阅读说明：本技术 一种用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构 (Nanometer microarray near-field structure for monomolecular fluorescence limited-domain excitation ) 是由 赵祥伟 崔玉军 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构,包括基底和电介质填充部分,所述电介质填充部分均匀的阵列在基底中,所述电介质填充部分均在高度H方向上贯穿基底,所述基底材料为导电金属,所述电介质填充部分为透明材质。本发明的近场机构将单个荧光分子的激发限制在一个开放的平面上的纳升体积内,利用了介质填充等离激元纳米孔将激发限域到开放表面,有效降低了生物大分子与进入激发体积的空间位阻,与零模波导相比,该结构具有更优良的性能,且可以从上下两个方向采集单分子荧光信号,测试中应用灵活。(The invention discloses a nano micro-array near-field structure for monomolecular fluorescence confinement excitation, which comprises a substrate and a dielectric filling part, wherein the dielectric filling part is uniformly arrayed in the substrate, the dielectric filling part penetrates through the substrate in the height H direction, the substrate is made of conductive metal, and the dielectric filling part is made of transparent material. The near-field mechanism limits the excitation of a single fluorescent molecule in a nanoliter volume on an open plane, utilizes a medium to fill a plasmon nanopore to limit the excitation to an open surface, effectively reduces the steric hindrance of biomacromolecules and the entrance of biomacromolecules to the excitation volume, has better performance compared with zero-mode waveguide, can acquire single-molecule fluorescent signals from the upper direction and the lower direction, and is flexible to apply in testing.)

一种用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构

技术领域

本发明涉及一种用于单分子荧光限域激发的近场结构，尤其涉及一种用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构。

背景技术

在过去十年开发的DNA测序技术已经彻底改革了生物科学，并且具有在未来几年内彻底改革医疗实践的许多方面的可能性。然而，要实现这种可能性，仍然存在许多必须解决的挑战，包括减少每次运行测序的成本、简化样品制备、减少运行时间、增加序列读段长度、改善数据分析等等。在纳米制造阵列例如纳米孔阵列上的单分子测序可以解决这些挑战中的一些，然而，这些方法具有其自身的一套技术困难，例如，可靠的纳米结构制造、DNA穿过纳米孔的移位速率的控制、核苷酸区分、对来自纳米孔传感器的大型阵列的电信号的检测等等，核苷酸的光学检测已经作为纳米孔测序领域中的一些技术困难的潜在的解决方案被提出；并且已经在使用零模波导(ZMW)阵列的单分子测序领域中实现，通过在金属纳米孔的底部将激发体积减小到10^-18到10^-21升，ZMW可以用来观察单个荧光分子，即使在生物相关浓度高达微摩尔到毫摩尔范围，并获得荧光相关光谱(FCS)因此，ZMW及其衍生物已被广泛应用于各种应用领域，包括高浓度单分子分析、单细胞分析和单酶分析、聚合酶分子DNA测序、纳米流体通道DNA排序、齐聚动力学、氧化还原反应等。

然而，在ZMW中，纳米孔直径为数十纳米，深度约为100纳米，只有底部上方10-20纳米的体积被激发。由于空间效应和纳米孔表面的静态双层结构，使得酶或DNA等生物分子很难落入纳米孔中。为了克服这一点，采用倾斜侧壁，使ZMW的口宽于其底部，从而便于将分析物引入ZMW。或者，在氧化还原反应期间，将电位施加到结构的不同层以执行光谱电化学分析。在另一项研究中，在纳米孔的底部嵌入一个纳米孔，并施加电压将DNA链引入ZMW，然后通过DNA聚合酶捕获它们进行后续。然而，ZMW的复杂度和成本却在增加。单分子荧光信号的激发和采集仍具有很大的挑战性。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种应用更灵活、性能更优良的用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构。

技术方案：本发明所述的用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构，包括基底和电介质填充部分，所述电介质填充部分分布在基底中，所述电介质填充部分均在高度H方向上贯穿基底，所述基底材料为导电金属，所述电介质填充部分材质为固相透明材料。

进一步的，所述基底材料为金属铝、铜、金、银中的一种。

进一步的，所述电介质填充部分的材料为二氧化硅、蓝宝石、二氧化钛、PE、PMMA、PC中的一种。

进一步的，所述电介质填充部分均匀的阵列在所述基底中。

进一步的，所述电介质填充部分为圆台形，所述圆台形顶端面直径Ds为10-100nm，底端面直径DB为50-500nm，且顶端面直径小于底端面直径。

进一步的，所述电介质填充部分为金字塔型，所述金字塔型顶端面为边长10-100nm的正方形，底端面为边长50-500nm的正方形，所述顶端面边长Ws小于底端面的边长WB。

进一步的，所述纳米微阵列近场结构的高度H为100-1000nm。

进一步的，所述纳米微阵列近场结构的底部设有基板，所述基板材料与所述电介质填充部分材料相同。

制备方法：本发明由于需要在纳米尺度做出精细图案，虽然激光的刻蚀效率明显高于聚焦等离子束刻蚀，但刻蚀的精度远远低于聚焦等离子束刻蚀，因此利用聚焦等离子束直写技术，通过调节离子束能量大小、入射电流大小、离子束驻留时间等参数可以制备满足不同倾角要求的近场结构。

