阅读说明：本技术 一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物及其制备方法和应用 (Natural composition for inhibiting growth of pseudomonas aeruginosa as well as preparation method and application thereof ) 是由 彭红 周刚 王颖思 施庆珊 谢小保 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物及其制备方法和应用。本发明将蜂蜜和苦楝果水煎提取物按照质量比为(1～8):(1～8)的比例混合均匀,得到有效组合物。通过本发明的试验研究表明,蜂蜜和苦楝果水煎提取物对铜绿假单胞菌有优异的抑菌作用,二者复配使用抑制铜绿假单胞菌的生长更高效、更长效,二者复配有协同增效作用。本发明的组合物的原材料天然环保,抑菌效果显著,有益于人体健康,可应用于制备清洗伤口的药物、食品保鲜防腐剂、日化产品抗菌剂等。(The invention discloses a natural composition for inhibiting growth of pseudomonas aeruginosa, a preparation method and application thereof. The effective composition is obtained by uniformly mixing honey and the chinaberry fruit water decoction extract according to the mass ratio of (1-8) to (1-8). Experimental research shows that the honey and the chinaberry fruit water decoction extract have excellent bacteriostatic action on pseudomonas aeruginosa, the combination of the honey and the chinaberry fruit water decoction extract has higher and longer effect on inhibiting the growth of the pseudomonas aeruginosa, and the combination of the honey and the chinaberry fruit water decoction extract has a synergistic effect. The composition has natural and environment-friendly raw materials and remarkable bacteriostatic effect, is beneficial to human health, and can be applied to preparation of medicaments for cleaning wounds, food fresh-keeping preservatives, daily chemical product antibacterial agents and the like.)

一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于医药、日化、动植物和微生物领域，具体涉及一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物及其制备方法和应用。

背景技术

近年来抗生素耐药性呈上升趋势，从天然动植物提取物中筛选具有显著抑菌功能的新产品又引起人们的强烈关注，具有抑菌性能的替代治疗剂得到重视。

自然界有大量的自带抑菌能力的特殊植物，如楝科植物的苦楝、川楝和印楝，其本身少见生虫，是高活性的天然杀菌剂。美国、印度等国家对苦楝(主要是印楝)做了大量的深入研究，我国学者对川楝的化学成分、药理、杀菌杀虫作用等方面的研究取得了显著成绩，从川楝的树皮、果实中提取出了呋喃三萜类化合物苦楝素(Toosendanin)。苦楝具有滞尘、抑菌、净化空气等功效，在自然环境下易分解，安全环保。诸多文献报道了苦楝素对多种微生物有抑菌、杀菌、驱虫、杀虫、抗病毒、抗肿瘤等多重活性，有学者研究发现苦楝树乙醇提取液对黑曲霉、绿色木霉有很好的抑菌活性，苦楝浸剂对黄色毛癣菌、同心性毛癣菌、许兰氏黄藓菌、奥杜盎氏小芽孢癣菌、铁锈色小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌、红色皮肤癣菌、星形奴卡氏菌等均有一定的抑菌效果。

