肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
阅读说明：本技术 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用 (Chlamydia pneumoniae-associated antigen short peptide and application thereof ) 是由 黄燕花 赵乙木 罗夫·辛克纳吉 孙晨 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了肺炎衣原体抗原短肽及其应用。所述肺炎衣原体抗原短肽序列如SEQ ID NO:1-16任一所示。该短肽具有与DC细胞上MHC I类和MHC II分子高度的亲和力,并能有效地使其起到抗原提呈作用,具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力。将该短肽中的至少一条体外致敏树突状细胞,制备的DC疫苗能够预防肺炎衣原体相关疾病,尤其是相关慢性疾病,具有良好的临床转化前景。而且,本发明的抗原短肽长度较短,化学合成难度小,可以直接合成得到高纯的产物,应用成本大大降低,同时效果明确,具有很好的应用前景。(The invention discloses a chlamydia pneumoniae antigen short peptide and application thereof. The sequence of the Chlamydia pneumoniae antigen short peptide is shown in any one of SEQ ID NO 1-16. The short peptide has high affinity with MHC class I and MHC class II molecules on DC cells, can effectively play a role in antigen presentation, and has good potential of polypeptide vaccines and DC vaccines. At least one in vitro sensitized dendritic cell in the short peptide can be used for preparing the DC vaccine which can prevent related diseases of the chlamydia pneumoniae, particularly related chronic diseases, and has good clinical transformation prospect. Moreover, the antigen short peptide has short length and small chemical synthesis difficulty, can be directly synthesized to obtain a high-purity product, greatly reduces the application cost, has definite effect and has good application prospect.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用。
背景技术
根据2015年《lancet》报道，从1990年到2013年，出生时的预期寿命增加了6.2年。随着预期寿命的增加，人们所关注的不仅仅是寿命的延长，同时还有生命质量的提高。疾病所导致的残疾，是影响生活质量的重要原因之一。而目前全球几乎所有原因致残数量均在下降，只有心脑血管疾病和肿瘤的致残数量增加。大部心脑血管疾病及肿瘤等慢性疾病早期缺乏特异的临床症状，在确诊时往往已发展为不可逆性疾病。因此，从根本解决心脑血管疾病、肿瘤等慢性疾病重在预防。心脑血管、糖尿病、肿瘤等慢性疾病的具体发病机理尚未研究清楚，但对于体内微生物感染作为诱因，可导致慢性疾病的发生已经被证实。因此，预防微生物的感染，同时也是预防的慢性疾病发生的关键。
