲本菌株中存在的YDR155c基因的破坏。因为YDR155c基因的破坏是赋予经修饰的细胞增加的乙醇产生表型的主要遗传决定子，因此，在一些实施方案中，经修饰的细胞仅需要包含破坏的YDR155c基因，而所有其他基因可以保持完整。在其他实施方案中，与衍生经修饰的细胞的亲本细胞相比，所述经修饰的细胞可任选地包括另外的遗传改变。虽然此类另外的遗传改变不是赋予所述表型所必需的，但它们可赋予经修饰的细胞其他的优点。

YDR155c基因的破坏可以使用基本上阻止功能性YDR155c基因产物(即Cpr1)表达的任何适合方法进行。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失YDR155c基因，包括完全或部分缺失例如Cpr1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件；以及完全或部分缺失包含YDR155c基因任何部分的染色体的一部分。破坏YDR155c基因的具体方法包括在YDR155c基因的任何部分(例如，Cpr1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或***。优选地，缺失、***和/或取代(统称为突变)通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作来进行，与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。尽管如此，理论上，化学诱变仍可用于破坏YDR155c基因。

YDR155c基因突变可降低YDR155c启动子的效率、降低YDR155c增强子的效率、干扰YDR155c mRNA的剪接或编辑、干扰YDR155c mRNA的翻译、将终止密码子引入YDR155c编码序列以防止全长tYDR155c蛋白的翻译、改变Cpr1蛋白的编码序列以产生活性更低或无活性的蛋白或减少Cpr1与其他核蛋白成分或DNA的相互作用、将Cpr1蛋白的编码序列改变以产生更不稳定的蛋白质或靶向蛋白质进行破坏、导致Cpr1蛋白质错误折叠或被错误修饰(例如，通过糖基化)、或干扰Cpr1蛋白的细胞运输。在一些实施方案中，这些和其他遗传操作用于减少或阻止功能性Cpr1蛋白的表达，或减少或阻止Cpr1的正常生物活性。

在一些实施方案中，本文的经修饰的细胞包括遗传操作，所述遗传操作减少或阻止功能性Cpr1蛋白的表达，或减少或阻止Cpr1的正常生物活性。

在一些实施方案中，经修饰的细胞中功能性Cpr1多肽的量的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Cpr1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施方案中，经修饰的细胞中功能性Cpr1蛋白的表达的减少是与在同样条件下生长的亲本细胞中的功能性Cpr1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。

在一些实施方案中，经修饰的细胞中醇的增加是与在同样条件下生长的亲本细胞中产生的醇量相比，至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或更多的增加。

优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作进行YDR155c基因的破坏，与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。

在一些实施方案中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码选择性标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施方案中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。

示例性酿酒酵母Cpr1多肽的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示：

基于NCBI蛋白质数据库的BLAST搜索，所述Cpr1多肽与至少十个保藏物100％相同：

表1.与其他酿酒酵母Cpr1多肽相比的SEQ ID NO:1

描述	E值	％同一性	GenBank登录号
				Cpr1p[酿酒酵母S288c]	2.8E-79	100％	NP_010439.1
Cpr1p[酿酒酵母VL3]	2.8E-79	100％	EGA87502.1
				Cpr1p[酿酒酵母AVRI796]	2.8E-79	100％	EGA75445.1
Cpr1p[酿酒酵母RM11-1a]	2.8E-79	100％	EDV08157.1
				Cpr1p[酿酒酵母Kyokai No.7]	2.8E-79	100％	GAA22386.1
Cpr1p[酿酒酵母JAY291]	2.8E-79	100％	EEU04638.1.1
				Cpr1p[酿酒酵母FostersO]	2.8E-79	100％	EGA63002.1
Cpr1p[酿酒酵母YJM789]	2.8E-79	100％	EDN60494.1
				Cpr1p[酿酒酵母Vin13]	2.8E-79	100％	EGA79484.1
Cpr1p[酿酒酵母CEN.PK113-7D]	2.8E-79	100％	EIW11359.1

预期本发明的组合物和方法可应用于其他结构相似的Cpr1多肽，以及其他相关的蛋白质、同源物和功能相似的多肽。

在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，以生产水平改变了的Cpr1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如与SEQID NO:1具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。

在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，被破坏的YDR155c基因编码Cpr1蛋白，所述Cpr1蛋白与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NO:1具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。

