阅读说明：本技术 一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用 (Method for silencing functional genes of laver and application thereof ) 是由 王广策 何帮翔 郑阵兵 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于海洋生物领域,具体涉及一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用。利用In-fusion反应,将紫菜功能基因CDS的片段反向连接至空干扰重组载体的启动子和终止子之间,将其导入大肠杆菌感受态DH5α菌株,通过氨苄霉素100mg/l筛选出阳性克隆,通过摇菌提质粒获得足量重组干扰质粒进行后续实验。本发明可获得较多纯系功能基因沉默突变株,为研究紫菜以及其他大型藻类的基因功能和分子机制提供了一套可行的实验方案。(The invention belongs to the field of marine organisms, and particularly relates to a method for silencing functional genes of laver and application thereof.A CDS fragment of the functional gene of the laver is reversely connected between a promoter and a terminator of an empty interference recombinant vector by utilizing an In-fusion reaction, the CDS fragment is introduced into an Escherichia coli competent DH5 α strain, positive clones are screened out by 100mg/l of ampicillin, and sufficient recombinant interference plasmids are obtained by shaking and upgrading the plasmids for subsequent experiments.)

一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用

技术领域

本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用。

背景技术

RNA干扰技术能够特异性的剔除或者关闭特定基因的表达，在研究基因功能方面有着广泛的应用。潮间带红藻条斑紫菜是一种重要的经济红藻，并有望成为大型藻类的模式物种。但是针对条斑紫菜的转基因体系尚不成熟，虽有报告基因成功转入的事例，但是对功能基因的沉默与过表达，依旧处于摸索阶段。在重组质粒构建方面，传统双酶切的方法因为酶切位点问题，在质粒改造与重组中存在很多限制。在突变株的筛选方面，由于条斑紫菜的抗逆性强，当用潮霉素抗性进行筛选时，需要施加高浓度的潮霉素(1mg/ml)，同时培养周期得达到4周以上，才能将野生型杀死，当使用大体积(≥100ml)培养时,会消耗大量的潮霉素。此外，当使用锥形瓶或细胞培养瓶进行培养时，一方面不利于观察，另一方面，不利于及时挑取出单株存活的小叶状体，使得后期获得的突变材料有可能不纯。目前，尚未有利用转基因技术使条斑紫菜功能基因沉默的成功案例，在已有的条斑紫菜转基因案例中，筛选模式较为粗放，很难保证筛选出纯系突变株。因此，急需设计一种更加精细化的条斑紫菜转基因方案，来完成条斑紫菜功能基因沉默的突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种紫菜功能基因沉默的方法，利用In-fusion反应，将紫菜功能基因CDS的片段反向连接至空干扰重组载体的启动子和终止子之间，将其导入大肠杆菌感受态DH5α菌株，通过氨苄霉素100mg/l筛选出阳性克隆，通过摇菌提质粒获得足量重组干扰质粒进行后续实验。

所述空干扰重组载体为潮霉素抗性基因的载体；所述载体的目标干扰片段的启动子为PyAct1，终止子为NOS。

所述紫菜功能基因CDS的片段为紫菜功能基因的CDS靠近起始密码子ATG端150-200bp的片段的反向序列，***至启动子与终止子之间。

所述紫菜功能基因为3-脱氢喹酸合酶/O-甲基转移酶融合蛋白基因(PyAB)、条斑紫菜核糖5磷酸异构酶(PyR5PI)或条斑紫菜β胡萝卜素羟化酶(PyHY)。

进一步的说，将构建成功的干扰重组质粒包裹于金粉粒子上，利用基因枪将其轰击至条斑紫菜叶状体细胞，而后将轰击后的条斑紫菜叶状体移至PES海水培养基中于200-500lux低光条件下恢复培养3天，温度19±1℃，再将光强提高至2000-4000Lux，继续培养7天，以促进单孢子的放散和附着；而后每周更换培养基，并添加1mg/ml浓度的潮霉素进行突变株的筛选。

所述抗生素筛选条件为培养基内添加终浓度1mg/ml的潮霉素，初筛选时间为4-6周；其后挑取存活的单株小叶状体至24或48孔板内继续使用含终浓度为1mg/ml潮霉素的培养基进行再筛选；筛选阶段的培养条件皆为15℃，2000-4000lux,培养基为PES海水培养基；而后，将再筛选阶段依旧存活的叶状体进行扩大培养，作为候选材料进行后续验证。

所述候选突变株材料于10℃光强2000-4000lux进行培养3-4周，收集材料，于液氮速冻，-80℃保存，用于后续DNA和RNA水平的验证。

具体步骤如下：

1.构建质粒：利用用In-fusion cloning反应，将目标功能基因CDS中靠近起始密码子ATG端200bp左右的片段反向连接到质粒PyAct1启动子与NOS终止子之间，转至感受态，挑取阳性单克隆菌株进行提质粒和测序验证，得到目标重组质粒。