其中，肺炎衣原体(chlamydiae)是一类真核细胞内寄生、具有独特发育周期的一种原核微生物；呈球形、椭圆形或梨形。目前已证实，肺炎衣原体可以引起多种慢性疾病的发生，肺炎衣原体其诱发的炎症反应参与淀粉样蛋白和tau蛋白学说中，可以参与阿尔茨海默病的发生；肺炎衣原体可通过氧化应激引起低密度脂蛋白氧化、泡沫细胞形成、内皮功能障碍、血小板粘附和聚集等引起动脉硬化，引起心血管病，其膜抗原诱导内皮细胞发生免疫反应，肺炎衣原体可通过免疫调节增加平滑肌细胞增殖促进动脉粥样硬化引起中风；肺炎支原体与肺癌发病同样相关。
肺炎衣原体感染后可以诱发机体产生特异性体液免疫和细胞免疫，特异性抗体可以阻断其吸附于宿主细胞，但其免疫力往往不持久且不强。肺炎衣原体目前尚无有效疫苗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有肺炎衣原体疫苗的不足，提供能与MHC I类和MHC II类分子结合的肺炎衣原体抗原多肽，提供基于DC技术的肺炎衣原体疫苗，可应用于采用DC技术防治肺炎衣原体相关慢性疾病，联合干细胞因子/vitrogen增加成熟DC细胞活性，同时通过多种肺炎衣原体特异性抗原肽，促进DC细胞活化，达到预防肺炎衣原体感染和治疗的目的，具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供肺炎衣原体抗原相关短肽。
本发明另一目的是提供所述肺炎衣原体抗原相关短肽在制备肺炎衣原体抗原多肽DC疫苗方面的应用。
本发明再一目的是提供一种肺炎衣原体抗原多肽DC疫苗。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
提供肺炎衣原体抗原短肽，其序列如SEQ ID NO:1-16任一所示。
提供所述肺炎衣原体抗原短肽在制备肺炎衣原体抗原多肽DC疫苗方面的应用。
提供所述肺炎衣原体抗原短肽在制备肺炎衣原体相关慢性疾病的防治药物中的应用。
另外还提供一种肺炎衣原体相关慢病防治的DC疫苗，由上述肺炎衣原体抗原短肽和树突状细胞加载得到。具体地，是由SEQ ID NO:1-16中至少一条所示短肽联合体外致敏树突状细胞，从而获得的自体树突状细胞制剂。
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所述的肺炎衣原体抗原短肽能够诱导DC起到抗原提呈作用。
具体地，疫苗为静脉回输型疫苗。
在所述肺炎衣原体相关慢病防治的DC疫苗的制备方法中，选用干细胞因子或vitrogen因子作为佐剂增加DC细胞活性，特异性的抗原肽体外致敏树突状细胞，获得自体树突状细胞制剂，作为静脉回输型肺炎衣原体相关慢病防治疫苗。具体制备方法为：以成熟促进因子，同时以干细胞因子或Vitrogan因子作为佐剂，促进DC细胞成熟；然后向诱导成熟的DC细胞培养体系中加入权利要求1所述短肽，收集负载有短肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤后，用生理盐水重悬即得到DC疫苗。
更具体地，作为一种可选择的方案，所述肺炎衣原体相关慢病防治的DC疫苗的制备步骤如下：
S1.DC细胞的提取与诱导：
S11.获取未成熟DC细胞
采集健康捐献者的外周血，通过淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基中，37℃、5％CO2条件下常规培养3小时后，贴壁细胞为未成熟DC细胞；
S12.未成熟DC细胞的扩增培养
37℃、5％CO2条件下培养5天，期间隔天换液，完成未成熟DC细胞(imDC细胞)的扩增培养；
S13.DC细胞的诱导
加入成熟促进因子，同时以干细胞因子或Vitrogan因子作为佐剂，促进DC细胞成熟；
S2.多肽的负载：
诱导DC细胞成熟5天后，向培养体系中加入权利要求1所述短肽；
S3.制备DC疫苗：
离心收集负载有短肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤细胞3次，最后将负载有短肽片段的DC细胞用生理盐水重悬，即得到DC疫苗。
另外所述DC疫苗在制备肺炎衣原体相关慢性疾病的防治药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。
