一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 (shRNA and lentiviral vector for inhibiting human EDRADD gene expression as well as construction method and application thereof ) 是由 孟箭 李梦 白玉婷 李晓东 管俊杰 王守鹏 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用,首先合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链；正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA；通过酶切使慢病毒载体线性化,将线性化载体与双链DNA连接；将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；质粒抽提,用于下一步病毒包装。本发明以EDARADD基因为模板设计了RNA干扰靶点序列,根据选取的靶点序列设计shRNA干扰序列,包装构建RNA干扰慢病毒载体,对EDARADD基因进行敲减后,会显著影响舌鳞癌细胞CAL-27细胞的增殖,影响细胞克隆形成能力,并促进细胞的凋亡。(The invention discloses shRNA for inhibiting the expression of human EDRADD genes, a lentiviral vector, a construction method and application thereof, wherein the method comprises the steps of firstly synthesizing a positive strand and a negative strand of a DNA oligo aiming at an RNA interference target sequence; annealing the positive strand and the reverse strand to form double-stranded DNA with a sticky end; linearizing a lentivirus vector by enzyme digestion, and connecting the linearized vector with double-stranded DNA; transforming the ligation product into an escherichia coli competent cell, and performing PCR identification on the obtained positive clone; plasmid extraction is used for the next step of virus packaging. According to the invention, an RNA interference target sequence is designed by taking an EDRADD gene as a template, an shRNA interference sequence is designed according to the selected target sequence, an RNA interference lentiviral vector is constructed by packaging, and after the EDRADD gene is knocked down, the proliferation of a tongue squamous cell carcinoma CAL-27 cell is obviously influenced, the cell clone forming capability is influenced, and the apoptosis of the cell is promoted.)
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用。
背景技术
舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)简称舌鳞癌，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，具有高死亡率与发病率。它的发展是一个涉及遗传改变和表观遗传修饰的多步骤过程。TSCC是许多变量的致病因素，多种遗传改变和环境因素的积累，如烟草使用、饮酒、慢性炎症和人***瘤病毒(HPV)感染等，最近一些报道表明年轻成人的TSCC在发病率增加，特别是在女性中，远处转移率较高，预后较差。因此，由不同风险因素引起的TSCC可能具有不同的分子基础，涉及细胞周期控制和衰老控制的丧失，细胞凋亡的失调，以及口腔扁平苔藓和白斑的发生等方面。
目前对舌鳞状细胞癌治疗主要包括传统手术治疗、化疗和放疗。但手术治疗创伤大，术后患者生活质量下降，而传统的化疗和放疗缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。近年来，基因和生物治疗作为继手术治疗、放疗、化疗等传统疗法之外的新的治疗手段，在恶性肿瘤的综合治疗中发挥着日渐重要的作用，并越来越受到人们的重视。随着对肿瘤分子生物学行为的不断深入研究，发现了多个可用于治疗的特异性靶位点。然而有关舌鳞状细胞癌的分子靶向治疗还处于实验研究阶段，正确选择特异性的分子靶点至关重要。
人EDARADD基因是否与肿瘤细胞的凋亡有关以及在肿瘤发生和进展中的作用尚无文献报道。故人EDARADD基因在肿瘤中作用还有待于进一步的研究。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA。
本发明的目的之二是提供上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA的慢病毒载体。
本发明的又一个目的是提供上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA的慢病毒载体的构建方法。
本发明的最后一个目的是提供上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA，该shRNA包括DNA oligo的正链和反链，其中正链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，反链为序列表SEQ ID NO.3所示的碱基序列，所述的正链和反链退火形成带粘性末端的双链DNA。
上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA的慢病毒载体，该慢病毒载体是由合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
所述的慢病毒载体GV 115-shEDARADD针对的RNA干扰靶点序列为：5'-GTACTTGTTCCTCCTGCTT-3'(SEQ ID NO.1)。
上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)合成针对RNA干扰靶点序列的DNA oligo的正链和反链，将合成的DNA oligo的正链和反链的干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链；退火缓冲液含有Tris、EDTA、NaCl；
(2)使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，将线性化载体与步骤(1)得到的双链DNA连接；
