用于预测疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法
阅读说明：本技术 用于预测疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法 (Methods for predicting the availability of disease-specific amino acid modifications for immunotherapy ) 是由 乌尔·沙欣 于 2018-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于预测包含疾病特异性氨基酸修饰的肽或多肽(特别是肿瘤相关新抗原)是否包含可用于免疫治疗(例如用于疫苗接种)的表位(特别是肿瘤相关新表位)的方法。本发明的方法特别地可用于提供对患者的肿瘤具有特异性的疫苗,并且因此可用于个体化癌症疫苗的情况。(The present invention relates to methods for predicting whether a peptide or polypeptide comprising a disease-specific amino acid modification, in particular a tumor-associated neo-antigen, comprises an epitope, in particular a tumor-associated neo-epitope, useful in immunotherapy, e.g. for vaccination. The methods of the invention are particularly useful for providing vaccines that are specific for a patient's tumor, and thus in the case of individualized cancer vaccines.)
技术领域
本发明涉及用于预测包含疾病特异性氨基酸修饰(disease specific aminoacid modification)的肽或多肽(特别是肿瘤相关新抗原)是否包含可用于免疫治疗(例如用于疫苗接种)的表位(特别是肿瘤相关新表位)的方法。本发明的方法特别地可用于提供对患者的肿瘤具有特异性的疫苗，并且因此可用于个体化癌症疫苗的情况。
背景技术
免疫系统的进化在脊椎动物中产生基于两种防御类型(固有免疫和适应性免疫)的高度有效网络。与依赖于识别与病原体相关的共同分子模式的不变受体(invariantreceptor)的进化上古老的固有免疫系统相反，适应性免疫基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体和克隆选择(clonal selection)。B细胞通过分泌抗体来引起体液免疫应答，而T细胞介导导致所识别细胞破坏的细胞免疫应答。
T细胞在人和动物中的细胞介导的免疫中发挥重要作用。特定抗原的识别和结合由T细胞表面上表达的T细胞受体介导。T细胞的T细胞受体(T cell receptor，TCR)能够与结合至主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子并且呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。为了能够靶向多种抗原，T细胞受体需要具有很大的多样性。
抗原特异性免疫治疗旨在增强或诱导患者中的特异性免疫应答以控制感染性或恶性疾病。越来越多的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原的鉴定导致用于免疫治疗的合适靶标的广泛集合。可通过主动或被动免疫接种策略特异性地靶向呈递来源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。主动免疫接种倾向于诱导和扩增患者中的抗原特异性T细胞，其能够特异性地识别并杀伤病变细胞(diseased cell)。相比之下，被动免疫接种依赖于在体外扩增并任选地遗传改造的T细胞的过继转移(过继性T细胞治疗；adoptive T cell therapy，ACT)。
肿瘤疫苗旨在通过主动免疫接种诱导内源性肿瘤特异性免疫应答。不同的抗原形式可用于肿瘤疫苗接种，包括完整的病变细胞、蛋白质、肽或免疫载体(例如RNA、DNA或病毒载体)，其可直接体内应用或通过进行树突细胞(dendritic cell，DC)的脉冲然后转移到患者中来体外应用。
癌症中的体细胞突变是治疗性疫苗方法的理想靶标(Castle，J.C.等CancerRes.72，1081-1091(2012)；Schumacher，T.N.&Schreiber，R.D.Science 348，69-74(2015)；Türeci，O.等Clin.Cancer Res.22，1885-1896(2016))。其可被加工成肽，呈递在肿瘤细胞的表面上，并被T细胞识别为新表位。新表位被排除在中枢免疫耐受之外并且不存在于健康组织，因此组合了潜在强免疫原性与较低的自身免疫可能性。新出现的数据表明，例如检查点阻断(Rizvi，N.A.等Science 348，124-128(2015)；Snyder，A.等N.Engl.J.Med.371，2189-2199(2014)；Van Allen，E.M.等Science 350，207-211(2015)；Le，D.T.等N.Engl.J.Med.372，2509-2520(2015)；Mcgranahan，N.等，Science 351 1463-1469(2016))和过继性T细胞治疗(Tran，E.等Science 344，641-645(2014)；Robbins，P.F.等Nat.Med.19，747-752(2013)；Tran，E.等N.Engl.J.Med.375，2255-2262(2016))的临床免疫治疗的有利临床结局与新表位免疫识别有关。我们在小鼠肿瘤模型中示出了突变组(mutanome)(即通过下一代测序鉴定的全部体细胞突变)中的很大一部分具有免疫原性，并且这些新表位优选被CD4+ T细胞识别。由从突变组数据通过计算机(in silico)预测的新表位构成的疫苗显示出强抗肿瘤活性，并且诱导已建立的、侵袭性生长的小鼠肿瘤的完全排斥(Kreiter，S.等Nature 520，692-696(2015))。同样，在小鼠肿瘤模型中通过单独或与质谱组合的外显子组(exome)和转录物组分析鉴定的MHC I类新表位看来是合适的疫苗靶标和肿瘤排斥抗原(Yadav，M.等Nature 515，572-576(2014)；Gubin，M.M.等Nature 515，577-581(2014))。总而言之，这些研究激发了对新表位疫苗的热情(Carreno，B.M.等Science 348，803-808(2015)；Bobisse，S.，Foukas，P.G.，Coukos，G.&Harari，A.Ann.Transl.Med.4，262(2016)；Katsnelson，A.Nat.Med.22，122-124(2016)；Delamarre，L.，Mellman，I.&Yadav，M.Science 348，760-1(2015))。
在人癌症中，绝大多数癌症突变是个体患者所特有的，并且因此需要个体化治疗策略。对于每位患者，需要通过深度测序来确定个人癌症突变谱(personal cancermutation profile)，以告知按需要制备的个体化定制疫苗的组成。
在此，我们报道了这种个体化免疫治疗在III期和IV期黑素瘤患者中的首次人中应用。我们建立了符合临床开发指南的方法，其包括进行下一代测序用于通过常规肿瘤活检来全面鉴定个体突变，对潜在相关的HLA I类和HLA II类新表位进行计算机预测，以及为每位患者设计和制备独特的多新表位RNA疫苗。符合条件的患者开始于由NY-ESO-1和酪氨酸酶RNA构成的共享肿瘤抗原疫苗，直至其个体化RNA疫苗发布。总共有13位患者完成了治疗，这显示是可行、安全且耐受良好的。免疫原性率出乎意料得高。疫苗诱导的T细胞特异性识别60％的新表位。每位患者对其10种个体新抗原中的至少三种作出应答，并且动员了广泛且多样化的TCR库。在疫苗接种开始之后两到四周，血液中新表位特异性T细胞的频率的范围从需要体外扩增以被检出的低数目直至高个位数百分比(single-digitpercentage)。在两位具有疫苗接种后切除黑素瘤转移的患者中显示出疫苗诱导的新表位反应性T细胞的活跃浸润和自体肿瘤细胞的新表位特异性杀伤。
对所有患者中累积复发转移事件的临床评价揭示，与患者先前的病史相比，在新表位RNA疫苗接种之后高度显著降低，从而产生具有持续无进展存活的高度有利的临床结局。一位因快速肿瘤进展而用新表位疫苗仅短时间治疗的具有多重转移的患者几乎立即对随后的PD-1阻断作出应答，并且经历完全应答。在两位患者中记录到与直接新表位疫苗治疗相关的客观肿瘤消退。这些患者中有一位具有对进行性转移的完全应答，并且继续进行了26个月的持续疾病控制。另一位患者经历了客观肿瘤应答，但是尽管存在多特异性、完全功能的新抗原反应性T细胞，仍发生远期复发(late relapse)。
用于免疫治疗的合适表位的确定仍然是一个挑战。因此，需要预测表位(特别是新表位)是否将可用于免疫治疗的模型。
对新表位特异性应答的亚型分型不仅确认了我们之前对免疫原性新表位的CD4+T细胞介导识别的高频率的发现(Kreiter，S.等Nature 520，692-696(2015))而且还显示针对用于疫苗的四分之一新表位的CD8+ T细胞应答。针对突变的CD4+应答的优势可通过HLAII类分子在肽配体的组成和长度方面的高度混杂来解释，而高度特异性的HLA I类分子结合一组有限的具有窄长度分布的肽(Amold，P.Y.等J.Immunol.169，739-49(2002))。大约三分之二的观察到的CTL应答是针对CD4+ T细胞伴随识别的突变，针对相应新表位的不同位置发生反应。由于疫苗中包含的所有新表位中的50％表现出CD4+ T细胞应答，因此观察到的联系最可能不是CD4+和CD8新表位免疫应答的纯共发生。已知与辅助表位共价连接的CTL表位具有更高的免疫原性(Shirai，M.等J.Immunol.152，549-556(1994))。携带突变的HLAI类以及II类新表位为CTL致敏(priming)提供了在机理上有利的条件，因为CD4+ T细胞识别其在交叉呈递CD8+ T细胞新表位的DC上的配体，并通过CD40L介导的DC活化来提供同源T细胞辅助(Schoenberger，S.P.，Toes，R.E.，van der Vooff，E.I.，Offringa，R.&Melief，C.J.Nature 393，480-3(1998))。相关说明：我们还发现一个相同的突变可导致在不同HLAI类限制元件上呈递并且被独立CD8+ T细胞识别的新表位(图3b)。同样，我们发现具有不同TCR克隆型(clonotype)的新表位特异性T细胞识别一个相同的表位/限制元件复合体。这些发现表明，通过新表位疫苗接种可招募意想不到广泛的突变特异性T细胞库，并且每个单突变利用T细胞特异性的多样性。
总而言之，本文中提出的发现表明，确定合适的个体化新表位疫苗(特别是个体化RNA新表位疫苗)可在癌症患者中打开广泛的新抗原特异性T细胞库，从而使得能够有效地靶向其突变组。
发明概述
本发明的一个方面涉及用于评估在病变细胞中表达的肽或多肽中的疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法，所述方法包括确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或当在MHC分子(优选不同类别的MHC分子)的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应。
在一个实施方案中，不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子，和/或限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞反应(reactivity)指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于评估在病变细胞中表达的肽或多肽中的疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法，所述方法包括确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应。
在一个实施方案中，不同T细胞受体具有不同的克隆型。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于评估在病变细胞中表达的肽或多肽中的疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法，所述方法包括确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
在一个实施方案中，相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子和/或限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于评估在病变细胞中表达的肽或多肽中的疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法，所述方法包括确定以下一项或更多项：
(i)确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或当在MHC分子(优选不同类别的MHC分子)的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应，
(ii)确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应，和/或
(iii)确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
在一个实施方案中，不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子，和/或限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。在一个实施方案中，不同T细胞受体具有不同的克隆型。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。在一个实施方案中，相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子和/或限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的肽和/或多肽，每种肽和/或多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定肽或多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或当在MHC分子(优选不同类别的MHC分子)的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应；以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
在一个实施方案中，不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子，和/或限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的肽和/或多肽，每种肽和/或多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应；以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
在一个实施方案中，不同的T细胞受体具有不同的克隆型。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的肽和/或多肽，每种肽和/或多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定肽或多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应；以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
在一个实施方案中，相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子和/或限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
本发明的另一个方面涉及用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的肽和/或多肽，每种肽和/或多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定以下一项或更多项：
(1)确定肽或多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或当在MHC分子(优选不同类别的MHC分子)的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应，
(2)确定肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应，和/或
(3)确定肽或多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应；以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
在一个实施方案中，不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子，和/或限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。在一个实施方案中，不同T细胞受体具有不同的克隆型。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。在一个实施方案中，相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子和/或限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。在一个实施方案中，肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
在一个实施方案中，在步骤(ii)中测试的不同氨基酸修饰存在于相同和/或不同的肽或多肽中。在一个实施方案中，本发明的方法包括对针对在步骤(ii)中测试的不同氨基酸修饰获得的评分进行比较。
在本发明所有方面的一个实施方案中，疾病特异性氨基酸修饰归因于疾病特异性体细胞突变。在本发明所有方面的一个实施方案中，疾病是癌症并且免疫治疗是抗癌免疫治疗。在本发明所有方面的一个实施方案中，免疫治疗包括施用以下一种或更多种：
(i)在病变细胞中表达的肽或多肽，所述肽或多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰，
(ii)包含(i)中肽或多肽的片段的肽或多肽，所述片段包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰，以及
(iii)编码(i)或(ii)中肽或多肽的核酸。在本发明所有方面的一个实施方案中，本发明的方法可用于提供疫苗。
本发明的另一个方面涉及用于提供疫苗的方法，其包括以下步骤：
(i)鉴定通过本发明的任何方法被预测可用于免疫治疗的一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰；
(ii)提供包含以下一种或更多种的疫苗：
(1)在病变细胞中表达的肽或多肽，所述肽或多肽包含至少一个被预测可用于免疫治疗的疾病特异性氨基酸修饰，
(2)包含(i)中肽或多肽的片段的肽或多肽，所述片段包含至少一个被预测可用于免疫治疗的疾病特异性氨基酸修饰，以及
(3)编码(i)或(ii)中肽或多肽的核酸。
在本发明所有方面的一个实施方案中，片段是MHC结合肽或潜在MHC结合肽，或者可被加工以提供MHC结合肽或潜在MHC结合肽(例如MHC结合预测指示该片段将与MHC结合)。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的方法产生的疫苗。根据本发明提供的疫苗可包含可药用载体，并且可任选地包含一种或更多种佐剂、稳定剂等。疫苗可以是治疗性或预防性疫苗的形式。
在本发明所有方面的一个实施方案中，指示疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗指示包含该疾病特异性氨基酸修饰的在病变细胞中表达的肽或多肽或者包含其包含该疾病特异性氨基酸修饰的片段(例如表位或疫苗序列)的肽或多肽在施用(任选地，以编码核酸的形式)之后将诱导免疫应答。
在本发明所有方面的一个实施方案中，通过鉴定一个或更多个编码区中的非同义突变来鉴定肽或多肽中的氨基酸修饰。在一个实施方案中，如下鉴定氨基酸修饰：对一个或更多个细胞(例如一个或更多个癌细胞和任选地一个或更多个非癌细胞)的基因组或转录物组进行部分或完全测序，并鉴定一个或更多个编码区中的突变。在一个实施方案中，所述突变是体细胞突变。在一个实施方案中，所述突变是癌症突变。
在本发明所有方面的一个实施方案中，特别是为了向患者(例如癌症患者)提供个体化疫苗，在所述患者中存在所述修饰，并且对所述患者进行本发明的方法。
本发明的另一个方面涉及用于在患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用根据本发明提供的疫苗。
本发明的另一个方面涉及治疗患者的方法，其包括以下步骤：
(a)使用根据本发明的方法提供疫苗；以及
(b)向患者施用所述疫苗。
本发明的另一个方面涉及治疗患者的方法，其包括向患者施用本文中所述的疫苗。
在一个实施方案中，患者是癌症患者，并且疫苗是抗癌疫苗，例如其施用提供癌症特异性新表位的疫苗。
在另一些方面，本发明提供了本文中所述的疫苗，其用于本文中所述的治疗方法，特别地用于治疗或预防癌症。
本文中所述的癌症治疗可与手术切除和/或放射和/或传统化学治疗组合。
本发明还涉及以下：
1.用于预测在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗的方法，所述方法包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递。
2.第1项所述的方法，其中不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子。
3.第1或2项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
4.第1至3项中任一项所述的方法，其还包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应。
5.用于预测在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗的方法，所述方法包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应。
6.第4或5项所述的方法，其中限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
7.第4至6项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
8.用于预测在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗的方法，所述方法包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应。
9.第8项所述的方法，其中不同T细胞受体具有不同的克隆型。
10.第8或9项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
11.用于预测在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗的方法，所述方法包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递。
12.第11项所述的方法，其中相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子。
13.第11或12项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
14.第11至13项中任一项所述的方法，其还包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
15.用于预测在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗的方法，所述方法包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
16.第14或15项所述的方法，其中相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子。
17.第14至16项中任一项所述的方法，其中限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。
18.第14至17项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
19.用于预测在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗的方法，所述方法包括确定以下一项或更多项：
(i)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递，
(ii)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应，
(iii)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应，
(iv)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递，以及
(v)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
20.第19项所述的方法，其包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递，以及当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应。
21.第19或20项所述的方法，其包括确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递，以及当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
22.第19至21项中任一项所述的方法，其中不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子。
23.第19至22项中任一项所述的方法，其中限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
24.第19至23项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
25.第19至24项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
26.第19至25项中任一项所述的方法，其中不同的T细胞受体具有不同的克隆型。
27.第19至26项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
28.第19至27项中任一项所述的方法，其中相同类别的不同MHC分子是不同的MHCI类分子。
29.第19至28项中任一项所述的方法，其中限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。
30.第19至29项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
31.第19至30项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
32.用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的多肽，每种多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递，以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
33.第32项所述的方法，其中不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子。
34.第32或33项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
35.第32至34项中任一项所述的方法，其中步骤(ii)还包括确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应。
36.用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的多肽，每种多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应，以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
37.第35或36项所述的方法，其中限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
38.第35至37项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
39.用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的多肽，每种多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应，以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
40.第39项所述的方法，其中不同的T细胞受体具有不同的克隆型。
41.第39或40项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
42.用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的多肽，每种多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递，以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
43.第42项所述的方法，其中相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子。
44.第42或43项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
45.第42至44项中任一项所述的方法，其中步骤(ii)还包括确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
46.用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的多肽，每种多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应，以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
47.第46项所述的方法，其中相同类别的不同MHC分子是不同的MHC I类分子。
48.第45至47项中任一项所述的方法，其中限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同CD8+ T细胞。
49.第45至48项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
50.用于针对疾病特异性氨基酸修饰在免疫治疗中的可用性对所述疾病特异性氨基酸修饰进行选择和/或排名的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)鉴定在病变细胞中表达的多肽，每种多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰；以及
(ii)确定以下一项或更多项：
(1)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递，
(2)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应，
(3)确定多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时是否与具有不同T细胞受体的T细胞反应，
(4)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递，以及
(5)确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应，以及
(iii)对在(i)中鉴定的至少一种另外的氨基酸修饰重复步骤(ii)。
51.第50项所述的方法，其中步骤(ii)包括确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在不同类别的MHC分子的情况下呈递，以及当在MHC分子的情况下呈递时是否与限制于不同MHC类别的T细胞反应。
52.第50或51项所述的方法，其中步骤(ii)包括确定多肽的包含相同疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段是否在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递，以及当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时是否与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应。
53.第50至52项中任一项所述的方法，其中不同类别的MHC分子是MHC I类分子和MHC II类分子。
54.第50至53项中任一项所述的方法，其中限制于不同MHC类别的T细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
55.第50至54项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在不同类别的MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
56.第50至55项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
57.第50至56项中任一项所述的方法，其中不同的T细胞受体具有不同的克隆型。
58.第50至57项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
59.第50至58项中任一项所述的方法，其中相同类别的不同MHC分子是不同的MHCI类分子。
60.第50至59项中任一项所述的方法，其中限制于相同MHC类别的不同T细胞是不同的CD8+ T细胞。
61.第50至60项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
62.第50至61项中任一项所述的方法，其中多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞进行T细胞反应指示该疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗。
63.第32至62项中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中测试的氨基酸修饰存在于相同多肽中。
64.第32至63项中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中测试的氨基酸修饰存在于不同多肽中。
65.第32至64项中任一项所述的方法，其包括对针对在步骤(ii)中测试的不同氨基酸修饰获得的评分进行比较。
66.第1至65项中任一项所述的方法，其中疾病特异性氨基酸修饰归因于疾病特异性体细胞突变。
67.第1至66项中任一项所述的方法，其中疾病是癌症并且免疫治疗是抗癌免疫治疗。
68.第1至67项中任一项所述的方法，其中免疫治疗包括施用以下一种或更多种：
(i)在病变细胞中表达的多肽，所述多肽包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰，
(ii)包含(i)中多肽的片段的多肽，所述片段包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰，以及
(iii)编码(i)或(ii)中多肽的核酸。
69.第1至68项中任一项所述的方法，其可用于提供疫苗。
70.用于提供疫苗的方法，其包括以下步骤：
(i)鉴定通过第1至69项中任一项所述方法被预测可用于免疫治疗的一种或更多种疾病特异性氨基酸修饰；
(ii)提供包含以下一种或更多种的疫苗：
(1)在病变细胞中表达的多肽，所述多肽包含至少一个被预测可用于免疫治疗的疾病特异性氨基酸修饰，
(2)包含(i)中多肽的片段的多肽，所述片段包含至少一个被预测可用于免疫治疗的疾病特异性氨基酸修饰，以及
(3)编码(i)或(ii)中多肽的核酸。
71.第1至70项中任一项所述的方法，其中片段是MHC结合肽或潜在MHC结合肽，或者可被加工以提供MHC结合肽或潜在MHC结合肽。
72.根据第69至71项中任一项所述方法产生的疫苗。
73.治疗癌症的方法，所述方法包括施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含含有根据第1至68项中任一项所述的方法鉴定的疾病特异性氨基酸修饰的多肽或编码所述多肽的核酸。
74.第73项所述的方法，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
从以下发明详述和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得明显。
发明详述
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
下文中，将描述本发明的要素。这些要素随一些具体实施方案列出，然而，应当理解，其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。各个描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有指明，否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应当被认为通过本申请的说明书公开。
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel，和H.