蜂蜜作为一种抗菌药物使用历史悠久，至今世界各地还保存有大量的利用蜂蜜治疗治病的民间方法，其药用价值近几年也逐渐获得世界范围内各种研究结果的证实。2007年，美国宾夕法尼亚州立大学的研究者发表了一项研究结果“蜂蜜能够有效缓解儿童咳嗽”，2008年，加拿大的研究者也发布了一项研究结果称“蜂蜜有强力杀菌作用，其杀菌效果比抗生物质更好”，这些结果都证实了蜂蜜具有优良的抑菌或杀菌效果。蜂蜜治疗是近年来用于伤口治疗的新方法，研究发现蜂蜜不仅具有抗菌、消炎、抗氧化、免疫调节、自溶清创、除臭作用，对慢性伤口细菌生物膜也有抑制作用。蜂蜜还具有抑制慢性伤口细菌生物膜的作用。国外对Manuka honey(麦卢卡蜂蜜)研究报道较多，麦卢卡蜂蜜具有消毒、修复伤口的作用，浓度为10％(w/v)的麦卢卡蜂蜜对伤口分离菌株奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)可显著降低两种菌株的生物膜发育。据国外学者报道，蜂蜜含有的甲基乙二醛是一种抗菌化合物，被证明是导致生物膜包裹伤口细菌死亡的原因。国外学者研究了蜂蜜与抗生素联用对细菌生物膜的体外活性的影响，发现万古霉素与蜂蜜联用对金黄色葡萄球菌生物膜的指数为0.34，具有协同作用，庆大霉素与蜂蜜联用对铜绿假单胞菌生物膜的指数为0.78-0.82，具有相加作用。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)原称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌。本菌在自然界分布广泛，喜欢潮湿环境，各种水、土壤、空气、正常人的皮肤、皮下组织、骨、耳、眼、尿路和心脏瓣膜、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌是医院内感染的主要病原菌之一，具有典型革兰氏阴性杆菌所引起的环形脓疡的特征，通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中，偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染。该菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌，患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者极易感染本菌，常引发术后伤口感染，烧伤伤口也易感染铜绿色假单胞菌，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，引起的感染病灶可导致菌血症和败血症，可造成死亡。因此需要筛选抑制铜绿假单胞菌生长的药物或者方法，从而减少该菌的危害性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物及其制备方法和应用。

本发明的第一目的是提供一种抑菌组合物，该组合物包括蜂蜜和苦楝提取物，所述的蜂蜜和苦楝提取物的质量比为(1～8):(1～8)。

所述的蜂蜜和苦楝提取物的质量比为1:1。

所述的抑菌组合物中蜂蜜和苦楝提取物总的质量分数为25～33.3％。

所述的苦楝提取物为苦楝果水煎提取物。

所述的蜂蜜为天然蜂蜜。

所述的苦楝果水煎提取物制备包括以下步骤：将苦楝果烘干后粉碎，加水煎煮，过滤，得水煎液，将水煎液浓缩至每1mL相当于原药材1g，灭菌，得到苦楝果水煎提取物。

优选，所述的细菌为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)

本发明的第二个目的是提供一种上述的抑菌组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1：将苦楝果烘干后粉碎，加水煎煮，过滤，得水煎液，将水煎液浓缩至每1mL相当于原药材1g，灭菌，得到苦楝果水煎提取物；

S2：将蜂蜜和苦楝果水煎提取物按质量比为(1～8):(1～8)混合，即得到抑菌组合物。

所述的加水煎煮，过滤，得水煎液是加水煎煮2次，过滤，合并2次的水煎液。

本发明的第三个目的是提供所述的抑菌组合物在制备清洗伤口的药物、食品保鲜防腐剂或日化产品抗菌剂中的应用。

本发明通过蜂蜜与苦楝果水煎提取物复配得到的组合物，对铜绿假单胞菌的抑菌效果，比单独使用更具高效、长效，复配物具有协同增效作用。

通过本发明的试验研究表明，将蜂蜜与苦楝果水煎提取物按质量比1:1复配联用，即便稀释至1/8(质量比)浓度，对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)5h、24h、48h、5d的抑制率都分别为95.15％、95.76％、98.25％、>99.99％，抑菌效果优异。

本发明的组合物的原材料源于动植物，天然环保，抑菌效果显著，有益于人体健康，可应用于制备清洗伤口的药物、食品保鲜防腐剂或日化产品抗菌剂，应用范围和前景广阔。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

称取蜂蜜A100g；称取100g苦楝果于1000mL蒸馏水，室温下浸泡30min后煮沸30min，煎煮，稍冷却后过滤得到水煎液，剩渣中加入500mL蒸馏水煮沸30min，过滤得到水煎液，合并两次水煎液，将水煎液浓缩(如减压浓缩)至每1mL相当于原药材1g，经121℃灭菌20min后，得到苦楝果水煎提取物B，于4℃冰箱内保存备用。