免疫学表明，树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前所知的，功能最强的抗原提呈细胞，被认为是机体免疫反应的始动者，在免疫应答中处在中心位置。成熟的DC表达丰富的、与抗原提呈相关的MHC I类和MHC II类分子。其可以摄取、加工处理并提呈抗原；参与免疫记忆的维持；分泌细胞因子调节免疫应答。
本发明结合生物信息学技术预测肺炎衣原体自身可以做为抗原的序列簇，并经过大量研究摸索，得到的16条肺炎衣原体抗原肽具有与DC细胞上MHC I类和MHC II分子高度的亲和力，并能有效地使其起到抗原提呈作用，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力，并且提示其具有良好的临床转化及疾病防治前景。
本发明选用特异性的表位多肽，体外致敏自体DC细胞，制备DC细胞制剂，对患者进行静脉回输，重建机体全身免疫平衡，启动免疫系统，对感染微生物的特异性预防。
本发明采用的DC技术，用多种特异性抗原肽联合激活树突细胞，这些抗原肽具有极强的特异性，诱导具有更高活性的树突状细胞携带多种抗原信息，回输进入人体后可刺激机体免疫，可以达到诱导人体产生针对肺炎衣原体产生特异性抗体，及针对肺炎衣原体特异性的CTL细胞，从而可以有效防治肺炎衣原体相关慢性疾病的发生发展。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了序列如SEQ ID NO:1-16所示的肺炎衣原体抗原多肽，这些抗原肽具有与DC细胞上MHC I类和MHC II分子高度的亲和力，并能有效地使其起到抗原提呈作用，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力。
而且本发明的短肽长度较短，化学合成难度小，可以直接合成得到高纯的产物，应用成本大大降低，具备良好的多肽疫苗及DC疫苗的潜力，能够预防肺炎衣原体相关疾病，尤其是相关慢性疾病，具有良好的临床转化及实际应用前景。
基于本发明肺炎衣原体抗原肽制备DC疫苗用于肺炎衣原体防治的技术具有诸多优势：(1)DC体外激活后，干细胞因子/Vitrogen因子可以增加DC细胞活性，增加识别抗原提成能力，回输体内后促进产生免疫应答。(2)长期免疫记忆：由于使用特异抗原肽与具有记忆功能的免疫细胞充分接触，回输体内后，2使免疫细胞具有了精确长久的免疫记忆，加强了免疫防治效果，为防止再感染或预防提供了长期保护。(3)DC回输后体内后，可以重建机体免疫，从而达到防治体内感染病毒的目的。
附图说明
图1为DC疫苗治疗组和多肽-DC疫苗对照组对靶细胞的杀伤活性的对比。
图2为体外DC致敏T细胞，CCK-8法检测空白对照组、DC疫苗组、多肽疫苗组、多肽-DC疫苗组T细胞活性变化。
图3为小鼠免疫6周后，ELISA检测空白对照组、DC疫苗组、多肽疫苗组、多肽-DC疫苗组中血清中的抗体水平。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
树突细胞治疗技术(Dendritic Cell，DC)是通过收集自体外周血单个核细胞后，在严格无菌环境下加入特定的细胞因子，同时辅以干细胞因子/Vitrogen因子，获得转化的更具活性的具有抗原呈递功能的树突状细胞(dendritic cell，DC)。回输前一天加入肺炎衣原体抗原多肽，DC通过识别和捕获多种单表位抗原肽，获得高危致病病毒特异性抗原肽致敏的成熟树突细胞，利用树突细胞的可以靶向游走及免疫活性，可以诱导人体自身产生大量针对特异抗原产生的抗体，进而重建机体免疫平衡，从而通过防治致病病毒感染，对致病微生物的预防更定向更主动，根本上防治肺炎衣原体相关慢病的发生。
本研究目的是研发筛选能与MHC I类和MHC II类分子结合的肺炎衣原体抗原多肽，用于制备基于DC技术的肺炎衣原体疫苗。
1、肺炎衣原体抗原与MHC I类和MHC II类分子结合能力多肽的预测：
通过uniprot数据库，确定肺炎衣原体序列簇(https://www.uniprot.org/uniref/)，再将序列簇输入(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)在线分析，Threshold设置为0.6，确定肺炎衣原体抗原蛋白，通过IEDB数据库预测(http://tools.iedb.org/main/)抗原与MHC I类和MHC II类分子具有高度亲和力的短肽位点，获得一系列多肽。