除非另外指出，否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见，例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，J.Sambrook等eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中可排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应被解释为涵盖一个/种或更多个/种。本文中数值范围的记载仅意在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独的值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。
除非本文中另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对以其他方式要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的语言都不应被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求保护的要素。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中不管是在上文还是下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中没有内容应被解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这些公开内容。
本发明设想通过利用存在于病变细胞中的蛋白质或蛋白质片段作为病变细胞的标记并靶向病变细胞来对疾病(特别是癌症疾病)进行免疫治疗。特别地，可通过靶向在MHC情况下在病变细胞表面上呈递的蛋白质片段来靶向病变细胞。具体地，本发明旨在确定在病变细胞中表达的肽或多肽中的疾病特异性氨基酸修饰，所述修饰位于肽或多肽的适合于免疫治疗的片段中。这样的包含一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰的片段是或包含适于免疫治疗的新表位，特别是用于引发针对表达包含该疾病特异性氨基酸修饰的肽或多肽和该肽或多肽的片段的病变细胞的高效细胞免疫应答。一旦已鉴定出包含疾病特异性氨基酸修饰的合适片段，该片段(任选地作为较大多肽的一部分)或编码该片段(任选地作为较大多肽的一部分)的核酸可用作疫苗以增强或诱导针对表达该片段来源于的经修饰肽或多肽的细胞的免疫应答，特别是通过诱导和/或激活合适的效应细胞(例如T细胞)，其当在MHC的情况下呈递时识别表达经修饰肽或多肽的细胞。
根据本发明，包含一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰并且在病变细胞中表达的肽或多肽在本文中也被称为“新抗原”。此外，根据本发明，新抗原的包含一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰、被免疫系统识别，例如被T细胞识别，特别是当在MHC分子的情况下呈递时，并且优选地已通过本发明的方法确定可用于免疫治疗的片段(任选地作为较大多肽的一部分，例如作为新抗原或者人工肽或多肽的一部分，例如作为包含例如2个或更多个已通过本发明方法确定可用于免疫治疗的新表位的多表位多肽的一部分)在本文中也被称为“新表位”。
根据本发明，优选地，疾病特异性氨基酸修饰归因于一个或更多个疾病特异性体细胞突变。在一个特别优选的实施方案中，疾病特异性氨基酸修饰是癌症特异性氨基酸修饰，并且疾病特异性体细胞突变是癌症特异性体细胞突变。因此，根据本发明，疫苗优选地以患者的疾病特异性氨基酸修饰/疾病特异性体细胞突变为特征并且优选地在施用之后提供一个或更多个基于突变的新表位。因此，疫苗可包含含有一个或更多个基于突变的新表位的肽或多肽或者编码所述肽或多肽的核酸。在一个实施方案中，疾病特异性氨基酸修饰通过鉴定疾病特异性体细胞突变，例如通过对病变组织或者一个或更多个病变细胞的基因组DNA和/或RNA进行测序来鉴定。
根据本发明，术语“肽”指这样的物质，其包含两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或更多个并且多至优选8、10、20、30、40或50个、特别是100个通过肽键共价连接的氨基酸。术语“多肽”或“蛋白质”是指大的肽，优选是指具有多于100个氨基酸残基的肽，但一般而言，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是同义词，并且在本文中可互换使用。
根据本发明，术语“疾病特异性氨基酸修饰”涉及存在于病变细胞的肽或多肽的氨基酸序列中但不存在于对应的正常细胞(即未患病细胞)的肽或多肽的氨基酸序列中的氨基酸修饰。
根据本发明，术语“肿瘤特异性氨基酸修饰”或“癌症特异性氨基酸修饰”涉及存在于肿瘤细胞或癌细胞的肽或多肽的氨基酸序列中但不存在于对应的正常细胞(即非肿瘤细胞或非癌细胞)的肽或多肽的氨基酸序列中的氨基酸修饰。
根据本发明，与肽、多肽或蛋白质相关的术语“修饰”涉及与亲本序列(例如野生型肽、多肽或蛋白质的序列)相比的肽、多肽或蛋白质的序列变化。该术语包括氨基酸***变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和氨基酸替换变体，优选氨基酸替换变体。根据本发明的所有这些序列变化都可潜在地产生新表位。
氨基酸***变体包含在特定氨基酸序列中***单个或者两个或更多个氨基酸。
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸(例如1、2、3、4或5个或者更多个氨基酸)的氨基和/或羧基末端融合。
氨基酸缺失变体以从序列中去除一个或更多个氨基酸(例如以去除1、2、3、4或5个或者更多个氨基酸)为特征。
氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除并且在其位置***另一个残基。
根据本发明，疾病特异性氨基酸修饰或包含疾病特异性氨基酸修饰的肽或多肽片段(例如表位或疫苗序列)可来源于包含该疾病特异性氨基酸修饰的肽或多肽。
根据本发明，术语“来源于”意指特定实体，例如特定氨基酸序列存在于其所来源于的物体中。在氨基酸序列，尤其是特定序列区域的情况下，“来源于”特别地意指相关氨基酸序列来源于其所存在的氨基酸序列。
根据本发明，本文中描述的肽或多肽优选包含一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰。在一个实施方案中，这一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰位于肽或多肽的表位或潜在表位中。因此，本文中描述的优选肽或多肽是新抗原，其优选地包含一个或更多个新表位。类似地，本文中描述的优选肽或多肽片段是肽或多肽的包含一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰的片段，其中一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰位于该片段中。因此，本文中描述的优选肽或多肽片段是新表位。
根据本发明，术语“疾病特异性突变”涉及存在于病变细胞的核酸中但不存在于对应的正常细胞(即非病变细胞)的核酸中的体细胞突变。
根据本发明，术语“肿瘤特异性突变”或“癌症特异性突变”涉及存在于肿瘤细胞或癌细胞的核酸中但不存在于对应的正常细胞(即非肿瘤细胞或非癌细胞)的核酸中的体细胞突变。术语“肿瘤特异性突变”和“肿瘤突变”与术语“癌症/癌特异性突变”和“癌症/癌突变”在本文中可互换使用。
术语“免疫应答”涉及免疫系统的反应。术语“免疫应答”包括固有免疫应答和适应性免疫应答。优选地，免疫应答涉及免疫细胞的活化并且更优选地，涉及细胞免疫应答。
由本文中所述组合物诱导的免疫应答优选地包括以下步骤：活化抗原呈递细胞(例如树突细胞和/或巨噬细胞)，通过所述抗原呈递细胞呈递抗原或其片段，以及由于该呈递而活化细胞毒性T细胞。
“诱导免疫应答”可意指在诱导之前不存在免疫应答，但其还可意指在诱导之前存在一定水平的免疫应答并且在诱导之后所述免疫应答被增强。因此，“诱导免疫应答”还包括“增强免疫应答”。优选地，在对象中诱导免疫应答之后，所述对象被保护免于发生疾病，例如癌症疾病，或者通过诱导免疫应答，疾病状况得以改善。例如，可在患有癌症疾病的患者中或在处于发生癌症疾病风险之中的对象中诱导针对肿瘤表达抗原的免疫应答。在这种情况下诱导免疫应答可意味着改善对象的疾病状况、对象不发生转移或者处于发生癌症疾病风险之中的对象不发生癌症疾病。
术语“细胞免疫应答”和“细胞应答”或类似术语是指涉及充当“助手”或“杀手”的T细胞或T淋巴细胞针对以用I类或II类MHC呈递抗原为特征之细胞的免疫应答。辅助T细胞(也被称为CD4+ T细胞)通过调节免疫应答来发挥中心作用，并且杀伤细胞(也被称为细胞毒性T细胞、细胞裂解性T细胞、CD8+ T细胞或CTL)杀伤病变细胞(例如癌细胞)，从而防止产生更多的病变细胞。在一些优选的实施方案中，本发明涉及刺激针对表达一种或更多种疾病相关抗原并且优选地用I类MHC呈递这样的疾病相关抗原的病变细胞的抗疾病CTL应答，特别是针对表达一种或更多种肿瘤表达抗原并且优选地用I类MHC呈递这样的肿瘤表达抗原的肿瘤细胞的抗肿瘤CTL应答。
根据本发明，术语“抗原”或“免疫原”涵盖以下任何物质，优选肽或多肽，其是免疫应答的靶标和/或其将引发免疫应答。特别地，“抗原”涉及与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质。在一个实施方案中，术语“抗原”包括包含至少一个表位(例如T细胞表位)的分子。优选地，在本发明的上下文中，抗原是这样的分子，其任选地在加工之后诱导免疫反应，所述免疫反应优选地对所述抗原或表达所述抗原的细胞具有特异性。在本发明一些实施方案的情况下，抗原优选地由细胞、优选由抗原呈递细胞、在MHC分子的情况下呈递，这导致针对该抗原或表达该抗原的细胞的免疫反应。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。在一个实施方案中，疾病相关抗原是包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对病变细胞的细胞免疫应答的一个或更多个表位的分子。因此，疾病相关抗原可用于治疗目的。疾病相关抗原可与癌症(通常是肿瘤)相关。
根据本发明，术语“新抗原”涉及与亲本肽或多肽相比包含一个或更多个氨基酸修饰的肽或多肽。例如，新抗原可以是与肿瘤相关的新抗原，其中术语“与肿瘤相关的新抗原”包括含有由肿瘤特异性突变引起的氨基酸修饰的肽或多肽。
术语“表位”是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即是指被免疫系统识别、例如被T细胞识别(特别是当在MHC分子的情况下呈递时)的抗原部分或抗原片段。肽或多肽的表位优选地包含所述肽或多肽的连续或不连续部分，并且长度优选为5至100，优选5至50、更优选8至30、最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位可与MHC分子例如细胞表面上的MHC分子结合，并且任选地可被T细胞受体(例如T细胞表面上的T细胞受体)识别。因此，在一个实施方案中，表位是“MHC结合肽”并且更优选地，表位是“T细胞表位”。
术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子对免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导具有重要意义，其中MHC蛋白或分子与肽结合并将其呈递以被T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并且向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)二者。
MHC区分为三个亚群：I类、II类和III类。MHC I类蛋白包含α链和β2微球蛋白(不是由15号染色体编码的MHC的一部分)。它们将抗原片段呈递给细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上，特别是在抗原呈递细胞上，MHC II类蛋白包含α和β链，并且它们将抗原片段呈递给T辅助细胞。MHC III类区域编码其他免疫组分，例如补体组分，并且一些编码细胞因子。
MHC是多基因的(有数个MHC I类和MHC II类基因)并且是多态性的(每个基因有多个等位基因)。
本文中使用的术语“单倍型”是指存在于一个染色体上的MHC等位基因及其编码的蛋白质。单倍型也可以是指MHC中存在于任一个基因座的等位基因。每个MHC类别均由数个基因座表示：例如，I类的HLA-A(人白细胞抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P和HLA-V，以及II类的HLA-DRA、HLA-DRB1-9、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB。术语“HLA等位基因”和“MHC等位基因”在本文中可互换使用。
MHC表现出极大多态性：在人群中，在每个遗传基因座都有大量包含不同等位基因的单倍型。I类和II类二者的不同多态性MHC等位基因具有不同的肽特异性：每个等位基因编码结合展现特定序列模式的肽的蛋白质。
在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。
如本文中使用的，如果肽或表位与MHC分子结合，则该肽或表位被认为“在MHC分子的情况下呈递”。这样的结合可使用本领域已知的任何测定来检测。术语“MHC结合肽”涉及与MHC I类和/或MHC II类分子结合的肽。在I类MHC/肽复合体的情况下，结合肽的长度通常为8至10个氨基酸，但是更长或更短的肽也可以是有效的。在II类MHC/肽复合体的情况下，结合肽的长度通常为10至25个氨基酸，并且特别地长度为13至18个氨基酸，而更长和更短的肽也可以是有效的。在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。
如果肽或表位是包含另外序列的较大实体(例如疫苗序列或多肽)的一部分，并且将在加工之后、特别是在切割之后被呈递，则通过加工产生的肽或表位具有适于与MHC分子结合的长度。优选地，将在加工之后被呈递的肽或表位的序列来源于用于疫苗接种的抗原或多肽的氨基酸序列，即其序列与该抗原或多肽的片段基本上对应并且优选地完全相同。
因此，在一个实施方案中，MHC结合肽包含与抗原的片段基本上对应并且优选地完全相同的序列。
本文中使用的术语“新表位”包括在参照细胞(例如正常的非病变细胞(例如非癌细胞)或种系细胞(germline cell))中不存在但见于病变细胞(例如癌细胞)中的表位。这特别地包括以下情况，其中在正常的非病变细胞或种系细胞中发现对应的表位，然而由于病变细胞中的一个或更多个突变，该表位的序列改变而产生新表位。
本文中使用的术语“T细胞表位”是指以被T细胞受体识别的构型与MHC分子结合的肽。通常来说，T细胞表位呈递在抗原呈递细胞的表面上。根据本发明的T细胞表位优选地涉及抗原的一部分或片段，其能够刺激针对该抗原或者针对以表达该抗原为特征并且优选地以呈递该抗原为特征的细胞(例如病变细胞，特别是癌细胞)的免疫应答，优选细胞应答。优选地，T细胞表位能够刺激针对以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答，并且优选地能够刺激抗原应答性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
在一个实施方案中，根据本发明的疫苗提供适于对靶生物体进行疫苗接种的一个或更多个新表位。本领域技术人员将知晓免疫生物学和疫苗接种的原理之一基于以下事实：通过用疫苗对生物体进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护反应，所述疫苗与待治疗的疾病有免疫学相关性。根据本发明，抗原优选是自身抗原。
术语“免疫原性”涉及诱导优选地与治疗性治疗(例如针对癌症的治疗)相关的免疫应答的相对功效。本文中使用的术语“免疫原性的”涉及具有免疫原性的特性。例如，当在肽、多肽或蛋白质的情况下使用时，术语“免疫原性修饰”涉及所述肽、多肽或蛋白质诱导由所述修饰引起和/或针对所述修饰的免疫应答的功效。优选地，未经修饰的肽、多肽或蛋白质不诱导免疫应答、诱导不同的免疫应答或诱导不同水平，优选较低水平的免疫应答。
根据本发明，术语“免疫原性”或“免疫原性的”优选地涉及诱导生物学相关免疫应答，特别是可用于疫苗接种的免疫应答的相对功效。因此，在一个优选实施方案中，如果氨基酸修饰或经修饰肽在对象中诱导针对靶修饰的免疫应答，则其是免疫原性的，所述免疫应答可对治疗或预防目的具有益处。
本文中使用的术语“评估疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性”或“预测疾病特异性氨基酸修饰是否可用于免疫治疗”是指预测疾病特异性氨基酸修饰(特别是包含疾病特异性氨基酸修饰的抗原或包含疾病特异性氨基酸修饰的抗原片段(例如包含含有疾病特异性氨基酸修饰的一个或更多个表位、特别是一个或更多个T细胞表位的抗原片段))是否将可用于诱导免疫应答或靶向免疫应答。术语“被预测可用于免疫治疗的疾病特异性氨基酸修饰”或类似术语是指以下事实：疾病特异性氨基酸修饰(特别是包含疾病特异性氨基酸修饰的抗原或包含疾病特异性氨基酸修饰的抗原片段(例如包含含有疾病特异性氨基酸修饰的一个或更多个表位、特别是一个或更多个T细胞表位的抗原片段))已被预测可用于诱导免疫应答或靶向免疫应答。如果疾病特异性氨基酸修饰被预测可用于免疫治疗，例如包含疾病特异性氨基酸修饰的抗原或包含疾病特异性氨基酸修饰的抗原片段(例如包含含有疾病特异性氨基酸修饰的一个或更多个表位、特别是一个或更多个T细胞表位的抗原片段)可用于疫苗接种或设计疫苗，如本文中所述。
根据本发明，表位(例如T细胞表位)可作为包含多于一个表位的较大实体例如疫苗序列和/或多肽的一部分存在于疫苗中。呈递的肽或表位在适当地加工之后产生。而且，表位可在与MHC结合或对TCR识别非必需的一个或更多个残基处被修饰。这样的经修饰表位可被认为是免疫学上等同的。优选地，表位当被MHC呈递并且被T细胞受体识别时能够在合适共刺激信号的存在下诱导携带特异性地识别肽/MHC复合体的T细胞受体的T细胞克隆扩增。优选地，表位包含基本上对应于抗原片段的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，所述抗原片段是MHC I类和/或II类呈递的肽。
“抗原加工”或“加工”是指肽、多肽或蛋白质被降解成作为所述肽、多肽或蛋白质的片段的加工产物(例如，多肽被降解成肽)，并且使这些片段中一个或更多个与MHC分子缔合(例如，通过结合)用于被细胞(优选抗原呈递细胞)呈递于特定T细胞。
“抗原呈递细胞”(antigen presenting cell，APC)是呈递与其细胞表面上的MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可活化抗原特异性T细胞。
专职抗原呈递细胞在通过吞噬或通过受体介导的胞吞内化抗原并随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常高效。T细胞识别在抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合体并与之相互作用。然后，抗原呈递细胞产生另外的共刺激信号，从而导致活化T细胞。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的限定特征。
专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞(其具有最宽范围的抗原呈递，并且可能是最重要的抗原呈递细胞)、巨噬细胞、B细胞；以及某些活化的上皮细胞。树突细胞(DC)是通过MHC II类和I类两种抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递于T细胞的白细胞群体。公知的是，树突细胞是免疫应答的有效诱导剂，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞常规被分类为“未成熟细胞”和“成熟细胞”，其可用作区分两种充分表征的表型的简单方式。然而，这种命名不应解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟树突细胞表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型通常以这些标志物的较低表达但是导致T细胞活化的细胞表面分子的高表达为特征，所述细胞表面分子例如I类和II类MHC、黏附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)。树突细胞成熟是指这样的抗原呈递树突细胞导致T细胞致敏的树突细胞活化状态，而通过未成熟树突细胞的呈递导致耐受。树突细胞成熟主要由以下引起：具有被固有受体(inate receptor)检测的微生物特征的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、树突细胞表面上的CD40被CD40L连接、以及从正经受应激细胞死亡的细胞中释放的物质。树突细胞可通过在体外用细胞因子培养骨髓细胞来获得，所述细胞因子例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α。