2.粒子轰击：将质粒包裹在金份上，利用基因枪轰击条斑紫菜叶片(1mm-5mm长左右)，调整不同档位，进行轰击。每次轰击完后，将小叶片转移到装有5ml新鲜培养基的六孔板。

3.恢复培养：低光恢复3天，中光培养7天，使单孢子得以释放和附着发育。

4.预筛选：10天后换新鲜培养基，同时加入潮霉素，终浓度为1mg/ml,施加选择压力,其后每周更换培养基和潮霉素。

5.挑单株与再筛选：每周在倒置显微镜下观察孔板内的叶状体，在大部分叶状体变白死亡后(大约4-6周)，在倒置显微镜下及时挑出存活的单株叶状体，转移至12-48孔板，继续施加潮霉素筛选压力。

6.扩大培养：再筛选2-3周后，将12-48孔板内依旧存活的株系挑至30ml体系进行培养2-3周，收集5-10mg左右材料，液氮速冻，-80℃保存。

7.基因组PCR验证：对收集的材料进行DNA提取和纯化，以此为模板进行PCR验证，挑出阳性突变株，扩大至300ml体系培养，获得100-200mg材料进行荧光定量验证。

8.荧光定量验证：对收集的阳性突变株材料进行提RNA，反转为cDNA,进行荧光定量验证，挑选出符合基因沉默条件的突变株。

上述方法所得突变株在紫菜分子育种中的应用。

本发明的优点：

本发明经济高效，建立了针对条斑紫菜以及大型海藻进行较大规模功能基因沉默的方法，通过本发明方法可以获得纯系突变株，可减少抗生素的使用量，同时利用再筛选和少量材料基因组PCR，有针对性的扩大培养可能的阳性突变株，可节省实验者的时间，提高效率。

附图说明

图1为本发明实施例提供的PyAB基因、PyR5PI和PyHY的干扰质粒的PCR验证电泳图。其中，1为marker；2-11为PyHY；12-20为PyAB，21为PyAB野生型；22-24,26-31为PyR5PI，25为PyR5PI野生型；2-31各条带大小约为1110bp。

图2为本发明实施例提供的PyAB基因、PyR5PI和PyHY突变株基因组PCR验证图；其中1为marker；2为PyHY突变株；3为R5PI突变株；4为野生型；5为PyAB突变株。

图3为本发明实施例提供的PyAB突变株荧光定量PCR。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例

为实现紫菜功能基因的沉默，选取条斑紫菜3-脱氢喹酸合酶/O-甲基转移酶融合蛋白基因(PyAB)基因、条斑紫菜核糖5磷酸异构酶(PyR5PI)或条斑紫菜β胡萝卜素羟化酶(PyHY)分别作为目标功能基因，构建与筛选基因沉默突变株：

首先，利用同源臂替换原理，进行功能基因重组干扰质粒的构建，使研究不受酶切位点的限制。然后将整个筛选阶段的培养体系缩小至1-5ml,有效减少潮霉素的消耗。以不同规格的细胞培养孔板作为培养容器，便于观察和单株及时挑取。在挑取单株后，继续施加潮霉素压力，再次筛选。将经过两次筛选依旧存活的藻株挑至30ml体系扩大培养，获得5-10mg左右材料提取纯化基因组DNA，进行PCR验证，挑选阳性突变株再扩大至300ml体系进行培养，获得足够材料进行荧光定量PCR验证。

下述以PyAB为例进一步详细阐述：

1.重组干扰质粒的构建：以具有潮霉素抗性基因的蓝色荧光蛋白表达质粒(pEA7-PyACT::AmCFP)为原始质粒，该质粒源于日本Naotsune Saga教授惠赠(文献来源：Development of a nuclear transformation system with a codon-optimizedselection marker and reporter genes in Pyropia yezoensis(Rhodophyta)

(1)质粒线性化：用高保真酶KOD对原始质粒进行PCR(所用引物：PIV-F 5’-GAGCTCGAATTTCCCCGATCG；PIV-R 5’-GGATCCGGGCTTGCTCAT3’)，去除AmCFP基因，用OMEGA胶回收试剂盒对线性化的质粒进行回收。

(2)PyAB干扰片段扩增：以条斑紫菜叶状体cDNA为模板，在PyAB的CDS靠近ATG一端选取200bp左右片段，Primer5软件设计引物。为使其反向表达，将质粒上游断口15bp同源臂加在目的片段反向引物上，将质粒下游断口15bp同源臂加在目的片段正向引物上。

同源臂序列：

上游断口-5’-AGCAAGCCCGGATCC-3’

下游断口-5’-GGGAAATTCGAGCTC-3’。

PyAB干扰片段扩增引物：

上游-5’-GGGAAATTCGAGCTCGCAACATCAAGGACCTACGC-3’

下游-5’-AGCAAGCCCGGATCCATCAGGTTCTTGATCAGCCC-3’。

(3)In-fusion连接：使用

HD Cloning Kit(TaKaRa,Japan)试剂盒，将干扰片段与线性质粒连接，反应体系：80ng线性载体，60ng目的片段，buffer 2μl，剩余用ddH2O补足至10μl，50℃15min。