2、从上述多肽中筛选出50条预测评分高且预测毒性较小的多肽片段，进行进一步研究。具体实验如下：
(1)DC细胞扩增及成熟:
采集健康捐献者的外周血50ml，通过淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基(购自gibico公司)中，常规培养37℃、5％CO2条件3小时后，贴壁细胞为未成熟DC。未成熟DC，37℃、5％的CO2条件，培养5天(隔天换液)，完成imDC的扩增培养。加入成熟因子，同时以干细胞因子或Vitrogan因子作为佐剂，促进DC成熟。
(2)特异性CTL对靶细胞的杀伤活性
将多肽-DCs诱导活化的T淋巴细胞作为效应性细胞，表达肺炎衣原体的阳性成纤维细胞作为靶细胞进行杀伤活性测定。治疗组多肽-DCs诱导活化的T细胞，对照组DCs诱导活化的T细胞，按照效应细胞与靶细胞数量比例为2：1加入96孔培养板中，每组3个复孔，同时设置效应细胞组，靶细胞组作为空白对照，置于37℃、5％CO2培养箱培养12h，用CCK-8法检测实验孔和对照孔OD450nm值并计算杀伤率。
杀伤率＝[靶细胞OD值+效应细胞OD值-实验孔OD值]/靶细胞OD值
结果显示，根据多肽-DCs诱导活化的CTL对靶细胞的抑制性高低选择最佳的多肽，与上述预测出的50条多肽的预测评分高低，对应关系不显著相关，预测结果参考性较差。
最终选择的最佳16条多肽的序列如表1，此16条多肽-DCs诱导活化的CTL对靶细胞的抑制性放入数据如图1。
表1
序列
序列号
VPVPSFQPLI
SEQ ID NO:1
RLTASSSAK
SEQ ID NO:2
LTASSSAKR
SEQ ID NO:3
TSSGTAAKR
SEQ ID NO:4
RTSSGTAAK
SEQ ID NO:5
VPVPSFQPL
SEQ ID NO:6
RTSSGTAAK
SEQ ID NO:7
LLLVPVPSF
SEQ ID NO:8
KRAAAPLSSVSSNRL
SEQ ID NO:9
RAAAPLSSVSSNRLT
SEQ ID NO:10
MFHALAGRGRLLLLV
SEQ ID NO:11
FHALAGRGRLLLLVP
SEQ ID NO:12
AAAPLSSVSSNRLTA
SEQ ID NO:13
QPLIRARGTKSGGDL
SEQ ID NO:14
FQPLIRARGTKSGGD
SEQ ID NO:15
VPSFQPLIRARGTKS
SEQ ID NO:16
(3)T淋巴细胞的诱导活化
随机抽取以上16条多肽中的一条，将得到的多肽-DCs加入丝裂素孵育，使其失去增殖活性，用PBS洗2遍，按DC:T浓度比为1:20的比例混合于96孔培养板共培养，分为四组，阴性对照组、多肽组、DC组、多肽-DC组，每隔2天换液，培养至第四天时加入等量的多肽-DCs，通过重复刺激诱导特异性CTL克隆的活化增殖，从种板后第一天起，每两天通过CCK-8检测一次细胞活性。检测至第7天。如图2所示，发现多肽-DC组活性最强。
3、肺炎衣原体特异性DC疫苗的免疫原性
通过随机抽取以上16条多肽中的一条，进行免疫原性检测。
每组5只BALB/C雌性小鼠，6-8周龄，分为4组，将多肽疫苗、多肽-DC疫苗、DC疫苗(阴性对照)，生理盐水作为空白对照，分别进行肌肉注射小鼠2×105细胞/只，共行免疫两次，间隔2周。分别在免疫6周后，眼球摘除取血，分离血清(-80℃保存)，进行免疫检测。
通过ELISA试剂盒检测血清抗-肺炎衣原体IgG抗体水平，结果如图3所示，多肽-DC组抗体滴度最高。结果表明，本发明研发的多肽-DC疫苗的转阳数较高。
上述实验表明，本发明所制备的DC疫苗能够有效地发挥抗原提呈作用，诱导机体产生肺炎衣原体抗原的特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，从而有望达到防治肺炎衣原体相关慢病的疗效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 维塔恩（广州）医药有限公司
<120> 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> 肺炎衣原体抗原短肽
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