非专职抗原呈递细胞不组成型地表达与天然T细胞相互作用所需的MHC II类蛋白；这些仅在非专职抗原呈递细胞被某些细胞因子(例如IFNγ)刺激之后表达。
“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或者类似表述意指在MHC分子(特别是MHC I类分子)的情况下呈递抗原或者例如通过加工抗原而呈递来源于所述抗原的片段的细胞，例如病变细胞(例如癌细胞)，或者抗原呈递细胞。类似地，术语“以呈递抗原为特征的疾病”表示涉及以呈递抗原(特别是以I类MHC呈递抗原)为特征之细胞的疾病。细胞的抗原呈递可通过用编码抗原的核酸(例如RNA)转染细胞来实现。
“所呈递的抗原片段”或类似表述意指所述片段例如当直接添加至抗原呈递细胞时可由MHC I类或II类(优选MHC I类)呈递。在一个实施方案中，所述片段是由表达抗原的细胞天然呈递的片段。
“靶细胞”应意指为免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的细胞。靶细胞包括呈递抗原，即来源于抗原的肽片段的细胞，并且包括任何不期望的细胞，例如癌细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞是表达本文中所述的抗原并且优选地用I类MHC呈递所述抗原的细胞。
术语“段(portion)”是指级分(fraction)。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“段”可指所述结构的连续或不连续级分。优选地，氨基酸序列的一段包含所述氨基酸序列的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、优选至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％并且最优选至少90％的氨基酸。优选地，如果该段是不连续级分，则所述不连续级分由结构的2、3、4、5、6、7、8个或更多个部分构成，每个部分为该结构的一个连续元件。例如，氨基酸序列的不连续级分可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8个或更多个，优选不多于4个部分构成，其中每个部分优选地包含该氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、优选至少20个连续氨基酸、优选至少30个连续氨基酸。
术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。例如，例如氨基酸序列或蛋白质的结构的一部分是指所述结构的连续元件。结构的一段、一部分或一个片段优选地包含所述结构的一种或更多种功能特性。例如，表位、肽或蛋白质的一段、一部分或一个片段优选地与其所来源于的表位、肽或蛋白质免疫学等同。在本发明的上下文中，例如氨基酸序列的结构的一“部分”优选地包含整体结构或氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％，优选地由其组成。
在本发明的上下文中，术语“效应细胞”、“免疫效应细胞”或“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。“免疫反应性细胞”优选地能够结合抗原或者以呈递抗原或其肽片段(例如，T细胞表位)为特征的细胞，并且介导免疫应答。例如，这样的细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，分泌抗体，识别癌细胞并任选地消除细胞。例如，免疫反应性细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，免疫反应性细胞是T细胞，优选CD4+和/或CD8+ T细胞。
优选地，“免疫反应性细胞”以一定程度的特异性识别抗原或其肽片段，特别是如果在MHC分子的情况下，例如在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上被呈递的话。优选地，所述识别使得识别抗原或其肽片段的细胞能够具有应答性或反应性。如果细胞是携带在MHC II类分子的情况下识别抗原或其肽片段之受体的辅助T细胞(CD4+ T细胞)，则这样的应答性或反应性可涉及释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞。如果细胞是CTL，则这样的应答性或反应性可涉及例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除在MHC I类分子的情况下呈递的细胞，即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞。根据本发明，CTL应答性可包括持续的钙通量、细胞***、细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)产生、活化标志物(例如CD44和CD69)上调、以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。CTL应答性还可使用准确地指示CTL应答性的人工报道子来确定。这样的识别抗原或抗原片段并且具有应答性或反应性的CTL在本文中还称为“抗原应答性CTL”。如果细胞是B细胞，则这样的应答性可涉及释放免疫球蛋白。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+ T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+ T细胞)。
T细胞属于已知为淋巴细胞的白细胞组群，并且在细胞介导的免疫中发挥关键作用。其与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)的区别之处可在于在其细胞表面上存在被称为T细胞受体(TCR)的特殊受体。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已发现T细胞的数个不同亚群，其各自均具有不同的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，除其他功能之外还包括使B细胞成熟为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。这些细胞由于其在其表面上表达CD4蛋白而还被称为CD4+ T细胞。辅助T细胞当在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子向其呈递肽抗原时变得活化。一旦活化，其迅速***并分泌在主动免疫应答中发挥调节或辅助作用的被称为细胞因子的小蛋白质。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植物排斥。这些细胞由于其在其表面上表达CD8糖蛋白而还被称为CD8+ T细胞。这些细胞通过结合与MHC I类缔合的抗原来识别其靶标，MHC I类存在于身体的几乎每个细胞的表面上。
大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合体存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，这些肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并且称为α-和β-TCR链。γδ T细胞(gamma delta T细胞)代表在其表面上具有独特T细胞受体(TCR)的小的T细胞亚群。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。与αβ T细胞相比，该T细胞组群很不常见(总T细胞的2％)。
T细胞活化中的第一信号通过T细胞受体与另一个细胞上由MHC呈递的短肽结合来提供。这确保仅活化对该肽具有特异性的TCR的T细胞。配偶体细胞通常是抗原呈递细胞，例如专职抗原呈递细胞，在初始应答(
根据本发明，如果分子对预定靶标具有显著亲和力并且在标准测定中与所述预定靶标结合，则其能够与所述靶标结合。通常通过平衡解离常数(KD)测量“亲和力”或“结合亲和力”。如果分子对靶标不具有显著亲和力并且在标准测定中不与所述靶标显著结合，则其(基本上)不能够与所述靶标结合。
细胞毒性T淋巴细胞可通过在体内向抗原呈递细胞中并入抗原或其肽片段来体内产生。抗原或其肽片段可作为蛋白质、作为DNA(例如在载体中)或作为RNA表示。抗原可被加工以产生MHC分子的肽配偶体，而其片段则无需进行进一步加工即可呈递。如果这些可与MHC分子结合，则后者特别如此。一般来说，可通过皮内注射来向患者施用。然而，注射也可在节内进行进入***中(Maloy等(2001)，Proc Natl Acad Sci USA98：3299-303)。所产生的细胞呈递目的复合体并被自体细胞毒性T淋巴细胞识别，其随后增殖。
CD4+或CD8+ T细胞的特异性活化可以以多种方式来检测。用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如，淋巴因子(例如IFNγ))的产生或细胞裂解活性的产生。对于CD4+ T细胞，用于检测特异性T细胞活化的一种优选方法是检测T细胞增殖。对于CD8+ T细胞，用于检测特异性T细胞活化的一种优选方法是检测细胞裂解活性的产生。特别地，胞内细胞因子染色或ELISPOT可用于检测由CD4+和CD8+ T细胞二者产生的细胞因子，例如通过使用本文中所述的方法。
通常来说，在ELISPOT测定中，用捕获抗体包被膜的表面，该抗体结合待测定的细胞因子的特定表位。当细胞被活化时，其释放细胞因子，该细胞因子被固定化抗体直接捕获在膜表面上。因此，细胞因子被“捕获”在直接围绕分泌细胞的区域中。随后的检测步骤将固定化细胞因子可视化为“免疫斑点”，其实际上是活化细胞的分泌足迹。因此，ELISPOT测定技术允许评估正应答于特定抗原性刺激而产生给定细胞因子(例如，IFNγ)的T细胞的数目和/或频率。斑点计数可表示为从重复实验获得的中位值，并且可与阴性对照(例如未经刺激的细胞)进行比较。如果观察到每一定数目细胞的最小斑点数和/或斑点数目与阴性对照相比超过一定水平，则可将应答定义为阳性的。例如，如果每1×103个细胞、1×104个细胞或1×105个细胞具有最少五个斑点，和/或如果斑点计数是相应阴性对照的超过2×、3×、4×、5×高、或甚至更高，则可将应答定义为阳性的。
术语“免疫学等同的”意指免疫学等同分子(例如免疫学等同氨基酸序列)表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如对于免疫学作用的类型，例如诱导体液和/或细胞免疫应答、所诱导免疫应答的强度和/或持续时间、或者所诱导免疫应答的特异性。在本发明的上下文中，术语“免疫学等同的”优选地针对用于免疫接种的肽或多肽的免疫学作用或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参照氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参照氨基酸序列免疫学等同。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀伤肿瘤细胞或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤播散和转移。优选地，在本发明的上下文中，免疫效应功能是T细胞介导的效应功能。这样的功能在辅助T细胞(CD4+ T细胞)的情况下包括抗原或抗原片段在MHC II类分子的情况下被T细胞受体识别、释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括抗原或抗原片段在MHC I类分子的情况下被T细胞受体识别、通过例如凋亡或穿孔素介导的细胞裂解消除在MHC I类分子的情况下呈递的细胞(即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞)、产生细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。
一般来说，根据本发明，在病变细胞中表达的肽或多肽的疾病特异性氨基酸修饰和片段(所述片段包含一个或更多个疾病特异性氨基酸修饰)针对其在免疫治疗中的可用性进行评估。被预测可用于免疫治疗的一个或更多个片段可用于提供疫苗，所述疫苗包含例如这一个或更多个片段来源于的肽或多肽或者所述肽或多肽的一个或更多个肽片段，特别是所述肽或多肽的一个或更多个(潜在)MHC结合肽。疫苗还可包含核酸(例如RNA)，其编码一个或更多个片段来源于的肽或多肽或者所述肽或多肽的一个或更多个肽片段，特别是所述肽或多肽的一个或更多个(潜在)MHC结合肽。
根据本发明，术语“评分”涉及测试或测定的通常以数字表示的结果，所述测试或测定包括例如测量多肽片段在MHC分子上的呈递的测定或测量对MHC分子上多肽片段的T细胞反应性的测定。例如“较好评分”或“评分较好”的术语涉及测试或测定的较好结果或最好结果。
可使用本领域已知的任何方法确定多肽呈递和T细胞反应性的水平。可例如使用公知的预测方法以及实验方法来确定肽呈递。例如，已经开发了许多生化测定以确定MHC-肽亲和力。经典的方法是竞争测定，其中使通常经放射性标记的参照肽与MHC结合。也可使用T细胞反应性测定来确定MHC肽结合。可如本文中所述评估T细胞反应性，例如通过免疫学测定，包括酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISPOT)或细胞因子分泌测定(cytokine secretion assay，CSA)。
根据本发明，疾病特异性氨基酸修饰可根据预测的包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰的肽或多肽表位的以下能力来进行评分：(1)在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或与限制于不同MHC类别的T细胞反应的能力、(2)当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应的能力，和/或(3)在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应的能力。通常来说，疾病特异性氨基酸修饰或包含至少一个疾病特异性氨基酸修饰的肽或多肽表位满足的参数(1)至(3)越多，则疾病特异性氨基酸修饰评分越好。
例如“预测”及其变化形式的术语涉及确定例如在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰可用于免疫治疗的可能性。如果多肽的相同或不同片段(这些片段包含疾病特异性氨基酸修饰)在不同类别的MHC分子的情况下呈递、如果多肽的相同或不同片段与限制于不同MHC类别的T细胞反应、或二者均有，则在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰被鉴定为可用于免疫治疗。作为替代或补充，如果多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应，则在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰被鉴定为可用于免疫治疗。作为替代或补充，如果多肽的相同或不同片段(这些片段包含疾病特异性氨基酸修饰)在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递、如果多肽的相同或不同片段当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应、或二者均有，则在病变细胞中表达的多肽中的疾病特异性氨基酸修饰被鉴定为可用于免疫治疗。
肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段在MHC分子的情况下的呈递可例如通过使用任何肽：MHC结合预测工具和/或通过在实验上确定该片段与MHC分子的结合来确定。
肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段当在MHC分子的情况下呈递时与T细胞的反应性可例如通过实验确定。
在一个实施方案中，通常针对存在于具有疾病特异性氨基酸修饰的患者中的MHC分子和/或T细胞进行评估。因此，本发明还可包括确定患者的MHC和/或T细胞库。
在一个实施方案中，术语“肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的不同片段”涉及包含经修饰肽或多肽的不同片段或由其组成的肽，所述不同片段包含存在于所述肽或多肽中的相同修饰但是修饰的长度和/或位置不同。如果肽或多肽在位置x处具有修饰，则所述肽或多肽的各自包含所述肽或多肽的覆盖所述位置x的不同序列窗的两个或更多个片段被认为是肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的不同片段。
术语“不同的氨基酸修饰”涉及相同和/或不同肽或多肽的不同氨基酸修饰。
优选地，根据本发明，“肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段”具有用于MHC结合的适当长度。
待根据本发明评估用于免疫治疗的可用性或待根据本发明针对在免疫治疗中的可用性进行选择和/或排名的氨基酸修饰优选地是由患者中细胞(例如病变细胞，特别是癌细胞或肿瘤细胞)的核酸突变引起的。这样的突变可通过已知的测序技术来鉴定。因此，本发明的方法可针对例如癌症患者的患者进行以提供患者特异性疫苗，例如抗癌疫苗。
在一个实施方案中，所述突变是癌症患者的肿瘤标本中的癌症特异性体细胞突变，其可通过鉴定肿瘤试样的基因组、外显子组和/或转录物组与非肿瘤发生性标本的基因组、外显子组和/或转录物组之间的序列差异来确定。
根据本发明，肿瘤标本涉及包含或怀疑包含肿瘤细胞或癌细胞的从患者获得的任何样品，例如身体样品。身体样品可以是任何组织样品，例如血液、从原发肿瘤或从肿瘤转移瘤获得的组织样品、或者包含肿瘤细胞或癌细胞的任何其他样品。优选地，身体样品是血液，并且在血液中包含的一个或更多个循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异。在另一个实施方案中，肿瘤标本涉及一个或更多个分离的肿瘤细胞或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))或者包含一个或更多个分离的肿瘤细胞或癌细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))的样品。
非肿瘤发生性标本涉及不包含或不怀疑包含肿瘤细胞或癌细胞的从患者或者优选地与该患者属于同一物种的另外个体，优选健康个体获得的任何样品，例如身体样品。身体样品可以是任何组织样品，例如血液或来自非肿瘤发生性组织的样品。
本发明可涉及确定患者的癌症突变标志(signature)。术语“癌症突变标志”可指患者的一个或更多个癌细胞中存在的所有癌症突变，或者其可指患者的一个或更多个癌细胞中存在的仅部分癌症突变。因此，本发明可涉及鉴定患者的一个或更多个癌细胞中存在的所有癌症特异性突变，或者其可涉及鉴定患者的一个或更多个癌细胞中存在的仅部分癌症特异性突变。一般来说，本发明的方法允许鉴定大量突变，这使本发明方法中包括足够量的修饰或经修饰肽或多肽。
优选地，根据本发明鉴定的突变是非同义突变，优选肿瘤细胞或癌细胞中表达的肽或多肽的非同义突变。
在一个实施方案中，在肿瘤标本的基因组，优选整个基因组中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异。因此，本发明可包括鉴定一个或更多个癌细胞的基因组(优选整个基因组)的癌症突变标志。在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤标本中癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定全基因组癌症突变谱。