本文提供的氨基酸序列信息容易地允许技术人员鉴定任何酵母中的Cpr1蛋白和编码Cpr1蛋白的核酸序列，并在YDR155c基因中产生适当的破坏以影响Cpr1蛋白的产生。

在一些实施方案中，经修饰的细胞中功能性Cpr1多肽的量的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Cpr1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施方案中，经修饰的细胞中功能性Cpr1蛋白的表达的减少是与在同样条件下生长的亲本细胞中的功能性Cpr1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。

在一些实施方案中，与其他方面相同的亲本细胞相比，该经修饰的细胞的乙醇生产的增加为至少0.2％、至少0.4％、至少0.6％、至少0.8％、至少1.0％、至少1.2％、至少1.4％、至少1.6％、至少1.8％、至少2.0％或更高的增加。

IV.经修饰的酵母细胞具有减少的Cpr1表达和减少的Dls1表达

在一些实施方案中，除了表达减少量的功能性Cpr1多肽之外，本发明的经修饰的酵母细胞进一步表达了减少量的功能性Dls1多肽。

由YJL065c编码的Dls1是ISW2酵母染色质可及性复合物(yCHRAC)的具有167个氨基酸的多肽亚基，所述复合物含有Isw2、Itc1、Dpb3样亚基(Dls1)和Dpb4(参见，例如，Peterson,C.L.(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.[遗传学与发育的最新观点]6:171-75以及Winston,F.和Carlson,M.(1992)Trends Genet.[遗传学趋势]8:387-91)。申请人已经确定，在没有其他遗传修饰的情况下，具有降低细胞中功能性Dls1的量的遗传改变的酵母在醇发酵中表现出增强的稳健性，这允许更高温度和可能更短的发酵(数据未显示)。

减少细胞中产生的功能性Dls1的量可以通过破坏YJL065c基因来完成。YJL065c基因的破坏可以使用基本上阻止功能性YJL065c基因产物(即Dls1)表达的任何适合方法进行。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失YJL065c基因，包括完全或部分缺失例如Dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或其他调节元件；以及完全或部分缺失包含YJL065c基因任何部分的染色体的一部分。破坏YJL065c基因的具体方法包括在YJL065c基因的任何部分(例如，Dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或***。优选地，缺失、***和/或取代(统称为突变)通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作来进行，与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。尽管如此，理论上，化学诱变仍可用于破坏YJL065c基因。

YJL065c基因突变可降低YJL065c启动子的效率、降低YJL065c增强子的效率、干扰YJL065c mRNA的剪接或编辑、干扰YJL065c mRNA的翻译、将终止密码子引入YJL065c编码序列以防止全长tYJL065c蛋白的翻译、改变Dls1蛋白的编码序列以产生活性更低或无活性的蛋白或减少Dls1与其他核蛋白成分或DNA的相互作用、将Dls1蛋白的编码序列改变以产生更不稳定的蛋白质或靶向蛋白质进行破坏、导致Dls1蛋白质错误折叠或被错误修饰(例如，通过糖基化)、或干扰Dls1蛋白的细胞运输。在一些实施方案中，这些和其他遗传操作用于减少或阻止功能性Dls1蛋白的表达，或减少或阻止Dls1的正常生物活性。

在一些实施方案中，本发明的经修饰的细胞包括减少或阻止功能性Dls1蛋白表达的基因操作，或者减少或阻止Dls1的正常生物活性的基因操作；以及减少或阻止功能性Isw2、Itc1或Dpb4蛋白表达的另外的突变，或者减少或阻止Isw2、Itc1或Dpb4蛋白的正常生物活性的另外的突变。在一些实施方案中，本发明的经修饰的细胞包括减少或阻止功能性Dls1蛋白表达的基因操作，或者减少或阻止Dls1的正常生物活性的基因操作；而不具有减少或阻止功能性Isw2、Itc1或Dpb4蛋白表达的另外的突变，或者减少或阻止Isw2、Itc1或Dpb4蛋白的正常生物活性的另外的突变。

示例性酿酒酵母Dls1多肽的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:3所示：

基于此类BLAST和Clustal W数据，显而易见的是示例性酿酒酵母Dls1多肽(SEQID NO:3)与其他已知酿酒酵母Dls1多肽以及来自其他酵母属物种的Dls1多肽共享非常高程度的序列同一性。因此，完全预期本发明的组合物和方法适用于含有此类结构相似的多肽、以及其他相关的蛋白质、同源物和功能相似的多肽的酵母细胞。