(4)导入感受态：取2μl In-fusion反应产物，导入50μl大肠杆菌DH5α感受态，冰上30min，42℃90s，LB摇1h，涂布至含氨苄霉素的LB平板，37℃过夜。

(5)阳性单克隆挑取：挑选LB板上长出的单个菌落至LB培养基，摇菌3h，取1μl菌液进行菌液PCR，扩增PyACT-PyHY反向片段-NOS，引物：

Total-F：ctggcgtaatagcgaagag

Total-R：tatgcggcatcagagca

PCR凝胶电泳图见附图1。

(6)质粒提取：选择测序正确的阳性菌株，于含氨苄的LB培养基进行摇菌，37℃摇6h，采用质粒提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，用作基因枪轰击。

2.基因枪轰击：

(1)微弹制备：称取金粉50g，加入1mL 70％的乙醇清洗，加入1mL无菌水清洗3次，再加人11mL 50％的甘油。转移25μL的金粉和25μL的质粒混匀后接入2.5M的氯化钙和0.1M的亚精胺，最后离心加入48μL无水乙醇，微弹制备完成。

(2)叶状体铺板：将大小为5-10mm的叶片平铺在圆形玻璃纤维纸上，在轰击前，用无尘卫生纸吸去叶片表面水分，玻璃纤维纸放置在无菌固体平板的正中心，再将其放在样品槽正中心。

(3)基因枪轰击：将提取的PyAB干扰质粒制备成5次微弹，分别轰击5个样品，档位为2次二挡，3次二挡。每次轰击完后，将叶片转移至6孔板，每孔5mlPES培养基。

3.恢复培养：将轰击后的材料，转移至PES海水培养基中置于19±1℃低光培养3天(200-500lux)，中光培养7天(2000-4000Lux)。

4.初筛选：10天后换新鲜PES海水培养基，同时加入潮霉素，潮霉素施加浓度为1mg/ml,其后每周更换培养基和潮霉素为防止污染，可在培养基中添加抗生素(如氨苄青霉素、链霉素等)。筛选的前3个星期，在倒置显微镜下每周观察一次，掌握藻体状态变化情况。

5.单株挑取与再筛选：初筛选6-8周内，大部分藻体会变白死亡，增加对材料的观察次数，若有状态较好，颜色较深的小叶状体(长100-500μm)，在倒置显微镜下及时挑出单株至24孔板或48孔板(依据存活单株数量而定)，并施加潮霉素，继续筛选2-3周。

6.基因组PCR验证：再筛选阶段存活的叶状体，挑出至30ml体系扩大培养2-3周，将附着瓶底的叶片刮出，收集鲜重10mg左右，液氮速冻，组织匀浆机研磨，加TE缓冲液100-300μl，涡旋10s，95℃5min，加同等体积的氯仿与异戊醇(氯仿与异戊醇体积比24:1)混合溶液，涡旋充分混合，4℃12000rpm离心10min，小心吸出上清，用作PCR模板，进行PCR验证。

验证引物：

V3F:5’-CGCATAAGCTTCCGCTCGA-3’

V3R:5’-CTGAGAGTGCACCATAAATTCCC-3’

基因组PCR凝胶电泳图如附图2。将筛出的阳性突变株，扩大培养(300-500ml体系)，10℃，2000-4000lux，长大叶片，获取足够材料进行荧光定量验证。

7.荧光定量PCR：

(1).RNA提取与反转：采用UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取条斑紫菜RNA，而后TAKARA反转试剂盒把得到的RNA反转成cDNA。首先进行DNA消化(体系为：5×gDNAEraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL,total RNA 1μg,补充RNase Free水至10μL)，在PCR仪中42℃2min，然后保存于4℃。然后进行反转(体系为：上述所得体系10μL，5×primer script Buffer2,4μL,Prime script RT Enzyme MixI 1.0μL,RNase Free的水4.0μL，RT mix 1.0μL)，37℃15min，85℃5s，保存于4℃。

(2).实时荧光定量：采用伯乐荧光定量试剂盒，反应体系为SybrGreen qPCRMaster Mix 10μl，引物-F 1μl，引物-R 1μl，cDNA模板1μl，ddH2O 7μl。内参基因选择条斑紫菜转录起始因子4A。内参引物：

elF4AF-5’GCTTTCTGTCTGGACGAGG3’，

elF4AR-5’TCTTCACAAGGATGCGGAT3’。

PyAB荧光定量引物：

iABF4:5’-ACCACCGCAACACTCCCT-3’

iABR4:5’-GAATCCAGCCCTTCTCCAA-3’

荧光定量程序：95℃10min,然后95℃10s,52℃15s，72℃25s 40个循环,最后65℃，30s 60个循环。

针对两株PyAB基因干扰的突变株的荧光定量结果参见图3，结果表明在突变株中，PyAB的相对表达量都要低于野生型的表达量。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。