在一个实施方案中，在肿瘤标本的外显子组(优选整个外显子组)中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异。因此，本发明可包括鉴定一个或更多个癌细胞的外显子组(优选整个外显子组)的癌症突变标志。在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤标本中癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定全外显子组癌症突变谱。
在一个实施方案中，在肿瘤标本的转录物组(优选整个转录物组)中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异。因此，本发明可包括鉴定一个或更多个癌细胞的转录物组(优选整个转录物组)的癌症突变标志。在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤标本中癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定全转录物组癌症突变谱。
在一个实施方案中，鉴定癌症特异性体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括对一个或更多个、优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或甚至更多个癌细胞进行单细胞测序。因此，本发明可包括鉴定所述一个或更多个癌细胞的癌症突变标志。在一个实施方案中，所述癌细胞是循环肿瘤细胞。例如循环肿瘤细胞的癌细胞可在单细胞测序之前分离。
在一个实施方案中，鉴定癌症特异性体细胞突变或鉴定序列差异的步骤涉及使用下一代测序(next generation sequencing，NGS)。
在一个实施方案中，鉴定癌症特异性体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括对肿瘤标本的基因组DNA和/或RNA进行测序。
为了揭示癌症特异性体细胞突变或序列差异，优选地将从肿瘤标本获得的序列信息与参照(例如从对正常非癌细胞(例如种系细胞)的核酸(例如DNA或RNA)进行测序获得的序列信息)进行比较，所述正常非癌细胞可从患者或不同个体获得。在一个实施方案中，正常的基因组种系DNA从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)获得。
术语“基因组”涉及生物体或细胞的染色体中遗传信息的总量。
术语“外显子组”是指生物体的基因组中由外显子形成的部分，其是所表达基因的编码部分。外显子组提供用于合成蛋白质及其他功能性基因产物的遗传蓝图。其是基因组中功能最相关的部分，因此，其最有可能促成生物体的表型。人基因组的外显子组估计占总基因组的1.5％(Ng，PC等，PLoS Gen.，4(8)：1-15，2008)。
术语“转录物组”涉及一个细胞或细胞群中产生的所有RNA分子(包括mRNA、rRNA、tRNA以及其他非编码RNA)的集合。在本发明的上下文中，转录物组意指给定个体的一个细胞、细胞群(优选癌细胞群)或所有细胞在确定时间点产生的所有RNA分子的集合。
“核酸”根据本发明优选地是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、更优选RNA、最优选体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA，IVT RNA)或合成的RNA。核酸根据本发明包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的分子和化学合成的分子。根据本发明，核酸可作为单链或双链且线性或共价环状闭合的分子存在。根据本发明，核酸可被分离。根据本发明，术语“分离的核酸”意指核酸(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)是纯化的，例如通过切割并通过凝胶电泳分离而纯化的；或(iv)是合成的，例如通过化学合成而合成的。核酸可用于引入细胞中，即转染细胞，特别是以RNA的形式，其可通过体外转录由DNA模板制备。此外，可在应用之前通过稳定化序列、加帽和多腺苷酸化对RNA进行修饰。
术语“遗传物质”是指分离的核酸(DNA或RNA)、双螺旋的一段、染色体的一段、或者生物体或细胞的整个基因组，特别是其外显子组或转录物组。
术语“突变”是指与参照相比的核酸序列的变化或差异(核苷酸替换、添加或缺失)。除生殖细胞(***和卵子)之外，身体的任何细胞都可发生“体细胞突变”，因此不会传递给儿童。这些改变可(但不总是)引起癌症或其他疾病。优选地，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中氨基酸改变(例如氨基酸替换)的突变，优选核苷酸替换。
根据本发明，术语“突变”包括点突变、插失(Indel)、融合、染色体碎裂(chromothripsis)和RNA编辑。
根据本发明，术语“插失”描述一种特殊的突变种类，其定义为导致共定位的***和缺失以及核苷酸净增多或损失的突变。在基因组的编码区中，除非插失的长度为3的倍数，否则其产生移码突变。插失可与点突变形成对比，其中插失从序列中***和缺失核苷酸，点突变是取代一个核苷酸的替换形式。
融合可产生由两个先前分离的基因形成的杂合基因。其可由于易位、中间缺失或染色体倒位而发生。通常来说，融合基因是癌基因。致癌性融合基因可导致具有新功能或与两个融合配偶体具有不同功能的基因产物。或者，原癌基因与强启动子融合，并且由此致癌功能被设定为通过由上游融合配偶体的强启动子引起的上调而发挥作用。致癌性融合转录物还可通过反式剪接或通读事件产生。
根据本发明，术语“染色体碎裂”是指通过单个灾难性事件(devastating event)，基因组的特定区域被破碎并随后拼接在一起的遗传现象。
根据本发明，术语“RNA编辑”是指其中通过碱基组成的化学改变来改变RNA分子中的信息内容的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰，例如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基，以及非模板的核苷酸添加和***。mRNA中的RNA编辑有效地改变所编码蛋白质的氨基酸序列，以使得其与由基因组DNA序列预测的不同。
术语“癌症突变标志”是指与非癌性参照细胞相比时存在于癌细胞中的突变的组。
根据本发明，“参照”可用于关联和比较来自肿瘤标本的结果。通常来说，“参照”可基于从患者或者一个或更多个不同个体(优选健康个体，特别是同一物种的个体)获得的一个或更多个正常样本，特别是未受癌症疾病影响的样本来获得。“参照”可通过测试足够大量的正常样本来凭经验确定。
根据本发明可使用任何合适的测序方法来确定突变，优选下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法在未来可替代NGS技术以加速方法的测序步骤。为了说明目的，术语“下一代测序”或“NGS”在本发明的上下文中意指全部的新高通量测序技术，其与被称为Sanger化学的“常规”测序方法形成对比，通过将整个基因组断裂成小碎片来沿着整个基因组平行地随机阅读核酸模板。这样的NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如在1至2周内，优选地在1至7天内或者最优选地在小于24小时内递送整个基因组、外显子组、转录物组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息并且在原理上实现单细胞测序方法。在本发明的上下文中可使用可商购获得或文献中提及的多个NGS平台，例如Zhang等2011：The impact of next-generation sequencingon genomics.J.Genet Genomics 38(3)，95-109中；或者Voelkerding等2009：Nextgeneration sequencing：From basic research to diagnostics.Clinical chemistry55，641-658中详细描述的那些。这样的NGS技术/平台的非限制性实例为：
1)在例如Roche联合公司454Life Sciences(Branford，Connecticut)的GS-FLX454Genome SequencerTM中实施的被称为焦磷酸测序的边合成边测序技术，其首先在Ronaghi等1998：A sequencing method based on real-time pyrophosphate″.Science281(5375)，363-365中进行了描述。这项技术使用乳液PCR，其中通过剧烈涡旋将单链DNA结合珠包封在由油包围的包含PCR反应物的水性胶束中，以用于进行乳液PCR扩增。在焦磷酸测序过程期间，随着聚合酶合成DNA链，记录在核苷酸并入期间从磷酸分子发射的光；
2)由Solexa(现在为Illumina Inc.，San Diego，California的一部分)开发的边合成边测序方法，其基于可逆染料-终止剂并且例如在Illumina/Solexa GenomeAnalyzerTM中和在Illumina HiSeq 2000Genome AnalyzerTM中实施。在这项技术中，将全部四种核苷酸与DNA聚合酶一起同时添加到流式细胞通道中的寡聚物引发的簇片段中。桥接扩增用所有四种经荧光标记的核苷酸延伸簇链用于测序；
3)在例如Applied Biosystems(现在为Life Technologies Corporation，Carlsbad，California)的SOLidTM平台中实施的边连接边测序方法。在这项技术中，根据测序位置标记固定长度的所有可能寡核苷酸的库。使寡核苷酸退火并连接；DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生提供在该位置处核苷酸的信息的信号。在测序之前，通过乳液PCR扩增DNA。将各自均仅包含相同DNA分子的拷贝的所得珠沉积在载玻片上。作为第二个实例，Dover Systems(Salem，New Hampshire)的PolonatorTM G.007平台还采用通过使用随机排列的基于珠的乳液PCR来扩增DNA片段用于平行测序的边连接边测序方法；
4)例如如在Pacific Biosciences(Menlo Park，California)的PacBio RS系统或在Helicos Biosciences(Cambridge，Massachusetts)的HeliScopeTM平台中实施的单分子测序技术。这项技术的独特特征是其不经扩增对单DNA或RNA分子进行测序的能力，其被定义为单分子实时(Single-Molecule Real Time，SMRT)DNA测序。例如，HeliScope使用高灵敏荧光检测系统来直接随着每个核苷酸合成对其进行检测。Visigen Biotechnology(Houston，Texas)已经开发了基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)的类似方法。其他基于荧光的单分子技术来自U.S.Genomics(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)；
5)用于单分子测序的纳米技术，其中使用例如布置在芯片上以监测在复制期间聚合酶分子在单链上的移动的多种纳米结构。基于纳米技术的方法的非限制性实例是OxfordNanopore Technologies(Oxford，UK)的GridONrM平台、由Nabsys(Providence，RhodeIsland)开发的杂交辅助纳米孔测序(HANSTM)平台、以及被称为组合探针-锚定连接(cPALTM)的具有DNA纳米球(DNA nanoball，DNB)技术的基于专有连接酶的DNA测序平台；
6)用于单分子测序的基于电子显微术的技术，例如由LightSpeed Genomics(Sunnyvale，California)和Halcyon Molecular(Redwood City，California)开发的那些；
7)基于检测在DNA聚合期间释放的氢离子的离子半导体测序。例如，离子激流系统(Ion Torrent System)(San Francisco，California)使用微加工孔的高密度阵列以大规模并行方式进行这一生物化学过程。每个孔容纳不同的DNA模板。在孔之下是离子灵敏层并且在其之下是专有离子传感器。
优选地，DNA和RNA制备物充当NGS的起始物质。这样的核酸可容易地从例如生物材料的样品，例如从新鲜的、迅速冷冻的或***固定石蜡包埋的肿瘤组织(FFPE)或者从新鲜分离的细胞或者从患者外周血中存在的CTC获得。可从正常的体细胞组织提取正常的未突变基因组DNA或RNA，然而在本发明的上下文中，种系细胞是优选的。种系DNA或RNA可从患有非血液学恶性肿瘤的患者中的外周血单个核细胞(PBMC)提取。虽然从FFPE组织或新鲜分离的单细胞提取的核酸是高度片段化的，但是其适合NGS应用。
用于外显子组测序的数种靶向NGS方法在文献中进行了描述(有关综述，参见例如Teer和Mullikin 2010：Human Mol Genet 19(2)，R145-51)，其所有均可与本发明联合使用。这些方法(被描述为例如基因组捕获、基因组分隔、基因组富集等)中有很多使用杂交技术并且包括基于阵列(例如，Hodges等2007：Nat.Genet.39，1522-1527)和基于液体(例如，Choi等2009：Proc.Natl.Acad.Sci USA 106，19096-19101)的杂交方法。用于DNA样品制备和后续外显子组捕获的市售试剂盒也是可获得的：例如，Illumina Inc.(San Diego，California)提供TruSeqTM DNA样品制备试剂盒和外显子组富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
为了在将例如肿瘤样品的序列与参照样品的序列(例如种系样品的序列)进行比较时降低检测癌症特异性体细胞突变或序列差异中假阳性发现的数量，优选地重复确定这些样品类型中一种或两种的序列。因此，优选地将参照样品的序列(例如种系样品的序列)确定两次、三次或更多次。作为替代或补充，将肿瘤样品的序列确定两次、三次或更多次。还可如下多于一次地确定参照样品的序列(例如，种系样品的序列)和/或肿瘤样品的序列：将基因组DNA中的序列确定至少一次，并将所述参照样品和/或所述肿瘤样品的RNA中的序列确定至少一次。例如，通过确定参照样品(例如种系样品)在重复之间的变化，可评估体细胞突变的预期假阳性比率(FDR)作为统计量。样品的技术重复应产生相同的结果，并且在该“相同间比较(same vs.same comparison)”中的任何检测到的突变均为假阳性。特别地，为了确定肿瘤样品相对于参照样品中体细胞突变检测的假发现率，可使用参照样品的技术重复作为参考来评估假阳性的数量。此外，可使用机器学习方法来将多个质量相关量度(例如，覆盖率或SNP质量)组合成单质量评分。对于给定的体细胞变异，可计数具有超标质量评分的所有其他变异，这使得能够对数据集中的所有变异进行排名。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含至少一个核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组产生的RNA例如通过一个或更多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然存在的RNA的经修饰RNA。这样的改变可包括非核苷酸物质的添加，例如添加到RNA的末端或内部添加，例如添加在RNA的一个或更多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并且优选地涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板产生且编码肽或多肽的“转录物”。通常来说，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区、3’-UTR和任选地poly(A)尾。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在本发明的上下文中，mRNA可由DNA模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。
根据本发明，可根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，可通过具有稳定化效果和/或提高RNA翻译效率的一种或更多种修饰来稳定化RNA和提高其翻译。这样的修饰例如在PCT/EP2006/009448中进行了描述，其通过引用并入本文。为了提高根据本发明使用的RNA的表达，可在编码区(即编码所表达肽或蛋白质的序列)中，优选地在不改变所表达肽或蛋白质的序列的情况下对其进行修饰以提高GC含量从而提高mRNA稳定性和进行密码子优化，并且因此增强在细胞中的翻译。
在本发明中使用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括对RNA的非天然存在于所述RNA中的任何修饰。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。去除这种未加帽的5’-三磷酸可通过用磷酸酶处理RNA来实现。
根据本发明的RNA可具有经修饰的核糖核苷酸，以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷被部分或完全，优选完全替换为胞苷。作为替代或补充，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷被部分或完全，优选完全替换为尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-末端上的帽结构，并且通常由通过不寻常的5’至5’三磷酸酯键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽，优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定RNA和/或增强RNA翻译(如果附接于RNA的话，优选在体内和/或在细胞中)的能力的5’-帽类似物。
向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物可通过在所述5’-帽或5’-帽类似物存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽共转录并入产生的RNA链中，或者可例如通过体外转录产生RNA并且可在转录后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)使5’-帽与RNA附接。
RNA可包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外修饰可为延伸或截短天然存在的poly(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如用来源于珠蛋白基因的3’-UTR交换已有的3’-UTR或者***来源于珠蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个，优选两个拷贝，所述珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。
与具有经掩盖poly-A序列的RNA相比，具有未掩盖poly-A序列的RNA更有效地翻译。术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”涉及通常位于RNA分子的3’末端的腺嘌呤基(A)残基的序列，并且“未掩盖poly-A序列”意指在RNA分子3’末端的poly-A序列以poly-A序列的A结束，并且除位于poly-A序列3’末端(即下游)的A之外，在此之后没有核苷酸。此外，约120个碱基对的长poly-A序列产生最佳的转录物稳定性和RNA翻译效率。
因此，为了提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以使其与poly-A序列联合存在，所述poly-A序列的长度优选为10至500，更优选30至300，甚至更优选65至200，并且尤其是100至150个腺苷残基。在一个尤其优选的实施方案中，poly-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，poly-A序列可以是未掩盖的。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及消除分子的一半活性、量或数目所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”。可预期具有长半衰期的RNA将长时间表达。