在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，被破坏的Dls1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有整体氨基酸序列同一性，为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。

优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作进行YJL065c基因的破坏，与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。

在一些实施方案中，经修饰的细胞中功能性Dls1多肽的量的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施方案中，经修饰的细胞中功能性Dls1蛋白的表达的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。

在一些实施方案中，与仅降低Cpr1表达的细胞相比，经修饰的细胞中乙醇生产的另外的增加为至少0.2％、至少0.4％、至少0.6％、至少0.8％、至少1.0％、至少1.2％、至少1.4％、至少1.6％、至少1.8％、至少2.0％或更高的增加。

V.增加的Cpr1表达与影响醇生产的其他突变的组合

在一些实施方案中，除了表达减少量的功能性Cpr1多肽之外，任选地与减少功能性Dls1多肽的表达组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括影响乙醇生产的另外的修饰。

在特定的实施方案中，经修饰的酵母细胞包括由引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因产生的人工途径或备选途径。示例性磷酸转酮酶可以从***加德纳菌(Gardnerella vaginalis)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_016786789)获得。示例性磷酸转乙酰酶可以从植物乳杆菌(UniProt/TrEMBL登录号：WP_003641060)获得。

本发明的经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。

经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为Ac-CoA。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产量的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(Methanosaetaconcilii)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。

在一些实施方案中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD⁺依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。然而，在本发明组合物和方法的大多数实施方案中，不需要引入乙酰化乙醛脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶，因为通过减弱导致氧化还原辅因子失衡的用于制备乙酰辅酶A的天然生物合成途径消除了对这些活性的需要。因此，本发明的组合物和方法的实施方案特意缺失编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一个或多个异源基因。

在一些实施方案中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施方案中，所述异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施方案中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施方案中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施方案中，酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。

GOI部分

VI.降低的Cpr1表达与其他有益突变的组合

在一些实施方案中，除表达减少的量的Cpr1多肽之外，任选地与有益于醇生产的其他基因修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含任何数量的编码目的蛋白质的另外目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，这些遗传操作导致Cpr1多肽的表达降低。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。

VII.适合修饰的酵母细胞

酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、克鲁维酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购获得的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，诸如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。

VIII.底物和产物

从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。

醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。

鉴于本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施方案对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制菌株和方法。

实例

实例1.酿酒酵母中YDR155c的缺失

进行遗传筛选以鉴定酿酒酵母突变体，其能够提高发酵24小时后乙醇生产，并且鉴定并选择了许多候选基因用于进一步测试(数据未显示)。选择用于进一步分析的基因之一是YDR155c，其编码Cpr1。Cpr1的氨基酸序列在以下作为SEQ ID NO:1提供：

使用标准酵母分子生物学技术，通过缺失Cpr1的基本上完整的编码序列，即通过缺失在酿酒酵母的起始密码子之前的4个碱基对到两个等位基因的终止密码子之前的10个碱基对的核酸序列来破坏YDR155c基因。所有程序均基于可公开获得的YDR155c的核酸序列，其在下文作为SEQ ID NO:2(5'至3')提供：

用于制备经修饰的酵母细胞的宿主酵母是可商购的FERMAX^TMGold(玛翠公司(Martrex,Inc.)，美国明尼苏达州查斯卡)。通过菌落PCR确认YDR155c基因的缺失。使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。

实例2：通过降低Cpr1的表达的经修饰的酵母的乙醇生产

测试了具有YDR155c基因缺失的FG-155c酵母与基准酵母(即，FERMAX^TMGold，其为YDR155c基因的野生型)相比在32℃和34℃的液化物中生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGEN^TM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds白曲霉(Aspergilluskawachii)α-淀粉酶，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为34.2％的玉米面粉浆液)。

将50克液化物称入100ml容器中，并在32℃和34℃下用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种。通过离心在24和55小时处收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H₂SO₄洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果显示在表2中。报道了相对于FG菌株的乙醇增加。