(3)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，对得到的阳性克隆进行PCR鉴定；
(4)将经PCR鉴定合格的菌液转接培养后，进行质粒抽提，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
步骤(2)中，酶切载体反应温度为37℃，反应1h；载体与双链DNA连接反应温度为16℃，反应1-3h。
步骤(3)中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞的具体步骤为：
1)将10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；
2)42℃热激90s，冰浴2min；
3)加入500μl无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1h；
4)取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。
步骤(3)中，阳性克隆进行PCR鉴定过程中采用的鉴定引物为鉴定引物-F：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.4)和鉴定引物-R：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO.5)，具体过程为：挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min；PCR结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带，并以鉴定引物-F进行阳性克隆测序。
上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA在制备舌鳞癌治疗药物中的应用。
上述抑制人EDARADD基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌治疗药物中的应用。
所述舌鳞癌治疗药物至少具有以下功用之一：抑制舌鳞癌细胞增殖；促进舌鳞癌细胞凋亡；抑制舌鳞癌细胞克隆；抑制舌鳞癌肿瘤生成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以EDARADD基因为模板设计了RNA干扰靶点序列，根据选取的靶点序列设计shRNA干扰序列，包装构建RNA干扰慢病毒载体，对EDARADD基因进行敲减后，会显著影响舌鳞癌细胞CAL-27细胞的增殖，影响细胞克隆形成能力，并促进细胞的凋亡。表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。
附图说明
图1为EDARADD在HNSCC组织中过表达箱线图；
图2为线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1：1kb Marker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒；
图3为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，泳道1：阴性对照(ddH2O)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：250bp Marker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：单克隆psc27052-1,2,3,4,5；
图4为EDARADD基因在舌鳞癌细胞中表达柱状图；
图5为EDARADD shRNA慢病毒抑制EDARADD mRNA和蛋白质表达：(A)慢病毒感染CAL27细胞荧光图片；(B)慢病毒抑制EDARADD基因在mRNA水平的表达量柱状图；(C)WesternBlot检测；
图6为EDARADD的敲减抑制了TSCC细胞的增殖能力：(A)慢病毒感染CAL 27细胞的免疫荧光图片；(B)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组的连续5天的细胞计数折线图；(C)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组的连续5天的细胞计数倍数折线图；(D)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组细胞在MTT处理后在490nm处测量OD值折线图；(E)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组细胞在MTT处理后的OD 490倍值折线图；
图7为EDARADD的敲减诱导了TSCC细胞的凋亡：(A)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组的凋亡结果；(B)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组的凋亡率柱状图；
图8为EDARADD的敲减抑制了TSCC细胞的克隆形成能力：(A)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组的克隆形成的对比图；(B)慢病毒抑制EDARADD基因和对照组的克隆形成数量柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、克隆形成能力、凋亡等。本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性EDARADD基因的表达，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因EDARADD，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。
1、基因信息
在线资源UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)生成头颈部肿瘤组织以及正常组织中EDARADD的表达水平的箱线图。
EDARADD表达的箱线图显示，EDARADD在头颈部肿瘤组织中的表达显著高于正常组织(p<0.01，如图1)。
2、细胞系和细胞培养
CAL-27细胞系购自中国科学院(中国上海)，在液氮罐中取出进行复苏，在补充有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/100mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养，并在37℃下在含5％CO2的潮湿气氛中温育。
3、RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
根据RNA干扰序列设计原则，以EDARADD基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点：5'-GTACTTGTTCCTCCTGCTT-3'(SEQ ID No.1)。
根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号，而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。
*CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。
将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液(Tris 10mM，NaCl50mM，EDTA1mM)中(终浓度20μM)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。
按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化。