当然，如果根据本发明期望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，则可对RNA进行修饰以干扰如上所述提高RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能。
根据本发明，术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽、多肽或蛋白质，例如，通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽、多肽或蛋白质。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，可将RNA翻译成肽、多肽或蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中优选使用合适的细胞提取物在无细胞系统中体外合成RNA(特别是mRNA)的过程。优选地，克隆载体被应用于产生转录物。这些克隆载体通常被指定为转录载体并且根据本发明被术语“载体”所涵盖。根据本发明，本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸(特别是cDNA)，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的逆转录获得。
根据本发明的术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，信使RNA的链指导氨基酸序列组装以产生肽、多肽或蛋白质。
根据本发明可与核酸功能性地连接的表达控制序列或调控序列相对于核酸可以是同源的或异源的。如果编码序列和调控序列共价结合在一起，使得编码序列的转录或翻译受到调控序列的控制或影响，则它们“功能性地”连接在一起。如果编码序列待被翻译成功能性肽、多肽或蛋白质，则在调控序列与编码序列的功能性连接下，调控序列的诱导导致编码序列的转录，而不引起编码序列中的阅读框移位或编码序列不能翻译成期望的肽、多肽或蛋白质。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“调控序列”包含控制核酸转录或所得RNA翻译的启动子、核糖体结合序列和其他控制元件。在本发明的某些实施方案中，可控制调控序列。调控序列的精确结构可根据物种或根据细胞类型而变化，但通常包括参与启动转录或翻译的5’-非转录序列以及5’和3’非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。特别地，5’-非转录调控序列包含启动子区，所述启动子区包含用于功能性结合基因的转录控制的启动子序列。调控序列还可包含增强子序列或上游活化物序列。
优选地，根据本发明，将待在细胞中表达的RNA引入到所述细胞中。在根据本发明的方法的一个实施方案中，通过合适的DNA模板的体外转录获得待被引入到细胞中的RNA。
根据本发明，例如“能够表达…的RNA”和“编码…的RNA”的术语在本文中可互换使用，并且对于特定的肽或多肽意味着所述RNA如果存在于合适的环境中(优选在细胞中)可被表达以产生所述肽或多肽。优选地，根据本发明的RNA能够与细胞翻译装置相互作用以提供其能够表达的肽或多肽。
例如“转移”、“引入”或“转染”的术语在本文中可互换使用，并且涉及将核酸(特别是外源或异源核酸、特别是RNA)引入到细胞中。根据本发明，细胞可形成器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，核酸的施用作为裸核酸实现或与施用试剂组合来实现。优选地，核酸的施用以裸核酸的形式进行。优选地，RNA与稳定化物质(例如RNA酶抑制剂)组合施用。本发明还设想将核酸重复引入到细胞中以允许进行长时间的持续表达。
可用可与RNA缔合的任何载体来转染细胞，例如，通过与RNA形成复合体或形成其中封装或包封RNA的囊泡，从而导致与裸RNA相比RNA的稳定性提高。根据本发明可用的载体包括例如含脂质载体例如阳离子脂质、脂质体，特别是阳离子脂质体，以及胶束和纳米颗粒。阳离子脂质可与带负电荷的核酸形成复合体。根据本发明可使用任何阳离子脂质。
优选地，将编码肽或多肽的RNA引入细胞中，特别是在体内存在的细胞中，导致所述肽或多肽在细胞中表达。在一些特别的实施方案中，优选将核酸靶向特定细胞。在这样的一些实施方案中，适用于将核酸施用于细胞的载体(例如，逆转录病毒或脂质体)展示靶向分子。例如，可将分子例如对靶细胞上表面膜蛋白具有特异性的抗体或靶细胞上受体的配体并入到核酸载体中或可使其与核酸载体结合。在通过脂质体施用核酸的情况下，可将与和胞吞相关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入到脂质体制剂中，以能够靶向和/或摄取。这样的蛋白质涵盖对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内化的蛋白质的抗体、靶向胞内位置的蛋白质等。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选是完整细胞，即未释放其正常胞内组分例如酶、细胞器或遗传物质的具有完整膜的细胞。完整细胞优选地是有生存力的细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“细胞”包括原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。外源核酸在细胞内可如下存在：(i)本身自由分散、(ii)并入重组载体中、或(iii)整合到宿主细胞基因组或线粒体DNA中。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类的细胞。细胞可来源于大量组织类型并且包括原代细胞和细胞系。一些具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。在另一些实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或多肽。
术语“克隆扩增”是指其中使特定实体倍增的过程。在本发明的上下文中，该术语优选在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
例如“降低”或“抑制”的术语涉及引起在水平上优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，并且最优选75％或更大的总体降低的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全的抑制，即降低到零或基本上降低到零。
例如“提高”、“增强”、“促进”或“延长”的术语优选地涉及提高、增强、促进或延长约至少10％，优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少80％、优选至少100％、优选至少200％，并且特别是至少300％。这些术语还可涉及从零或者不可测量或不可检测的水平提高、增强、促进或延长至多于零的水平或者可测量或可检测的水平。
本发明提供了用于鉴定预测为可用于免疫治疗的氨基酸修饰的方法。氨基酸修饰存在于在患者的病变细胞中表达的肽或多肽中。术语“在患者的病变细胞中表达的肽或多肽”不一定意指该肽或多肽的表达已通过实验测试。而是意指在患者的病变细胞内存在编码该肽或多肽的开放阅读框，并且因此，该肽或多肽可能在患者的病变细胞中表达。
预测为可用于免疫治疗的氨基酸修饰可用于设计疫苗。具体地，疫苗可包含由病变细胞表达并且包含通过本发明方法预测为可用于免疫治疗的氨基酸修饰的肽或多肽，或者编码所述肽或多肽的核酸(例如RNA)。作为替代或补充，疫苗可包含疫苗肽或多肽，其包含由病变细胞表达的所述肽或多肽的片段，所述片段包含通过本发明方法预测为可用于免疫治疗的氨基酸修饰；或者编码所述疫苗肽或多肽的核酸(例如RNA)。
如果本发明的方法指示肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的片段(1)在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞反应，(2)当在相同MHC分子的情况下呈递时与具有不同T细胞受体的T细胞反应和/或(3)在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应，则疫苗肽或多肽优选至少包含肽或多肽的覆盖所述片段的序列或更长序列，即疫苗序列。
如果本发明的方法指示肽或多肽的包含疾病特异性氨基酸修饰的不同片段(1)在不同类别的MHC分子的情况下呈递和/或当在MHC分子的情况下呈递时与限制于不同MHC类别的T细胞反应，和/或(2)在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递和/或当在相同类别的不同MHC分子的情况下呈递时与限制于相同MHC类别的不同T细胞反应，则该疫苗肽或多肽优选至少包含肽或多肽的覆盖所述片段的序列或更长序列，即疫苗序列。
根据本发明，术语“疫苗”涉及在施用之后诱导免疫应答(特别是细胞免疫应答)的药物制剂(药物组合物)或产品，所述免疫应答识别并攻击病原体或病变细胞(例如癌细胞)。疫苗可用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”或“个性化癌症疫苗”涉及特定癌症患者并且意指癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
在一个实施方案中，根据本发明提供的疫苗可包含肽或多肽或者编码所述肽或多肽的核酸(优选RNA)，所述肽或多肽包含通过本发明方法预测为可用于免疫治疗的一个或更多个氨基酸修饰或者一种或更多种经修饰肽。
根据本发明提供的癌症疫苗在施用于患者时优选提供适用于刺激、致敏和/或扩增对所述患者的病变细胞(例如患者的肿瘤)具有特异性的T细胞的一个或更多个T细胞表位。T细胞优选地针对表达T细胞表位所源自的抗原的细胞。本文中描述的疫苗优选能够诱导或促进针对以用I类MHC呈递一种或更多种肿瘤相关新抗原为特征的癌症疾病的细胞应答，优选细胞毒性T细胞活性。靶向癌症特异性突变的疫苗将对患者的肿瘤具有特异性。
根据本发明提供的疫苗涉及以下疫苗，其在施用于患者时优选地提供一个或更多个T细胞表位，例如2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个且优选多至60个、多至55个、多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个T细胞表位，所述T细胞表位并入通过本发明方法预测为具有免疫原性的氨基酸修饰或经修饰肽。这样的T细胞表位在本文中也被称为“新表位”。通过患者的细胞(特别是抗原呈递细胞呈递这些表位)优选地导致T细胞在与MHC结合时靶向所述表位并且因此靶向表达所述T细胞表位所源自的抗原和在肿瘤细胞表面上呈递相同表位的患者肿瘤，优选原发性肿瘤以及肿瘤转移瘤。
本发明的方法可包括确定所鉴定的氨基酸修饰或经修饰肽用于癌症疫苗接种的可用性的进一步步骤。因此，进一步的步骤可包括以下一个或更多个：(i)评估修饰是否位于已知或预测的MHC呈递表位中；(ii)在体外和/或通过计算机测试修饰是否位于MHC呈递表位中，例如，测试修饰是否是被加工成MHC呈递表位和/或呈现为MHC呈递表位的肽序列的一部分；以及(iii)在体外测试所设想的经修饰表位是否能够刺激具有期望特异性的T细胞，例如患者的T细胞，特别是当存在于其天然序列环境中时，例如当侧翼为在天然存在肽或多肽中也侧接所述表位的氨基酸序列时，以及当在抗原呈递细胞中表达时。这样的侧翼序列各自可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个并且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。
根据本发明确定的经修饰肽可按其作为用于癌症疫苗接种的表位的可用性来排名。因此，在一个方面，本发明包括人工或基于计算机的分析方法，在所述分析方法中对所鉴定的经修饰肽进行分析并针对其在待提供的各种疫苗中的可用性进行选择。在一个优选的实施方案中，所述分析方法是基于计算算法的方法。优选地，所述分析方法包括确定表位和/或根据对其具有免疫原性的能力的预测来对其进行排名。
根据本发明鉴定并由本发明的疫苗提供的新表位优选以包含所述新表位的多肽(例如多表位多肽)或编码所述多肽的核酸(特别是RNA)的形式存在。此外，新表位可以以疫苗序列的形式存在于多肽中，即存在于其天然序列环境中，例如侧翼为在天然存在的肽或多肽中也侧接所述表位的氨基酸序列。这样的侧翼序列各自可包含5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个并且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。因此，疫苗序列可包含20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个并且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸。在一个实施方案中，新表位和/或疫苗序列在多肽中头对尾排列。
在一个实施方案中，新表位和/或疫苗序列通过接头(特别是中性接头)隔开。根据本发明的术语“接头”涉及添加在两个肽结构域(例如表位或疫苗序列)之间以连接所述肽结构域的肽。关于接头序列没有特别限制。然而，优选地，接头序列减小了两个肽结构域之间的空间位阻，被很好地翻译并且支持或允许表位加工。此外，接头应当不具有或仅具有很少的免疫原性序列元件。接头优选地不应当产生非内源性新表位，例如由相邻新表位之间的接合缝(junction suture)产生的那些，这可能产生不想要的免疫反应。因此，多表位疫苗应优选地包含能够降低不想要的MHC结合接合表位的数目的接头序列。Hoyt等(EMBOJ.25(8)，1720-9，2006)和Zhang等(J.Biol.Chem.，279(10)，8635-41，2004，)已经示出，富含甘氨酸的序列会损害蛋白酶体加工，并且因此使用富含甘氨酸的接头序列可最大限度地降低可由蛋白酶体加工的包含接头的肽的数量。此外，观察到甘氨酸抑制MHC结合沟位置中的强结合(Abastado等，J.Immunol.151(7)，3569-75，1993)。Schlessinger等(Proteins，61(1)，115-26，2005)已发现氨基酸序列中包含的氨基酸甘氨酸和丝氨酸导致更高效地翻译和被蛋白酶体加工的更具柔性的蛋白质，从而使得能够更好地接近编码的新表位。接头各自可包含3个或更多个、6个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个并且优选多至50个、多至45个、多至40个、多至35个或多至30个氨基酸。优选地，接头富含甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸。优选地，接头的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸。在一个优选的实施方案中，接头基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸构成。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e，其中a、b、c、d和e独立地为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的数，并且其中a+b+c+d+e与0不同且优选为2或更大、3或更大、4或更大或者5或更大。在一个实施方案中，接头包含如本文中描述的序列，包括实例中描述的接头序列，例如序列GGSGGGGSG。
在一个特别优选的实施方案中，将根据本发明的并入一个或更多个新表位的多肽(例如多表位多肽)以核酸(优选RNA，例如体外转录或合成RNA)的形式施用于患者，其可在患者的细胞例如抗原呈递细胞中表达以产生多肽。本发明还设想施用一种或更多种多重表位多肽，其出于本发明的目的被术语“多表位多肽”所包括，其优选以核酸(优选RNA，例如体外转录或合成RNA)的形式，其可在患者的细胞例如抗原呈递细胞中表达以产生一种或更多种多肽。在施用多于一种多重表位多肽的情况下，由不同多重表位多肽提供的新表位可不同或部分重叠。一旦存在于患者的细胞例如抗原呈递细胞中，根据本发明的多肽被加工以产生根据本发明鉴定的新表位。施用根据本发明提供的疫苗优选提供MHC I类呈递表位，所述表位能够引发针对表达MHC呈递表位所源自的抗原的细胞的CD8+ T细胞应答。施用根据本发明提供的疫苗还可提供MHC II类呈递表位，所述表位能够引发针对表达MHC呈递表位所源自的抗原的细胞的CD4+ T细胞应答。此外，施用根据本发明提供的疫苗可提供一个或更多个新表位(包括已知的新表位和根据本发明鉴定的新表位)以及一个或更多个不包含癌症特异性体细胞突变但是由癌细胞表达并且优选诱导针对癌细胞的免疫应答(优选癌症特异性免疫应答)的表位。
根据本发明提供的疫苗可以是重组疫苗。
在本发明上下文中的术语“重组的”意指“通过遗传工程制备的”。优选地，在本发明的上下文中的“重组实体”(例如重组多肽)不是天然存在的，并且优选是不天然组合的实体(例如氨基酸或核酸序列)组合的结果。例如，在本发明的上下文中的重组多肽可包含来源于不同蛋白质或者同一蛋白质的不同部分的数个氨基酸序列(例如新表位或疫苗序列)，其例如通过肽键或合适接头融合在一起。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可从天然来源中分离并且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。
本文中描述的药剂和组合物可被用于治疗患有疾病，例如特征在于存在表达抗原并呈递其片段的病变细胞的疾病的对象。一些特别优选的疾病是癌症疾病。本文中描述的药剂和组合物也可用于免疫接种或疫苗接种以预防本文中描述的疾病。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由起初来自于外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者其可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、不正常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可认为是可区别的类别。疾病通常不仅在身体上而且还在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生命的看法和个体性格。
术语“正常的”是指健康状态，或者健康对象或组织中的状况，即非病理状况，其中“健康的”优选意指非癌性的。
术语“与抗原相关的疾病”或“涉及抗原的疾病”是指牵涉抗原的任何疾病，例如以抗原或表达抗原的细胞的存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是癌症疾病(或简单地癌症)。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原(例如肿瘤相关抗原)。
根据本发明，“涉及表达抗原的细胞的疾病”意指在病变组织或器官的细胞中检测到抗原的表达。与健康组织或器官中的状态相比，在病变组织或器官的细胞中的表达可提高。提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，只在病变组织中发现表达，而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明，涉及表达抗原的细胞或与之相关的疾病包括癌症疾病。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的一些实例包括但不限于上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、***癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长，优选形成肿胀或病灶。“肿瘤细胞”意指通过迅速的不受控制的细胞增殖生长并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失，并且通常形成独特的组织团块，其可能是良性的、恶化前的或恶性的。
出于本发明的目的，术语“癌症”和“癌症疾病”与术语“肿瘤”和“肿瘤疾病”可互换使用。