表2：在发酵24和55小时后对发酵液的分析

*标称参考值

在32℃和34℃下24小时，与未经修饰的参考菌株相比，具有YDR155cc基因缺失的酵母产生显著更多的乙醇(即几乎1.2％至1.7％)。

实例3.Cpr1的表达减少与Dls1的表达减少相结合

进行实验以确定与单独地减少Cpr1相比，在酵母中减少Cpr1的量与减少Dls1(由YJL065c基因编码)的量相结合是否进一步增加耐受性和醇生产。使用标准的酵母分子生物学技术，通过使上述已经缺失YJL065c的FG宿主酵母(FG-65c)中基本上缺失Cpr1的整个编码序列，破坏了YDR155c基因。还测试了在32℃孵育的液化物中，与基准酵母相比，具有YJL065c缺失和Cpr1缺失的酵母(FG-65c-155c)产生乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGEN^TM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds白曲霉α-淀粉酶，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为34.1％的玉米面粉浆液)。

将50克液化物称入250ml容器中，并用来自FG-65c或FG-65c-155c菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在32℃孵育24小时。基于随着时间的推移产生CO₂带来的累积压力，使用气体监测系统(安卡姆科技公司(ANKOM Technology))来记录发酵速率。通过离心收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01NH₂SO₄洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果显示在表3中。报道了相对于FG-65c菌株在24小时处的乙醇增加。

表3.用FG、FG-65c和FG-65c-155c酵母24小时，分析发酵液

*标称参考值

与仅具有DLS1基因缺失的菌株相比，除了具有基因DLS1缺失外还具有基因YDR155c缺失的酵母(YJ065c)在24小时处产生显著更多的乙醇(即高至2.8％)。应注意，FG-65c酵母最终在48小时会产生比野生型FG酵母更多的乙醇(数据未显示)；然而，它们是相对“慢启动剂”，并且在24小时处产生更少的乙醇。因此，YDR155c基因的缺失似乎会增加FG-65c酵母的初始生长速率。

实例4：具有替代性乙醇途径的经修饰的酵母的乙醇生产

测试了具有基因YDR155c缺失并且进一步表达产生乙醇的备选途径(即，通过表达异源磷酸转酮酶、异源磷酸转乙酰酶和乙酰化乙醛脱氢酶，如国际专利申请WO 2015/148272(Miasnikov等人)中所述)的酵母，与亲本酵母(其包括替代性乙醇途径但不具有基因YDR155c缺失)相比的生产乙醇的能力。在这种情况下，将亲本酵母命名为“GPY10009”，并且将经修饰的酵母命名为“GPY10009-155c”。测定条件和程序如先前实例中所述。分析样品的乙醇、葡萄糖、和甘油含量，并且结果如表4所示。报道了相对于GPY10009菌株在24小时处的乙醇增加。

表4.在32℃下用FG、GPY10009和GPY10009-155c发酵24小时后的发酵液分析

*标称参考值

在24小时处，与没有YDR155c缺失的等同酵母相比，具有基因YDR155c缺失并也表达备选途径的酵母产生显著更多的乙醇(即超过2％)。应注意，GPY10009酵母最终在48小时处会产生比野生型FG酵母更多的乙醇(数据未显示)；然而，它们是相对“慢启动剂”，并且在24小时处产生更少的乙醇。因此，YDR155c基因的缺失似乎会增加GPY10009酵母的初始生长速率。

实例5：表达葡糖淀粉酶的经修饰的酵母的乙醇生产

测试了表达上述里氏木霉葡糖淀粉酶的CS4变体并进一步具有基因YDR155c缺失的酵母(即SA-155c)与不具有YDR155c缺失的基准酵母(即SYNERXIA^TMADY，在本文中为“SA”，其为YDR155c基因的野生型)相比，在32℃的液化物中24小时生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGEN^TM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、不添加外源CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶的变体)、和添加1.46SSCU/g ds白曲霉α-淀粉酶，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为34.3％的玉米面粉浆液)。

将5克液化物称入10ml容器中，并用来自SA或SA-155c菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在32℃孵育24小时。通过离心收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H₂SO₄洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果显示在表5中。报道了相对于SA菌株的乙醇增加。

表5.用SA和SA-155c菌株发酵后发酵液的分析

*标称参考值

在24小时处，与没有YDR155c缺失的菌株相比，具有基因YDR155c缺失并也表达葡糖淀粉酶的酵母产显著更多的乙醇(即约4％)。