37℃反应1h，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。琼脂糖凝胶电泳图片如图2所示。
4、RNA干扰慢病毒载体构建
4.1按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20μl反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。
于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc27052，之后进行转化实验。
4.2将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：
1)将10μl连接产物psc27052加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min；
2)42℃热激90s，冰浴2min；
3)加入500μl无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1h；
4)取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。
4.3菌落PCR鉴定
4.3.1引物
4.3.2PCR扩增
按下表配制20μl PCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。PCR结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带。琼脂糖凝胶电泳图片如图3所示。
PCR条带大小
连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：380bp；
没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：307bp。
由此判断psc27052-1,2,3,4,5为阳性克隆，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序。
4.4阳性克隆测序结果分析
以鉴定引物-F进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。
psc27052测序结果
TTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCTGTACTTGTTCCTCCTGCTTCTCGAGAAGCAGGAGGAACA AGTACAGTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTT(SEQ IDNO.6)
*shRNA干扰序列***片段用粗体标注，其中AgeI酶切位点被破坏。
4.5质粒抽提
将测序正确的菌液转接于150ml含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流程。
详细操作步骤如下：
1)8000rpm离心4min收集菌体；
2)加入7ml P1，震荡混匀；
3)加入7ml P3，颠倒混匀6～8次，静置5min；
4)加入7ml P4，颠倒混匀6～8次，冰浴10min；
5)9000rpm离心10min，将上清转移到过滤器CS中，过滤后加入10ml异丙醇混匀；
6)向吸附柱中加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将柱子放回备用；
7)将上清分两次倒入吸附柱中，8000rpm离心2min，弃废液；
8)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已加入无水乙醇)，相同转速离心2min，弃废液，重复该步骤一次；
9)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，8000rpm离心2min，弃废液；
10)9500rpm空甩5min，除去残留的漂洗液；
11)将吸附柱转移至一新的白管中，在柱中心滴加800μl洗脱缓冲液TB(先预热)，室温放置5min，然后9500rpm离心2min；
12)将管中的洗脱液转移到一干净的1.5mlEP管中，-20℃保存；
13)取样电泳，使用分光光度计(Thermo_Nanodrop 2000)测定质粒浓度，质检。
14)将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
5、病毒包装
(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x 106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养24h，待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；
(2)转染前2h更换为无血清培养基；
(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV115载体质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；
(4)混合液缓慢滴加至293T细胞培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
(6)缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48-72h。
6、病毒的纯化
(1)根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可计为0h)的293T细胞上清液；
(2)于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；
(3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；
(4)分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；
(5)离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；
(6)经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清按要求分装；
(7)准备样品待检测。
7、RNA提取和qPCR
按照制造商的方案，使用Trizol从TSCC细胞系中提取总RNA。并根据制造商的说明书用M-MLV RT合成cDNA，其中反转录引物来自广州市锐博生物科技公司。然后两步法进行real-time quantitative PCR检测EDARADD在CAL-27细胞中mRNA的表达丰度，MicroRNAPCR引物来自广州市锐博生物科技公司。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)用作内参基因，对照和比较阈值循环法(2-ΔCt)方法用于计算mRNA的相对表达水平。在Stratagene Mx3000P上使用SYBR Green master mix进行qPCR。
(1)按下列比例配置反应体系(12μL体系)：
①MicroRNA PCR
引物来自广州市锐博生物科技有限公司。引物信息：
②RNA PCR
(2)两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线，程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40次循环；95℃15s，60℃30s，95℃15s。
结果如图4所示，表明CAL-27细胞中EDARADD基因在mRNA水平中为高表达。
8、慢病毒转染细胞并通过qPCR和Western印迹测量EDARADD shRNA的干扰效率