“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是很复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离，侵袭胞外基质，渗透内皮基底膜以进入体腔和血管，以及然后在通过血液转运之后浸润靶器官。最终，在靶位点的新肿瘤，即继发性肿瘤或转移性肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后，也经常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可能保留并发展转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域性***系统的转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞与原始肿瘤中的细胞类似。这意味着，例如，如果卵巢癌转移至肝，则继发性肿瘤由异常卵巢细胞而不是异常肝细胞构成。肝中的肿瘤然后被称为转移性卵巢癌，而不是肝癌。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”涉及从原发性肿瘤或肿瘤转移瘤脱离并且在血流中循环的细胞。CTC可构成随后在不同组织中生长另外的肿瘤(转移)的种子。循环肿瘤细胞以约1至10CTC/mL全血的频率存在于患有转移性疾病的患者中。已开发了研究方法来分离CTC。本领域中已描述了数种研究方法来分离CTC，例如使用上皮细胞通常表达细胞黏附蛋白EpCAM(其在正常血细胞中不存在)的这一事实的技术。基于免疫磁珠的捕获涉及用已与磁性颗粒缀合的针对EpCAM的抗体处理血液样本，随后在磁场中分离标记的细胞。然后，将分离的细胞用针对另一上皮标志物细胞角蛋白以及常见的白细胞标志物CD45的抗体染色，以使罕见的CTC与污染白细胞区分开来。这种稳健且半自动化的方法以平均产量为约1CTC/mL且纯度为0.1％鉴定CTC(Allard等，2004：Clin Cancer Res 10，6897-6904)。用于分离CTC的另一种方法使用基于微流控的CTC捕获装置，其涉及使全血流过嵌入有80,000个微柱的室，所述微柱通过包被有针对EpCAM的抗体而变得具有功能性。CTC然后用针对细胞角蛋白或组织特异性标志物(例如***癌中的PSA或乳腺癌中的HER2)的二抗进行染色，并通过沿着三维坐标在多个平面中自动化扫描微柱来可视化。CTC芯片能够以50个细胞/ml的中位产率和1％至80％的纯度来鉴定患者中的细胞角蛋白化阳性循环肿瘤细胞(Nagrath等，2007：Nature 450，1235-1239)。用于分离CTC的另一种可能性是使用来自Veridex，LLC(Raritan，NJ)的CellSearchTM循环肿瘤细胞(CTC)测试，其对血管中的CTC进行捕获、鉴定和计数。CellSearchTM系统是美国食品和药品管理局(FDA)批准的用于全血中CTC计数的方法，其是基于免疫磁性标记和自动化数字显微术的组合。存在文献中描述的用于分离CTC的其他方法，所有这些方法均可与本发明联合使用。
当个体再次受到过去影响其的病症影响时，出现复发或再发。例如，如果患者曾患有肿瘤疾病，已经接受所述疾病的成功治疗，并且再次发生所述疾病，则所述新发生的疾病可被认为是复发或再发。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再发可以但不一定发生在原始肿瘤疾病的部位。因此，例如，如果患者曾患有卵巢肿瘤并且已接受了成功治疗，则复发或再发可为在与卵巢不同的部位处出现卵巢肿瘤或出现肿瘤。肿瘤的复发或再发还包括其中肿瘤出现在与原始肿瘤部位不同的部位以及出现在原始肿瘤部位的情况。优选地，患者已经接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，并且在与原始肿瘤部位不同的部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病或病症。设计用于引发或扩大免疫应答的免疫治疗被分类为活化免疫治疗，而降低或抑制免疫应答的免疫治疗被分类为抑制免疫治疗。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种，或者肿瘤免疫接种或肿瘤疫苗接种。术语“免疫治疗”还涉及免疫应答的操纵，以使得在自身免疫病(例如风湿性关节炎、***反应、糖尿病或多发性硬化)的情况下，将不合适的免疫应答调节成更合适的免疫应答。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了向个体施用抗原以诱导免疫应答的过程，例如，出于治疗或预防的原因。
术语“治疗性治疗”或简称“治疗”涉及改善个体的健康状况和/或延长(提高)个体的寿命的任何治疗。所述治疗可消除个体的疾病、停止或减慢个体中疾病发生、抑制或减慢个体中疾病的发生、降低个体中症状的频率或严重程度、和/或降低目前患有或以前患有疾病的个体中的再发。
术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及旨在在个体中防止疾病发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可互换使用。
术语“保护”、“预防”、“预防性”、“预防的”或“保护性”涉及在个体中预防和/或治疗疾病(例如肿瘤)的发生和/或传播。例如，预防性施用免疫治疗，例如通过施用本文中所述的组合物，可保护接受个体免于肿瘤的发生。例如，治疗性施用免疫治疗，例如通过施用本文中所述的组合物，可阻止疾病的发生，例如导致抑制肿瘤的进展/生长。这包括减缓肿瘤的进展/生长，特别是破坏肿瘤的进展，其优选导致消除肿瘤。治疗性施用免疫治疗可保护个体例如免于已有肿瘤的传播或转移。
术语“个体”或“对象”涉及脊椎动物，特别是哺乳动物。例如，在本发明上下文中的哺乳动物是人；非人灵长类；家养哺乳动物，例如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等；实验动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等；以及圈养动物，例如动物园的动物。术语“对象”还涉及非哺乳动物脊椎动物，例如鸟类(特别是家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡)，并且涉及鱼类(特别是养殖鱼，例如鲑鱼或鲶鱼)。如本文中使用的术语“动物”还包括人。优选地，术语“患者”涉及患病个体。
本文中所述的药剂可以以任何合适的药物组合物的形式施用。术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂或其盐的制剂，优选与药用赋形剂(例如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂)一起。所述药物组合物可用于通过将所述药物组合物施用于个体来治疗、预防疾病或病症、或者降低其严重程度。药物组合物在本领域中也被称为药物制剂。药物组合物可局部或全身性施用。
术语“全身性施用”是指施用治疗有效剂以使得药剂以显著量广泛地分布于个体的体内并且产生生物学效果。根据本发明，优选地施用是通过肠胃外施用进行。
术语“肠胃外施用”是指施用治疗有效剂以使得药剂不通过肠。术语“肠胃外施用”包括静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用，但不限于此。
在一个特别优选的实施方案中，将根据本发明的组合物施用于肌肉组织，例如骨骼肌。因此，例如通过肌内注射的肌内施用是优选的施用途径。
施用可以以多种方式实现。在一个实施方案中，根据本发明的组合物通过注射施用。在一个优选的实施方案中，注射通过针进行。可使用无针注射作为替代方案。
本发明的药物组合物可包含至少一种佐剂。术语“佐剂”涉及以下化合物，其当与抗原或抗原肽组合施用于个体时延长或增强或加速免疫应答。认为佐剂通过以下一种或更多种机制发挥其生物学活性：包括抗原表面的增大、抗原在体内的保留延长、抗原释放的延迟、抗原靶向巨噬细胞、抗原摄取的增多、抗原加工的增强、刺激细胞因子释放、刺激和活化免疫细胞(例如B细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞)以及免疫细胞的非特异性活化。佐剂包含异质化合物组，例如油乳剂(例如弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、无机化合物(例如alum)、细菌产物(例如百日咳毒素(Bordetella pertussis toxin))或免疫刺激复合物。佐剂的一些实例包括皂苷、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、生育酚或alum，但不限于此。
根据本发明的药物组合物通常以“药学有效量”和“可药用制剂”施用。
术语“药学有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病进程。这包括减慢疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病的期望反应也可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或者预防其发生。本文中描述的组合物的有效量将取决于待治疗的病症；疾病的严重程度；患者的个体参数，包括年龄、生理状况、身高和体重；治疗持续时间；伴随治疗(如果存在的话)的类型；具体施用途径；以及类似的因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者的反应不足够的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的更局部化的施用途径实现有效地更高的剂量)。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
本发明的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂、载体和任选地其他治疗剂。优选地，本发明的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
术语“赋形剂”旨在表示在药物组合物中但不是活性成分的所有物质，例如黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释试剂和/或稀化剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬和/或混合介质中的任意一种或更多种。
术语“载体”涉及适用于向人施用的一种或更多种相容性固体或液体填料或稀释剂。术语“载体”涉及天然或合成的有机或无机组分，其与活性组分组合以促进活性组分的应用。优选地，载体组分是无菌液体，例如水或油，包括来源于矿物油、动物或植物的那些，例如花生油、大豆油、芝麻油、向日葵油等。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作水性载体化合物。
用于治疗用途的可药用载体或稀释剂在制药领域中是公知的，并且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaro编辑.1985)中。合适的载体的一些实例包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可豆脂等。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
可根据预期的施用途径和标准药学实践选择药用载体、赋形剂或稀释剂。本发明的药物组合物可包含(作为载体、赋形剂或稀释剂或者作为其补充)任何合适的黏合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂和/或增溶剂。合适的黏合剂的一些实例包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖)、无水乳糖、自由流动乳糖(free-flow lactose)、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶(例如***胶、西黄蓍胶或藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的一些实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至矫味剂。防腐剂的一些实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和助悬剂。
在一个实施方案中，组合物是水性组合物。水性组合物可任选地包含溶质，例如盐。在一个实施方案中，组合物是冻干组合物的形式。冻干组合物可通过冷冻干燥相应的水性组合物来获得。
本文中提供的药剂和组合物可单独使用或与其他治疗方案(例如手术、辐照、化学治疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或不相关的))组合使用。
通过附图和实施例对本发明进行详细描述和说明，附图和实施例仅仅用于举例说明目的，并且不意味着是限制性的。由于描述和实施例，技术人员可理解同样包括在本发明中的另外的实施方案。
附图
图1.用于诱导针对新表位的纯CD4+ T细胞应答或双重CD4+/CD8+ T细胞应答的示例性示例。a，针对载有覆盖ST5(肿瘤发生抑制因子5(suppressor of tumorigenicity 5))蛋白中突变新表位的OLP的自体DC读出用患者的五表位RNA刺激的患者P19中的疫苗接种前和疫苗接种后CD4+和CD8+ T细胞富集培养物。b-c，针对载有覆盖UTP6(小亚基加工体(processome)组分)蛋白中突变新表位的OLP的自体DC在IFNγ-ELISpot中读出用患者特异性五表位RNA刺激的患者P19中的疫苗接种前和疫苗接种后CD4+和CD8+ T细胞富集培养物。c，通过流式细胞术对刺激之后CD4+和CD8+ T细胞培养物的纯度进行质量控制。
图2.从患者P01的CD8+ T细胞克隆的NARFL-E62K特异性TCR的特异性。针对经HLA-A*3101转染并用覆盖突变或野生型序列的单独15聚体肽脉冲的K562细胞的识别通过IFNg-ELISpot测试了针对NARFL(核前层蛋白A识别因子样(Nuclear Prelamin A RecognitionFactor Like))蛋白中突变的经TCR#1、#5、#7或#9转染的CD8+ T细胞。
图3.在新表位RNA疫苗接种的情况下复发风险高的黑素瘤患者中的疾病控制。a，将从单个TIL克隆的编码TCR#8的TCR-α/β链的RNA转染到健康供体来源的CD8+ T细胞中，并在经RETSAT-P546S OLP脉冲的表达患者中两种HLA I类分子的K562细胞上进行测试。b，基于两个HLA等位基因的潜在新表位呈递的描述。突变加有下划线(另参见图4)
图4.针对由相同突变产生的两个不同HLA限制性T细胞表位的CD8+ T细胞应答的诱导。a，对载有单独P17-RETSAT-P546S OLP的自体DC进行的P17中疫苗后CD8+ T细胞的IFNγELISpot测定测试。b，通过多聚体染色进行的来自患者P17的疫苗接种后TIL中识别HSCVMASLR(P17-RETSAT-P546(由OLP 3和4编码)中预测最好的HLA A*6801限制性最小表位)的CD8+ T细胞的检测。c，识别OLP 1和2的获自患者P17中TIL的两个HLA B*3701限制性RETSAT-P546S-TCR的特异性。
图5：针对新表位由CD4+和CD8+ T细胞二者介导的预先存在的免疫应答
A，针对载有覆盖靶标001_107的OLP的库的自体DC在IFNγ-ELISpot中读出用OLP库刺激的患者P01中的CD4+和CD8+ T细胞富集培养物。靶标001_107不进行疫苗接种。B，通过流式细胞术对刺激之后CD4+和CD8+ T细胞培养物(IVS)的纯度进行质量控制。C，针对载有覆盖靶标006_003的OLP的库的自体DC在IFNγ-ELISpot中读出用OLP库刺激的患者P06中的CD4+和CD8+ T细胞富集培养物。靶标006_003不进行疫苗接种。D，通过流式细胞术对刺激之后CD4+和CD8+ T细胞培养物的纯度进行质量控制。
实施例
本文中使用的技术和方法在本文中进行了描述或以本身已知的方式并且如例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y中所述实施。除非特别地指出，否则包括试剂盒和试剂使用的所有方法都根据制造商的信息进行。
实施例1：材料和方法
研究设计
这项多中心I期研究(NCT02035956)的主要目标是评估疫苗的安全性和疫苗诱导的抗原特异性免疫应答。
这项研究是根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)和良好临床实践指南(Good Clinical Practice Guidelines)并且在每个参与地点的机构审查委员会或独立道德委员会以及主管监管当局的批准之下进行的。所有患者均提供了书面知情同意书。
符合条件的患者≥18岁，患有在任何治疗阶段为完全缓解、部分缓解或病情稳定的IIIA-C或IV期恶性黑素瘤(AJCC 2009黑素瘤分类)。如果具有转移的患者可用活性化合物治疗直至其个性化疫苗可用，则其就符合条件。患者必须具有适当的血液学和终器功能。主要排除标准是临床上相关的自身免疫病、HIV、HBV、HCV和急性EBV或CMV感染以及脑转移。常规治疗为在43天内注射8次；继续治疗视研究者的判断而定。将RNA五表位在1.0mg/mL林格液(Ringer’s solution)(Rotexmedica或BAG Healthcare)中稀释，并注射到单独的腹股沟***中。每次治疗向10位患者施用500μg，并且向三位患者施用1000μg，以探讨两种不同的剂量范围。
关键研究评估
用于免疫原性测试的白细胞去除术(leukaphereses)在第一次疫苗注射之前(第12次访视，被称为“疫苗接种前”)和第8次疫苗注射之后(第20次访视；被称为“疫苗接种后”)进行。
在基线(第1次访视)、疫苗接种前(第12次访视)、第90天(第21次访视)和持续治疗结束时(第26次访视)时根据局部成像指南和RECIST 1.1版以及免疫相关应答标准(irRC)指南(Wolchok，J.D.等Clin.Cancer Res.15，7412-20(2009))通过CT扫描和MRI对胸、腹、脑进行成像。根据CTCAE v4.03从1级到5级对安全性进行了表征。
此处提供的数据基于探索性临时分析，其中数据截止日期为2016年11月。
患者材料
***固定且石蜡包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE)或新鲜冷冻的肿瘤组织是在常规诊断性切除术时获得，并且在H&E染色切片中评估肿瘤内容物。
新鲜的肿瘤样品用于制备肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)和原代肿瘤细胞系。
TIL如先前公开的是由在X-Vivo 15培养基(Lonza)中培养两周的小块新鲜肿瘤组织生长而来，所述培养基具有2％人血清白蛋白(CSL-Behring)和6000U/mL IL-2(Proleukin S，Novartis)(Dudley，M.E.，Wunderlich，J.R.，Shelton，T.E.，Even，J.&Rosenberg，S.A.J.Immunother.26，332-42)。此后，在存在30ng/mL抗CD3IgG2a(克隆OKT3，eBiosciences)和300U/mL IL-2(Proleukin S，Novartis)的情况下使用经辐照的同种异体PBMC作为饲养细胞使TIL扩增两周。
为了产生患者来源的黑素瘤细胞系，将新鲜的肿瘤组织片段在补充有15％FCS(Biochrome AG)的RPMI1640培养基(Life Technologies)中进行培养。
通过Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences)密度梯度离心从健康供体的血沉棕黄层或从黑素瘤患者的外周血样品分离用于免疫监测或作为制造过程起始原料而获得的PBMC。如先前所述产生未成熟的DC(DC)(Holtkamp，S.等Blood 108，4009-17(2006))。
下一代测序
使用改良版的Qiagen QIAamp DNA FFPE组织试剂盒从具有3个10μm卷(curl)的FFPE肿瘤组织中提取DNA，一式三份。使用Qiagen RNeasy FFPE试剂盒从FFPE肿瘤卷提取RNA，一式两份。为了从新鲜冷冻肿瘤样品或细胞提取DNA和RNA，分别使用了Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒以及RNeasy微型试剂盒。