以下实施例中的测试菌株为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)时，测试方法为：用该实施例中营养琼脂培养基(NA)斜面培养基将测试菌株于37℃培养1d。然后用PBS清洗菌泥，稀释到OD₆₀₀＝1.0配制成菌悬液工作液。分别经蒸馏水稀释A、B，稀释后的A、B按质量比1:1组合即为A+B组合物，同时以无菌蒸馏水作为空白对照。量取稀释后的各药液或空白对照9mL于各无菌试管内，置20℃±1℃水浴中5min后，分别加入1mL菌悬液，轻轻摇动混匀，于37℃条件培养，进行抑菌测试，作用至试验预定时间5h、24h、48h，5d，分别对各试管内铜绿假单胞菌进行活菌培养计数，每次与相应时间的空白对照中铜绿假单胞菌含量进行对比，计算其抑菌率。

抑菌率计算公式：

每个处理做3个平行。

在本说明书中使用以下缩写：ATCC是美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection)的简写，PBS是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，温度的单位是摄氏度(℃)，min＝分钟，d＝天，mL＝毫升，mg＝毫克，g＝克，OD₆₀₀指的是溶液在600nm波长处的吸光值。

实施例1：

称取蜂蜜A(购于深圳市怡蜂缘蜂业有限公司，生产日期：2019.4.8，品种：荔枝蜜)100g；称取100g苦楝果(购自广州采芝灵药店，购入日期：2019.4.8)于1000mL蒸馏水室温下浸泡30min后煮沸30min，煎煮，稍冷却后过滤得到水煎液，剩渣中加入500mL蒸馏水煮沸30min，过滤得到水煎液，合并两次水煎液，将水煎液浓缩至每1mL相当于原药材1g，经121℃灭菌20min后，得到苦楝果水煎提取物B(100g)，于4℃冰箱内保存备用。

一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物，包括用蒸馏水把蜂蜜A稀释至1/2A和用蒸馏水把苦楝果水煎提取物B稀释至1/2B，以及稀释后的二者按质量比1:1混合得到的1/4A+1/4B组合物(含1/4A，1/4B)。制备方法：以蒸馏水稀释蜂蜜A至50％(质量分数)得到1/2A，以蒸馏水稀释苦楝果水煎提取物B至50％(质量分数)得到1/2B，稀释后的二者按质量比1:1混合均匀，得到1/4A+1/4B组合物。

用铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的方法进行测试5h，1/2A的抑菌率为99.90％，1/2B的抑菌率为99.95％，1/4A+1/4B组合物的抑菌率为：>99.99％。进行测试24h，1/2A抑菌率为99.99％，1/2B抑菌率为>99.99％，1/4A+1/4B组合物抑菌率为>99.99％。进行测试48h，1/2A抑菌率为>99.99％，1/2B抑菌率为>99.99％，1/4A+1/4B组合物抑菌率为>99.99％。按照上述测试方法范例中的方法进行测试5d，1/2A的抑菌率为>99.99％，1/2B的抑菌率为>99.99％，1/4A+1/4B组合物的抑菌率为：>99.99％。

1/2A、1/2B、1/4A+1/4B对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)测试5h、24h、48h、5d都有优异的抑菌效果，而组合物1/4A+1/4B在测试5h时抑菌率就达到>99.99％，相对1/2A、1/2B，抑菌效果更好。

实施例2：

按照实施例1的方法制备蜂蜜A和苦楝果水煎提取物B。

一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物，包括用蒸馏水把蜂蜜A稀释至1/3A和用蒸馏水把苦楝果水煎提取物B稀释至1/3B，以及稀释后的二者按质量比1:1复配得到的1/6A+1/6B组合物(含1/6A，1/6B)。制备方法：以蒸馏水稀释蜂蜜A至33.33％(质量分数)得到1/3A，以蒸馏水稀释苦楝果水煎提取物B至33.33％(质量分数)得到1/3B，稀释后的二者按质量比1:1混合均匀，得到1/6A+1/6B组合物。

用铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的方法进行测试5h，1/3A抑菌率为91.67％，1/3B抑菌率为95.55％，1/6A+1/6B组合物抑菌率为99.75％。进行测试24h，1/3A抑菌率为91.76％，1/3B抑菌率为90.36％，1/6A+1/6B组合物抑菌率为>99.99％。进行测试48h，1/3A抑菌率为93.45％，1/3B抑菌率为20.25％，1/6A+1/6B组合物抑菌率为>99.99％。按照上述测试方法范例中的方法进行测试5d，1/3A的抑菌率为>99.99％，1/3B的抑菌率为0，1/6A+1/6B组合物的抑菌率为：>99.99％。