使用5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'作为阴性对照(shCtrl)，合成干扰序列shRNApsc3741，并构建慢病毒。根据制造商的说明，通过实时PCR测定慢病毒滴度，并且用感染复数(MOI)为20的慢病毒载体转染到CAL-27细胞中。接种细胞(2×105个细胞/mL)置于6孔板上并孵育，成功感染的细胞为绿色荧光蛋白阳性，72h后在荧光显微镜下观察。
如图5A所示，CAL-27细胞被成功地感染了表达EDARADD shRNA或对照shRNApsc3741的慢病毒。如图5B所示，与阴性对照细胞(shCtrl)相比EDARADD的shRNA(shEDARADD)细胞系，mRNA表达量受到抑制(**P<0.01)，敲减效率达到60.4％。
9、蛋白质印迹
用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用RIPA缓冲液裂解。在浓度为10％SDS-PAGE凝胶上分离含有30μg蛋白质的等份细胞裂解物，并在300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。将膜在含有5％脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭，并与Anti-EDARADD：1:100、Anti-GAPDH：1:2000稀释过夜，然后与Anti-Rabbit IgG：1:2000、Anti-Mouse IgG：1:2000孵育。使用ECL试剂盒结合X光片使条带可视化。
蛋白质印迹结果表明，在CAL-27细胞中shRNA介导的敲低后，EDARADD的蛋白质水平显着降低(图5C)，靶点对EDARADD基因的内源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用，是有效靶点。
10、Celigo细胞计数法检测细胞生长
用0.25％胰蛋白酶消化TSCC细胞以制备单细胞悬浮液，然后用血细胞计数器计数细胞。将细胞(2×103个细胞/孔)接种到96孔板上，并在37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。从铺板后第二天开始，每天Celigo细胞计数器检测读板一次，连续5天检测读板，通过调整分析设置的输入参数，精确计算并统计分析具有绿色荧光的细胞数。细胞计数倍数表示相对于第1天的平均值的每个时间点的细胞计数，表明细胞增殖的变化，对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
Celigo细胞计数结果显示，shEDARADD组的舌鳞癌细胞增殖速率明显低于阴性对照组，特别是在第4天与第5天(图6A、B和C)。
11、MTT检测细胞活力
将慢病毒转染的TSCC细胞系中细胞(1.5×103个细胞/孔)接种到96孔板中并孵育24小时。然后，向每个孔板中加入20μL的PBS中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物。20μl MTT在37℃下温育4小时后，弃去上清液，将沉淀物溶于100μl二甲基亚砜中。使用酶标仪在490nm处测量每个孔的吸光度，OD490倍代表相对于第1天的平均值的每个时间点的OD值，表明细胞增殖的变化。
MTT结果表明，shEDARADD组的OD 490倍值在4和5天较shCtrl组显著下降(图6D和E)，具有与Celigo细胞计数仪检测一致的结果。
12、Annexin V-APC单染法细胞凋亡检测
在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约85％汇合。收获上清液和贴壁细胞，离心，用4℃预冷的D-Hanks溶液洗涤，并以1×106个细胞/mL的密度在1×binding buffer中重悬。按照制造商的说明使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒APC用Annexin V-APC在室温下将细胞染色15分钟。流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行，并使用Guava InCyte软件(Millipore)进行分析。
结果表明，shEDARADD组细胞凋亡率明显比shCtr组细胞更高(**P<0.01，图7)，表明EDARADD基因与CAL-27细胞的凋亡显著相关。
13、细胞克隆形成测定
在转染72小时后将细胞(1.5×103细胞/孔)接种到6孔板上并培养10天，每3天更换培养基并观察细胞状态。在培养结束前，使用荧光显微镜拍摄细胞克隆。将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，然后用Giemsa染色。用蒸馏去离子水洗涤并完全干燥后，用数码相机拍摄细胞克隆，然后计数。
结果显示(图8)，shEDARADD的舌鳞癌细胞克隆数量明显低于阴性对照组(**P<0.01)，提示EDARADD基因与CAL-27细胞的克隆形成能力显著相关。
序列表
<110> 徐州市中心医院
<120> 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtacttgttc ctcctgctt 19
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggctgtac ttgttcctcc tgcttctcga gaagcaggag gaacaagtac agtttttg 58
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattcaaaaa ctgtacttgt tcctcctgct tctcgagaag caggaggaac aagtacag 58
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctatttccc atgattcctt cata 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaatacggt tatccacgcg 20
<210> 6
<211> 442
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga aagtatttcg 60
atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac cggctgtact tgttcctcct 120
gcttctcgag aagcaggagg aacaagtaca gtttttgaat tctcgacctc gagacaaatg 180
gcagtattca tccacgaatt cggatccatt aggcggccgc gtggataacc gtattaccgc 240
catgcattag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 300
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 360
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 420
gacgtcaatg ggtggagtat tt 442
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaccaaccca aagaggacag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccagaatgat gaggcaccat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccctgttg ctgtagccaa a 21