提取的核酸用于产生多种文库。使用Illumina TruSeq RNA样品制备试剂盒V2并使用1μg总RNA作为输入从FFPE肿瘤或细胞系RNA制备RNA-Seq文库，一式两份。使用AgilentSureSelect XT V4Human All Exon由1至3μg FFPE肿瘤DNA和匹配的PBMC DNA构建DNA外显子组捕获文库，一式两份。
通过使用microTUBE-15(Covaris Ltd)将总体积为15μL的100ng基因组DNA片段化至平均片段长度为约160bp制备MZ-GaBa-018和匹配PBMC的用于全基因组测序(wholegenome sequencing，WGS)的NGS文库。使用25ng片段化gDNA作为输入用NEB的用于
对于下一代测序(NGS)，将文库稀释至2nM或10nM，并使用Illumina TruSeq PE聚类试剂盒v3-cBot-HS以10pM进行聚类。每个外显子组捕获文库分开在一个泳道中进行测序，而RNA文库复制品在一个泳道中以2重(2-plex)进行测序。使用两个Illumina TruSeqSBS Kit v3-HS在Illumina HiSeq 2500平台上对所有文库进行配对末端50nt测序50个循环。将MZ-GaBa-018细胞系和匹配PBMC WGS文库分别分布在4条泳道上，并使用IlluminaTruSeq SBS Kit v3-HS在同一平台上进行配对末端100nt测序200个循环。
生物信息学和突变发现
单个患者的所有突变组相关数据分析步骤均由以Python编程语言实现的软件流水(software pipeline)协调。对于DNA文库，最少需要150×106个配对末端50nt读出，而对于RNA文库，最少需要75×106个配对末端50nt读出。
对于突变检测，用bwa将DNA读出与参照基因组hg19进行比对(Li，H.&Durbin，R.Bioinformatics 25，1754-1760(2009))。分析来自肿瘤样品和匹配正常样品的复制外显子组的单核苷酸变体。鉴定正常样品中具有推定纯合子基因型的基因座并对其进行了过滤以保留对单核苷酸变体的高置信度调用。进一步检查剩余位点的推定纯合子或杂合子突变事件。过滤可疑位点以除去潜在的假阳性。通过分别测试重复之和及重复二者来将重复并入。单核苷酸变体的最终列表由正常样品中的高置信度纯合子位点和肿瘤样品中的高置信度杂合子或纯合子突变事件构成。将所鉴定变体的基因组座标与UCSC已知基因转录物座标进行比较，以使变体与基因、转录物、潜在氨基酸序列变化和RNA-Seq来源表达值相关联。
对于RNA-Seq，使用bowtie(Langmead，B.，Trapnell，C.，Pop，M.&Salzberg，S.L.Genome Biol.10，R25(2009))将RNA读出与hg19参照基因组和转录物组进行比对，并通过与UCSC已知基因转录物和外显子坐标进行比较然后归一化为RPKM单位来确定基因表达(Mortazavi，A.等Nat.Methods 5，1-8(2008))。
新表位优先化和选择
通过以下不断发展的操作从已鉴定的单核苷酸变体中选择多至46个预测的变体：a)去除无义变体，并通过非零外显子-和转录物表达进行过滤；随后首先通过外显子表达并且然后通过HLA I类结合预测评分使用稳定分类算法进行分类，并选择多至46个变体(P01-P04)。b)去除无义变体，并通过非零外显子-和转录物表达以及RNA-Seq数据中的非零变体频率进行过滤；随后首先通过外显子表达并且然后通过HLA I类结合预测评分使用稳定分类算法进行分类，并选择多至23个靶肽序列；随后首先通过HLA I类结合预测评分并且然后通过外显子表达使用稳定分类算法对剩余靶肽序列进行分类，并选择多至23个另外的靶肽序列；这两个选择步骤不允许产生多于46个选择变体(P05-P07、P09-P12)，以及c)去除无义变体，并通过非零外显子-和转录物表达以及RNA-Seq数据中的非零变体频率进行过滤；随后首先通过外显子表达并且然后通过HLA II类结合预测评分使用稳定分类算法进行分类，并选择多至20个基因表达≥10RPKM的靶肽序列；随后首先通过表达并然后通过HLA I类结合预测评分使用稳定分类算法对剩余靶肽序列进行分类，并选择多至20个另外的靶肽序列；随后首先通过HLA I类结合预测评分并然后通过外显子表达使用稳定分类算法对剩余靶肽序列进行分类，并补至46个选定变体(P17、P19)。每位患者多至十个突变靶肽的最终选择需要基于MHC I和MHC II结合预测、基因表达和变体等位基因频率评价靶肽的靶标选择委员会的决定。
HLA结合亲和力是通过IEDB T细胞预测工具的IEDB推荐模式(Kim，Y.等NucleicAcids Res.40，W525-30(2012))(2.5版)使用所有含变体8-11聚体(对于HLA-A/B)或15-聚体(对于HLA-DRB/DQB结合评估)进行预测。在单变体的所有预测中，最好共识评分(consensus score)与各个变体相关。
基于该数据，选择了单核苷酸变体的一个短列表用以通过Sanger测序进行验证。
验证性Sanger测序
对于引物设计，从参照基因组中提取侧接突变位点的基因组序列，并用作primer3软件的输入(Untergasser，A.等Nucleic Acids Res.40，e115(2012)；Koressaar，T.&Remm，M.Bioinformatics 23，1289-91(2007))。使用blast(Kent，W.J.Genome Res.12，656-64(2002))将输出引物对与参照基因组比对。去除与脱靶基因座对齐的引物对，并使剩余最佳引物对返回每个输入位点。
Sanger测序是如下进行的：通过PCR(在95℃下初始活化15分钟，然后是35个以下循环：在94℃下变性30s、在60℃下退火30s、在72℃下延伸30s，以及在72℃下最终延伸6分钟)由肿瘤组织和PBMC DNA扩增每个选定的突变基因座。每种PCR产物使用QIAxcel(Qiagen)装置进行质量控制，并通过ExoI/AP处理或MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化。Sanger测序通过Eurofins/MWG Ebersberg，Germany进行。
体外转录的RNA的制备
制备是根据GMP(良好生产规范)准则进行的。将编码五个推定新表位的合成DNA片段克隆到起始载体中，该载体包含sec-和MITD-结构域(Kreiter，S.等J.Immunol.180，309-318(2008))用以优化通向HLA I和II类途径的路线并且包含改善的RNA稳定性和翻译效率的骨架序列元件(Holtkamp，S.等Blood 108，4009-17(2006))。将DNA线性化，通过分光光度法定量，并在洁净室环境中在存在7.5mM ATP、CTP、UTP、GTP和3mM β-S-ACA(D1)帽类似物的情况下(Kuhn，A.N.等.Gene Ther.17，961-971(2010))如先前所述(Grudzien-Nogalska，E.等Methods Mol.Biol.969，55-72(2013))用T7RNA聚合酶进行体外转录。使用磁性颗粒(Berensmeier，S.Appl.Microbiol.Biotechnol.73，495-504(2006))纯化RNA，并通过凝胶电泳和微流控毛细管电泳(Experion，Biorad)评估完整性。进一步分析包括确定浓度、外观、pH、渗量浓度(osmolality)、效力、内毒素水平和无菌性。
PBMC的体外刺激
使用微珠(Miltenyi Biotec)从冷冻保存的PBMC分离CD4+和CD8+ T细胞。将T细胞CD4-或CD8-耗尽的PBMC静置过夜。用编码患者特异性突变靶标、eGFP、流感病毒基质蛋白1(M1)或破伤风p2/p16序列(阳性对照)的RNA对CD4-或CD8-耗尽的PBMC进行电穿孔，在37℃下静置3小时并以15Gy辐照。然后，将CD4+/CD8+ T细胞与经电穿孔且辐照的抗原呈递细胞以效应物与靶标之比为2∶1合并。一天之后，添加包含10U/mL IL-2(Proleukin S，Novartis)和5ng/mL IL-15(Peprotech)的新鲜培养基。在建立培养物之后7天补充IL-2。在刺激11天之后，通过流式细胞术分析细胞并用于ELISpot测定。
ELISpot
将预先包被有对IFNγ具有特异性的抗体(Mabtech)的Multiscreen过滤板(MerckMillipore)用PBS洗涤，并用包含2％人血清白蛋白(CSL-Behring)的X-Vivo 15(Lonza)封闭1至5小时。用经RNA电穿孔或载有肽的自体DC、黑素瘤细胞系或者HLA I类或II类转染K562细胞刺激0.5-3×105个效应细胞/孔16至20小时(对于TIL，40小时)。为了分析离体T细胞应答，将冷冻保存的PBMC在37℃下静置2至5小时之后进行ELISpot。所有测试均一式两份或一式三份进行，并且包括测定阳性对照(葡萄球菌肠毒素B(StaphyloccocusEnterotoxin B)(Sigma Aldrich))以及来自具有已知反应性的参照供体的细胞。用生物素缀合的抗IFNγ抗体(Mabtech)，然后与ExtrAvidin-碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)和BCIP/NBT底物(Sigma-Aldrich)孵育使斑点可视化。使用CTL的
多聚体染色和数据分析
使用带有来自免疫原性突变的9个或10个氨基酸长表位的dextramer(Immudex)鉴定了突变特异性CD8+ T细胞。首先用多聚体对细胞进行染色，在此之后进行细胞表面标志物染色(CD28 CD28.8、CD197 150503、CD45RA HI100、CD3 UCHT1、CD16 3G8、CD14、MΦP9、CD19 SJ25C1、CD27L128、CD279EH12、CD8 RPA-T8(全部BD)和CD4 OKT4Biolegend)和活-死染色(DAPI BD)。然后，在BD LSR Fortessa SORP上获得染色的细胞。在CD3(或CD8)阳性、CD4/CD14/CD16/CD19阴性或CD3(或CD8)阳性/CD4阴性事件中鉴定出单态、活的、多聚体阳性事件。通过缺少对HLA-A*0201+血液供体的染色，示出了HLA-A*0201dextramer对患者特异性新表位的特异性。
胞内细胞因子染色
以10∶1 E∶T比例添加用编码单个新表位的RNA电穿孔的自体DC，并在存在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)和莫能菌素(Monensin)的情况下于37℃下培养约16小时。针对生存力对细胞进行染色(可固定生存力染料eFluor506，eBioscience)，然后针对表面标志物进行染色(CD8 SK1 BD，CD4OKT4，Biolegend)。在透化之后，进行胞内细胞因子染色(IL-2MQ1-17H12、IFNγB27(全部BD)和TNFα Mab11 Biolegend)，并在BD FACS Canto II(BectonDickinson)上获得样品。
单细胞分选
在对PBMC、纯化的CD8+或CD4+ T细胞或TIL进行抗原特异性扩增11天之后，对单抗原特异性T细胞进行分选。在分选之前，用经编码相应新抗原或对照抗原的IVT RNA转染的2×105个自体DC再刺激2×106个扩增的T细胞。在16至20小时之后，收获细胞，并用针对CD14、CD19、CD3、CD8、CD4、CD137、CD134的荧光色素缀合抗体(全部均来自BD Biosciences)以及使用IFNγ分泌测定试剂盒(Miltenyi Biotec)用针对IFNγ的荧光色素缀合抗体进行处理。在BD FACS Aria流式细胞仪(BD Biosciences)上进行单新抗原特异性T细胞的分选。在包含3T3-L1载体细胞的96孔V型底板(Greiner Bio-One)中每孔收获一个双阳性细胞(IFNγ/CD8、CD137/CD8、IFNγ/CD4或CD134/CD4)，离心并储存在-65℃至-85℃。
新表位特异性TCR的克隆
如先前所述(Simon，P.等Cancer Immunol.Res.2，1230-44(2014))，从单T细胞克隆TCR基因。简而言之，将用Micro RNeasy试剂盒(Qiagen)提取的总RNA用于用RevertAidH-逆转录酶(Thermo Fisher)进行模板转换cDNA合成，然后使用PfuUltra Hotstart DNA聚合酶(Agilent)进行预扩增。将所得cDNA的等分试样用于Vα-/Vβ基因特异性多重PCR。在毛细管电泳系统(Qiagen)上分析产物。将具有430至470bp条带的样品在琼脂糖凝胶上进行尺寸分级，切下条带并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。对纯化的片段进行测序，并使用IMGT/V-Quest工具(Brochet，X.，Leffanc，M.-P.&Giudicelli，V.Nucleic Acids Res.36，W503-8(2008))分析相应的V(D)J接合体。对新的和有效重排的相应TCR链的DNA进行NotI消化，并将其克隆到包含合适骨架的pST1载体中，以体外转录完整的TCR-α/β链(Simon，P.等Cancer Immunol.Res.2，1230-44(2014))。
使用TCR-Typer试剂盒(BioNTech Diagnostics)对来自PBMC的总RNA进行TCR-α/β深度测序。使用2×300bp配对末端化学在Illumina MiSeq测序仪上对所得的DNA文库进行测序。用Typer Toolbox软件分析测序数据。每个样品的总TCR读出的数目的范围为1.1×106至1.5×106。
qRT-PCR
RNA和cDNA分别用ExpressArt FFPE Clear RNAready试剂盒(AmpTec)和带有gDNAEraser的PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara Bio Inc.)产生。使用BioMarkTM HD系统
免疫组织化学
在对3至4μm FFPE切片进行脱蜡处理之后，将载片在补充有0.05％吐温-20的10mM柠檬酸(pH 6.0)中于120℃下煮沸十分钟进行抗原修复，然后淬灭(通过0.3％H2O2；15分钟)，并在室温下用PBS中10％山羊血清封闭(30分钟)。
将载片在封闭缓冲液中与0.2μg/mL抗人CD3(F7.2.38；Dako)、0.2μg/mL抗人CD8(C8/144B；Dako)、1μg/mL抗-人FoxP3(236A/E7；Abcam)、1∶200抗PD-L1(13684；CellSignaling Technologies)或1∶2500抗β-2-微球蛋白(D8P1H；Cell SignalingTechnologies)在2至8℃下孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗(BrightVision HRP，Immunologic)与红色底物-色原溶液(VectorRed；Vector Labs)一起使抗体结合可视化。肿瘤细胞用1μg/mL的Melan-A特异性抗体(A103，Dako)进行染色。
随后将切片用Mayer苏木精(Carl Roth GmbH)进行复染，并通过基于计算机的分析(Definiens Developer)进行评价。
为了进行分析，对载片进行扫描(Axio.Scan；Zeiss)，并通过计算机化图像分析软件(Developer，Definiens)对人工预限定的肿瘤、正常组织和坏死区域进行定量。在分类为肿瘤组织的区域中确定CD3、CD8和FoxP3TIL的数目。
HLA抗原的克隆
HLA抗原由服务提供商(Eurofins Genomics)根据各自的高分辨率HLA分型结果合成。使用DQA1_s(PHO-GCC ACC ATG ATC CTA AAC AAA GCT CTG MTG C)和DQAl_as(TAT GCGATC GCT CAC AAK GGC CCY TGG TGT CTG)引物用2.5U Pfu聚合酶从供体特异性cDNA扩增HLA-DQA序列。将HLA抗原克隆到经适当消化的IVT载体中(Simon，P.等CancerImmunol.Res.2，1230-44(2014))。
向细胞中的RNA转移
将RNA添加至悬浮于在预冷4mm间隙无菌电穿孔比色皿(Bio-Rad)中的X-VIVO 15培养基(Lonza)中的细胞。使用BTX ECM 830方波电穿孔系统进行电穿孔(T细胞：500V/3ms/1脉冲；iDC：300V/12ms/1脉冲；大量PBMC：400V/6ms/1脉冲；MZ-GaBa-018：225V/3ms/2脉冲；K562：200V/8ms/3脉冲)。
肽
使用被称为重叠肽库(overlapping peptide pool，OLP)的覆盖27聚体新抗原序列(每个新抗原4个OLP)或对照抗原(HIV-gag，TPTE)具有11个氨基酸重叠的合成15-聚体肽，或8至11聚体表位。所有合成肽均购自JPT Peptide Technologies GmbH，并溶解在具有10％DMSO的AquaDest.(Aqua B.Braun，BRAUN Melsungen)中至终浓度为3mM。
流式细胞术分析
使用针对TCR-β链的合适可变区家族或恒定区的PE-或FITC-缀合的抗TCR抗体(Beckman Coulter)，以及FITC-或APC-标记的抗CD8/-CD4+抗体(BD Biosciences)通过流式细胞术分析转染TCR基因的细胞表面表达。通过用FITC标记的HLA II类特异性抗体(Beckman Coulter)和PE标记的HLA I类特异性抗体(BD Biosciences)染色检测用于评价TCR转染T细胞的功能的抗原呈递细胞的HLA抗原。流式细胞术分析是在BD FACSCantoTM II分析型流式细胞仪(BD Biosciences)上进行的。使用FlowJo软件(Tree Star)的第十版分析获得的数据。
细胞毒性测定
如先前所述进行基于萤光素酶的细胞毒性测定(Omokoko，T.A.等J.Immunol.Res.2016，9540975(2016))。将用单独或与B2M RNA组合的萤光素酶RNA转染的1×104个靶细胞与突变特异性效应T细胞(OKT3活化的TCR转染CD8+ T细胞或CD4+/CD8+IVS T细胞)共培养19至25小时。添加包含D-萤光素(BD Biosciences；终浓度1.2mg/mL)的反应混合物。一小时之后，使用Tecan Infinite M200阅读器(Tecan)测量发光。通过测量总萤光素酶活性的降低计算细胞杀伤。通过萤光素酶介导的萤光素氧化测量活细胞。根据下式计算比杀伤：
凋亡测定
对于胱天蛋白酶(caspase)3/7活化凋亡测定(IncuCyte)，将每孔1×104个黑素瘤细胞和20×104个效应T细胞平板接种在96孔Corning板中持续24小时。以5mM贮存液(EssenBioscience)的1∶1000稀释度添加胱天蛋白酶3/7试剂，每种条件一式三份。在IncuCyteZoom Live-content成像系统(Essen Bioscience)中于37℃，5％CO2下以10倍放大倍数对细胞成像。每小时获得图像，持续24小时，4个图像/孔。使用IncuCyte分析软件分析数据，以检测和量化绿色(凋亡)细胞/图像。使用GraphPad Prism软件绘制每个时间点带有SD的绿色物体计数的平均值。
实施例2：用新表位进行个体化RNA疫苗接种的临床可行性和有利安全性
先前我们已经描述了关于设计和产生编码多个体细胞突变的RNA疫苗(以下为“新表位RNA疫苗”)的个体化相关操作，从肿瘤突变的全面定位开始到个体疫苗组合物的制造和发布(Kreiter，S.等Nature 520，692-696(2015)；Vormehr，M.等J.Immunol.Res.2015，6(2015)；Kranz，L.M.等Nature 534，396-401(2016))。这些操作被进一步开发为符合监管准则的标准化方法。
通过对来自常规冷冻或***固定、石蜡包埋(FFPE)肿瘤活检物和来自血细胞(作为健康组织DNA的来源)的核酸进行外显子组和RNA测序鉴定III期和IV期黑素瘤患者中表达的非同义突变。应用了两个独立的原理对突变进行排名。一个使用与突变编码RNA的高表达水平组合的预测的对患者HLA II类分子的高亲和力结合。另一个基于预测的HLA I类结合。突变等位基因频率和相对转录值作为进一步的区分因素，以优先化具有相当的预测HLA结合亲和力的突变。通过Sanger测序验证使肿瘤特异性体细胞突变优先化。