1/3A对铜绿假单胞菌的抑菌率在48h之内保持较稳定，测试进行到5d抑菌率为>99.99％。1/3B对铜绿假单胞菌的抑菌率随时间延长而降低，测试到48h抑菌率降为20.25％，到5d抑菌率降为0。而组合物1/6A+1/6B对该菌的抑菌率随时间延长而增加，并且在测试5h时抑菌率也明显高于单独使用，测试进行到24h抑菌率为>99.99％。组合物1/6A+1/6B比单独成分1/3A、1/3B对铜绿假单胞菌的抑菌更高效、更长效。

实施例3：

按照实施例1的方法制备蜂蜜A和苦楝果水煎提取物B。

一种抑制铜绿假单胞菌生长的天然组合物，包括用蒸馏水把蜂蜜A稀释至1/4A和用蒸馏水把苦楝果水煎提取物B稀释至1/4B，以及稀释后的二者按质量比1:1复配得到1/8A+1/8B组合物(含1/8A，1/8B)。制备方法：以蒸馏水稀释蜂蜜A至25％(质量分数)得到1/4A，以蒸馏水稀释苦楝果水煎提取物B至25％(质量分数)得到1/4B，稀释后的二者按质量比1:1混合均匀，得到1/8A+1/8B组合物。

用铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 9027)作为测试菌株，按照上述测试方法范例中的方法进行测试5h，1/4A抑菌率为80.25％，1/4B抑菌率为90.22％，1/8A+1/8B组合物抑菌率为95.15％。进行测试24h，1/4A抑菌率为81.76％，1/4B抑菌率为71.22％，1/8A+1/8B组合物抑菌率为95.76％。进行测试48h，1/4A抑菌率为85.25％，1/4B抑菌率为0，1/8A+1/8B组合物抑菌率为98.25％。按照上述测试方法范例中的方法进行测试5d，1/4A的抑菌率为>99.99％，1/4B的抑菌率为0，1/8A+1/8B组合物的抑菌率为：>99.99％。

1/4A对铜绿假单胞菌的抑菌率随时间增加呈增强趋势，1/4B对铜绿假单胞菌的抑菌率随时间增加呈下降趋势，1/8A+1/8B组合物对铜绿假单胞菌的抑菌率在48h内呈平稳趋势，测试进行到5d抑菌率为>99.99％。1/8A+1/8B组合物对铜绿假单胞菌的抑菌率明显高于单独使用1/4A或1/4B对铜绿假单胞菌的抑菌率，抑菌时效更长。

实施例1-3的蜂蜜与苦楝果水煎提取物对铜绿假单胞菌的抑菌效果见表1。

表1蜂蜜与苦楝果水煎提取物对铜绿假单胞菌的抑菌实验结果

由上表1可知，蜂蜜在5h对铜绿假单胞菌的抑菌率随浓度降低而明显降低，1/2A、1/3A、1/4A对铜绿假单胞菌的抑菌率分别为：99.90％、91.67％、80.25％，随着作用时间延长，对铜绿假单胞菌的抑菌率明显上升。

苦楝果水煎提取物在5h对铜绿假单胞菌的抑菌率明显强于蜂蜜，1/2B、1/3B、1/4B对铜绿假单胞菌的抑菌率分别为：99.95％、95.55％、90.22％，1/2B在24h对铜绿假单胞菌的抑菌率为>99.99％，1/3B、1/4B随着作用时间延长，对铜绿假单胞菌的抑菌率明显下降。

1/4A+1/4B、1/6A+1/6B、1/8A+1/8B在5h对铜绿假单胞菌的抑菌率明显高于1/2A、1/3A、1/4A与1/2B、1/3B、1/4B，随着作用时间延长，1/6A+1/6B、1/8A+1/8B对铜绿假单胞菌的抑菌率显著增加，在5d时对铜绿假单胞菌的抑菌率均>99.99％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。