每位患者选择10个突变(患者P09只有5个)，并将其改造成两个合成RNA，每个合成RNA编码5个代表突变之一的27聚体肽(五表位RNA)。根据良好生产规范(GoodManufacturing Practice，GMP)等级过程产生高纯度RNA，成功率为100％。RNA疫苗的中位粗制时间为68天(范围为49至102天)。由于首次人体使用和研究阶段的监管要求，每种制造的个体化疫苗都经过了广泛的分析测试，从选择突变到疫苗发布，将总中位时间延长至103天(范围为89到160天)。
向患有NY-ESO-1和/或酪氨酸酶阳性黑素瘤的患者提供编码这两种肿瘤相关共有自身抗原(TAA)的RNA疫苗作为桥接，直至其新表位RNA疫苗发布。在超声控制下，将八个剂量的单独RNA疫苗经皮注射到***中。此后，抽取疫苗接种后血液样品进行免疫原性测试。根据研究者的判断，继续进行新表位疫苗接种。
筛选20位患者参加临床试验，其中16位根据纳入和排除标准发现符合条件并加入该研究。两位患者撤回了其同意书，且一位患者由于新诊断出迅速进展的脑转移而无法开始研究治疗。因此，总共有13位患者接受了新表位RNA疫苗，在9位患者中在此之前接受了桥接TAA RNA疫苗。
所有患者均成功完成了治疗，接受多至20个新表位RNA疫苗计量。对于黑素瘤，每位患者检测到的突变数量(范围为69至1440)在预期范围内(Lawrence，M.S.等Nature 499，214-8(2013)；Vormehr，M.等Curr.Opin.Immunol.39，14-22(2016))。10位患者的BRAF或HRAS/NRAS基因中具有最常见的黑素瘤驱动突变(Hodis，E.等Cell 150，251-263(2012))。突变特征主要为UV诱发的黑素瘤典型的胞嘧啶向胸腺嘧啶(C＞T)转变(Pleasance，E.D.等Nature 463，191-196(2009))。
总体而言，所有患者对治疗的耐受良好。在报道的18件严重不良事件(seriousadverse event，SAE)中，两位患者中有4件SAE是新表位疫苗治疗突发的，但与研究药物无关。新表位疫苗治疗突发性不良事件(adverse event，AE)大多为1级或2级。没有4级或5级AE。药物相关的AE并未聚类于任何系统器官类别。临床安全性和结果数据将在其他地方详细报道。
实施例3：通过新表位RNA疫苗接种的多特异性T细胞免疫的诱导
为了评估在本研究中单独施用的125个新表位中每一个的免疫原性，我们分析了来自疫苗接种前和疫苗接种后血液样品的高度富集CD4+和CD8+ T细胞。通过IFNγ ELISpot针对经以突变为中心编码单27-氨基酸(amino acid，aa)序列的RNA转染的自体树突细胞(DC)或载有覆盖相应序列的15聚体重叠肽(overlaping peptide，OLP)的DC读出免疫原性。两个免疫原性读出均产生高度一致的结果。
总体而言，60％的新表位的结果是具有免疫原性。每位接种疫苗的患者对至少三个个体新表位有应答。针对三分之一的免疫原性新表位，存在预先存在的T细胞，其在疫苗接种后进一步扩增。针对近70％新表位的应答在疫苗接种之前未检测到，并且重新诱导。
大多数新表位仅被CD4+ T细胞识别，一小部分仅被CD8+ T细胞识别。约四分之一的免疫原性新表位与CD4+ T细胞和CD8+ T细胞发生双重反应。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的交叉污染可在实验上被排除(图1c)。对通过15聚体OLP的应答的详细表征显示，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞识别新表位的略微不同的部分(图1a、b)。免疫原性新表位均匀地分布在五表位RNA的五个位置上，从而支持了多新表位形式的适用性。
为了评价新表位诱导的T细胞是否识别未突变的对应物，我们通过ELISpot测试了用代表野生型或突变表位的RNA或OLP脉冲的DC。对于绝大多数新表位RNA疫苗诱导的应答，针对各自野生型表位的反应性未被检测到或处于较低水平。通过ELISpot分析，约四分之一的应答显示与野生型表位的反应性高于背景。可充分预想到，在点突变的N端和C端的13aaWT序列延展段可呈递在HLA I类和HLA II类分子上，从而导致野生型表位反应性T细胞。但是，预期中枢耐受机制抑制自体反应性T细胞的强扩增。因此，我们更详细地表征了针对疫苗靶标(P04-C7-E258K、P09-MAN1A2-E323D、P05-FAM135-A479S)的T细胞应答，其显示对野生型RNA DC的显著识别。对于P04-C7-E258K，野生型表位反应性不能通过测试载有OLP的DC确认。对于P09-MAN1A2-E323D，我们观察到对于横跨27聚体的aa 9-23的肽的突变和野生型表位的识别，而对于横跨aa 5-19的肽，仅突变形式被识别。这意味着交叉反应性免疫应答可包含专门识别突变表位的T细胞，这可控制肿瘤。在所有情况下，我们发现，自体DC尽管内源性表达相应野生型基因但仍未被相应T细胞识别，排除了对未突变基因产物具有生物学上显著的识别。
实施例4：通过疫苗接种的具有中央和效应记忆表型的新表位特异性T细胞的迅速且高效的扩增
这项研究中约有五分之一的免疫原性新表位引发很高的应答。这些T细胞可通过离体测试血液样品进行检测，而无需预先进行体外刺激。在用新表位和用共有TAA疫苗接种的患者中，针对新表位的T细胞应答更强。为了在分子水平上研究T细胞识别，我们从选定患者的疫苗接种后T细胞培养物克隆了新表位特异性T细胞受体(TCR)。通过流式细胞术对单新表位特异性CD4+ T细胞和CD8+ T细胞进行分选，并进行基于RT-PCR的TCR测序(Simon，P.等Cancer Immunol.Res.2，1230-44(2014))。将克隆的TCR α和β链体外转录成RNA，并共转染到T细胞中，以测试新抗原特异性和HLA限制。
在患者P01中，我们确定了四种TCR，其全部由不同的TCRα/β克隆型构成(表1)。
表1：克隆自黑素瘤患者P01和P02的单T细胞的新表位特异性TCR-α/β链
TCR(V(D)J基因以IMGT命名法表示。V：可变；D：多样性；J：连接；C：恒定。OLP，重叠肽；t.b.d.，待进行；NARFL，核前层蛋白A识别因子样蛋白(NARFL)，mRNA；HPN，Hepsin；PPFIA4，蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，f多肽(PTPRF)，相互作用蛋白(1iprin)，α4。
所有四种TCR均识别在HLA A*3101上来源于核前层蛋白A识别因子样基因的免疫显性NARFL-E62K新表位，但不识别未突变的表位(图2)。
患者P02具有两个识别PPFIA4-S709N(来源于liprin α4基因的新表位)的HLA B*3906限制性TCR以及两个对突变hepsin HPN-G71R新表位具有HLA DRB1*0401限制性识别的TCR，其在其野生型交叉反应性方面不同。
在疫苗接种前(访视V1、V12)和疫苗接种后(访视V20)由患者外周血细胞生成的TCR深度测序数据中追踪了这些TCR的TCR-β序列。各自的TCR β克隆型在疫苗接种前不可检出，但在疫苗接种后血液样品中非常丰富。
通过离体MHC多聚体分析研究数位患者的新表位应答揭示在开始新表位疫苗接种之后2至4周内循环CD8+ T细胞快速扩增直至高个位数百分比。新表位特异性CD8+ T细胞包含弱PD-1阳性记忆表型亚群。一些新表位应答主要由中央记忆型T细胞占优势，另一些由效应记忆型T细胞占优势。在用载有新表位的DC刺激之后，CD8+ T细胞表现出典型的细胞毒性细胞因子模式，并伴随有IFNγ和TNFα的表达。
实施例5：通过个体化新表位RNA疫苗接种在具有高复发风险的黑素瘤患者中的疾病控制
13位研究患者中的大多数近期都有复发病史，并且所有患者处于高复发风险之中。比较新表位RNA疫苗接种之前和之后所有患者中记录的黑素瘤复发揭示纵向累积复发转移事件高度显著降低(p＜0.0001)，在该高风险患者群体中转化为非常长的无进展存活。在新表位疫苗接种开始时，有八位患者不具有可测量的病灶。所有8位患者针对疫苗新表位均表现出强免疫应答，并且在整个随访期间(12至23个月)维持无复发，直至数据截止。免疫应答的动力学和效力各不相同；许多在疫苗接种的前3至4周内逐步形成。另外五位患者在入选之后经历肿瘤进展并且在施用疫苗之前接受标准治疗。所有五位患者在其个体化疫苗变得可用时均具有可测量的疾病。在新表位疫苗接种的情况下其疾病进程发展如下：
患者P02在入选时具有数个可测量的内脏和***转移，并用BRAF抑制剂治疗，在此情况下疾病进展缓慢。当开始新表位疫苗接种时，继续进行BRAF抑制剂治疗。P02针对10个疫苗新表位中的六个引发CD4+ T细胞应答，并经历了混合应答，其中***转移缩减、内脏转移稳定、进行性胸病灶和新的可测量转移性病灶。在放射治疗并切除进行性和新病灶之后，患者拒绝进行进一步医学治疗，并且在最后一次访视之后12个月去世。
由于在入选后不久有数个新门***和肾转移而疾病复发，患者P03的新表位疫苗接种被推迟。局部放射治疗和抗CTLA-4治疗失败。肾转移继续快速进展并被切除。此后，开始新表位RNA疫苗接种，并产生针对三个新表位的T细胞应答，其中两个被CD8+ T细胞识别，并且一个被CD4+ T细胞和CD8+ T细胞识别。如通过磁共振成像(magnetic resonanceimaging，MRI)确定的，疫苗接种之前进展的门***转移在随后12个月内完全消退。患者完成了总共18次疫苗注射的治疗，并且在没有任何进一步治疗的情况下维持无复发26个月。
患者P17在入选研究之后被诊断患有腋窝***转移，其在四次新表位RNA疫苗注射之后维持稳定并被切除，并用于产生肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和自体黑素瘤细胞系(MZ-I-017)。患者继续另外14次注射的疫苗接种。值得注意的是，在P17的PBMC中检测到针对疫苗的所有10个新表位的反应性T细胞。在肿瘤浸润性淋巴细胞中也检测到新表位特异性T细胞。针对鸟苷酸结合蛋白(GBP1-P86F)和视黄醇饱和酶(RETSAT-P546S)的突变表位的反应性特别高。在RETSAT-P546S新表位中，我们鉴定了HLA-A*6801限制性最小表位(HSCVMASLR)并通过HLA-多聚体染色验证TIL中针对此表位的CD8+ T细胞的存在。
我们用自体RETSAT-P546S RNA转染的DC刺激TIL，并克隆了相应的TCR。通过经单细胞克隆鉴定的RETSAT-P546S特异性TCR#8转染的T细胞高效地杀伤自体黑素瘤细胞系MZ-I-017，但不杀伤自体APC。这不仅确定了肿瘤细胞对新表位的表达、加工和呈递，而且还确定了疫苗诱导的细胞毒性T细胞在肿瘤细胞对其的有效识别。出乎意料的是，对TCR#8的进一步表征揭示对新表位的HLA-B*3701(而不是HLA-A*6801)限制性识别，这不同于最初确定的最小表位(图3a、图3b、图4)。这表明在同一患者中，单个突变可同时触发针对不同肽/HLA复合体的CD8+ T细胞应答(图3b)。
患者P07在新表位RNA疫苗接种开始时具有一系列复发和进行性皮肤和内脏转移。P07针对6种新抗原产生了强T细胞应答，其中5种可离体测量。由于在第一次成像时记录到持续疾病进展，因此中止新表位疫苗接种。P07加入同情性抗PD-1(派姆单抗(pembrolizumab))计划。患者经历了所有黑素瘤病灶的迅速消退，两个月内靶病灶的尺寸减小了80％，并在持续的PD-1阻断下最终完全应答。在疫苗接种结束之后，疫苗诱导的T细胞在抗PD-1治疗下以高频率持续存在长至9个月。
实施例6：针对新表位由CD4+ T细胞和CD8+ T细胞二者介导的预先存在的免疫应答
患者材料
通过Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences)密度梯度离心从黑素瘤患者的外周血样品或白细胞去除术物分离为进行免疫原性测试而获得的PBMC。来自NCT02035956的过量材料用于大规模免疫原性测试。研究设计在第80页上有描述。
新表位选择
第81页详细描述了下一代测序的方法。对于大规模免疫原性测试，使用无偏方法选择了多至100个新表位，以涵盖例如结合预测和靶标表达水平的数个特征。
CD4和CD8 T细胞的体外刺激
在第零天，使用微珠(Miltenyi Biotech)从冷冻保存的PBMC分离单核细胞，并通过添加包含IL-4/GM-CSF和IL-6/IL-1β/TNFα/PGE2的细胞因子混合物分化为快速树突细胞(fast dendritic cell，fDC)。两天之后，使用微珠(Miltenyi Biotech)从冷冻保存的PBMC分离CD4+和CD8+ T细胞。对于体外刺激，将CD4+ T细胞和载有重叠肽(OLP)库的fDC以效应物与靶标之比为10∶1合并，而将CD8+ T细胞和载有OLP库的CD4-耗尽PBMC以效应物与靶标之比为1∶10合并。一天之后，添加包含10U/mL IL-2(Proleukin S，Novartis)和5ng/mL IL-15(Peprotech)的新鲜培养基。建立培养物之后7天补充IL-2。在体外培养11天之后，通过流式细胞术分析细胞，并在IFNγ ELISpot测定中用作效应细胞。
IFNγ ELIspot
未成熟树突细胞(iDC)用作IFNγ ELIspot测定的靶标。使用微珠(MilteniyBiotech)从冷冻保存的PBMC分离单核细胞，并在存在IL-4和GM-CSF的情况下分化为未成熟树突细胞(iDC)。
将预先包被有对IFNγ具有特异性的抗体(Mabtech)的Multiscreen过滤板(MerckMillipore)用包含2％人血清白蛋白(CSL-Behring)的X-VIVO 15(Lonza)封闭1至5小时。对于CD4+ T细胞，将0.5×105个效应细胞/孔用载有OLP的自体iDC以效应物与靶标之比为10∶1再刺激18至20小时。对于CD8+ T细胞，将1×105个效应细胞/孔用载有OLP的自体iDC以效应物与靶标之比为10∶1再刺激18至20小时。所有测试均一式三份进行，并且包括测定阳性对照(葡萄球菌肠毒素B(Sigma Aldrich))。载有对照OLP库的iDC和仅效应物用作阴性对照。用生物素缀合的抗IFNγ抗体(Mabtech)，然后与ExtrAvidin-碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)和BCIP/NBT底物(Sigma-Aldrich)孵育使斑点可视化。使用CTL的
肽
为了进行体外刺激，使用覆盖27-聚体新抗原序列具有11个氨基酸重叠的合成15-聚体肽(粗制产物)(被称为重叠肽(OLP))。所有合成肽均购买而得并通过JPT PeptideTechnologies GmbH预先合并，并溶解在DMSO(AppliChem)中至每OLP 5mg/mL的贮存浓度。对于体外刺激，使用每OLP2.5μg/mL的终浓度，对于ELISpot读出为3.5μg/mL。不同新抗原的库(每个新抗原4个OLP)用于体外刺激以及使用矩阵法用于ELISpot读出。
流式细胞术分析
通过流式细胞术评估CD4和CD8 T细胞培养物的纯度(CD25PE、CD56 PE CY7、CD8APC、eFluor780FVD、CD3 BV421、CD4 FITC)。流式细胞术分析是在BD FACSVerseTM(BDBiosciences)上进行的。使用FlowJo软件(Tree Star)的第十版分析所获得的数据。
结果
到目前为止，已对7位患者进行了分析并且检测到由CD4+和CD8+ T细胞二者介导的总共26种反应性。
序列表
<110> 生物技术RNA制药有限公司
<120> 用于预测疾病特异性氨基酸修饰用于免疫治疗的可用性的方法
<130> 674-187 PCT2
<150> PCT/EP2017/064140
<151> 2017-06-09
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(3)
<223> 序列部分重复a次, 其中a独立地为选自以下的数：0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> a + b + c + d + e不为0并且优选为2或更大、3或更大、4或更大
或者5或更大
<220>
<221> REPEAT
<222> (4)..(6)
<223> 序列部分重复b次，其中b独立地为选自以下的数：0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20
<220>
<221> REPEAT
<222> (7)..(9)
<223> 序列部分重复c次, 其中c独立地为选自以下的数：0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20
<220>
<221> REPEAT
<222> (10)..(12)
<223> 序列部分重复d次, 其中d独立地为选自以下的数：0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20
<220>
<221> REPEAT
<222> (13)..(15)
<223> 序列部分重复e次, 其中e独立地为选自以下的数：0、1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 2
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Lys Ser Gln Arg Glu Phe Val Arg Arg
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Arg Met Asn Gln Gly Val Cys Cys
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Lys Phe Gly Gln Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Thr Lys Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Gly Gln Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser Leu Asp
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser Leu Asp Asp Cys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Thr Arg Leu Ser Lys Val Phe Ser Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Lys Val Phe Ser Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala Leu Trp Ile Met
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala Leu Trp Ile Met Ala Ala Lys Trp
1 5 10 15
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu
1 5 10 15
Arg Ala Gln
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg
1 5
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Ala Cys Tyr Gly Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg Ala Gln
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg Ala Gln Ser Pro Ile Pro
1 5 10 15
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 20
gccaccatga tcctaaacaa agctctgmtg c 31
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 21
tatgcgatcg ctcacaakgg cccytggtgt ctg 33
<210> 22
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Leu
1 5 10 15
Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu
20 25
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Pro Arg Ser Glu Ser Tyr Cys Phe Pro Gly Val Thr Leu Ala Ser
1 5 10 15
Thr Pro