有益效果：本发明所述用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构，是协助聚合物的高效光学检测和分析的装置，因为它是一种平面结构，提供了更大的自由度以提高性能，无需其他机制便可以将所需分子引入纳米微阵列结构的表面检测，可以比ZMW获得更好的电场强度，并通过数值模拟证明，在给定高度与顶端面直径(Ds)之比的情况下，它的性能不仅可以与ZMW相当，而且比对应的ZMW更好。同时可以根据需要调整上下端面宽度比以调整顶点处的电场强度，与传统的ZMW相比，改进后的自由度也能在顶端面获得更好的电场强度。

其中，各个参数代表的物理量：表面等离激元SPP的波矢量Kspp,等离子激元入射波长λp,入射光波长λ0，∈_m金属的介电常数，∈_d电介质的介电常数。

微阵列结构的入射场场强可以通过金属-电介质边界条件0和金属与电介质界面上等离子体模式(表面等离激元-SPP)的动力学来理解。这些表面等离激元SPP携带随波矢量(kspp)、等离子激元入射波长(λp)一起运动的空腔内的消逝模式，对于截止波长为λ_cut-_off的金属-绝缘体-金属系统(MIM)他们之间的关系如方程(1a)所示，这里∈_m和∈_d分别是金属和电介质的介电常数，从方程(1a)可以清楚地看出，产生的等离子体的波矢量与入射波长成反比关系，这种关系进一步由金属的介电常数以及介电材料的介电常数介导。方程(1b)强调了表面等离激元的波长与其波矢量之间的关系。与零模波导相比，近场结构被认为是有利的，因为它是一种平面结构，无需机制将所需分子引入ZMW的纳米孔中，而不会显著降低器件的性能。此外，近场结构提供了更大的自由度以提高性能，可以比ZMW获得更好的电场强度。

采用标准FDTD方法(时域有限差分法)对NFS进行了数值模拟，近场结构的上表面有折射率为1.33的水，而底部在空气中折射率为1。选择二氧化硅的折射率为1.45，铝的光学常数取自Palik。为了进行比较，我们建立了一个常规ZMW的模拟模型，为了使这两种模型具有可比性，选择了相同的近场结构(NFS)顶端面直径和ZMW宽度，并且选择了等效于近场结构的ZMW厚度。最后，通过在近场结构正上方的分析区域设置偶极子源来研究的。然后从结构的底部收集偶极子发射的电场，以确定观察者可以接收的电场比例。

从高度为100nm的近场结构和ZMW得到的仿真结果，如图5所示。当结构高度(近场结构和zmw)增加在100nm时，所有结构沿z轴的电场强度都会增加。但对近场结构性能的影响远远大于对ZMW的影响。随着高度的增加，电场强度的降低可归因于由于与铝侧壁的长期相互作用而导致的衰减增加。由于高度的增加，ZMW的峰值强度比NFS要小得多，原因有两个。第一个原因是ZMW把光限制在一个很小的由金属墙包围的空间里，而在NFS中没有这样的限制。在ZMW中，金属壁引起电场的快速衰减，提高了界面处的强度。由于这些原因，ZMW的电场强度在界面处几乎保持不变，而近场结构的电场强度则大大减弱。其次，在ZMW的情况下，进入的电场在到达空腔之前不会与金属壁相互作用。在ZMW的情况下，这也是一个观察区域。而对于近场结构，金属壁腔体用于电场的限制和聚焦，而观察区域在该腔体的上方。因此，在界面处，即使是DB＝100nm的近场结构的强度也小于ZMW的强度，ZMW的这一优势被迅速地抹平了。

测试中本发明所述近场结构将单个荧光分子的激发限制在一个开放的平面上的纳升体积内，利用了介质填充等离激元纳米孔将激发限域到开放表面，有效降低了生物大分子与进入激发体积的空间位阻。与零模波导相比，该结构具有更优良的性能，且可以从上下两个方向采集单分子荧光信号，测试中应用灵活。

附图说明

图1圆台形纳米微阵列近场结构主视截面示意图；

图2圆台形纳米微阵列近场结构俯视示意图；

图3金字塔形纳米微阵列近场结构主视截面示意图；

图4金字塔形纳米微阵列近场结构俯视示意图；

图5圆台形纳米微阵列近场结构电场强度随距表面距离的变化曲线图；

图6单分子DNA实时测序示意图。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合附图1-5及实施例对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例所述的用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构，为双层结构，下层为二氧化硅基板，上层是高度为100nm的导电铝层，导电铝层包括铝基底和二氧化硅填充部分，所述二氧化硅填充部分均匀的阵列在铝基底中，所述二氧化硅填充部分均在高度H方向上贯穿导电铝层，二氧化硅填充部分呈圆台形，圆台形顶端面直径Ds为50nm，底端面直径DB为100nm。

本实施例在单分子DNA实时测序中的应用：

A、DNA提取

目标细菌30摄氏度培养过夜。取1ml种子培养液接入100ml2％LB中，5000r/min离心10分钟，弃去上清液。加入10mlTE离心洗涤后，用10mlTE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用。取3.5ml菌悬液，加入184ul10％SDS，混匀，加入37ul 10mg/ml蛋白酶K，混匀，37摄氏度温育1小时。加入740ul 5mol/l NACL，再加入512ulCTAB/NACL混匀，65℃温育10分钟。加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清。上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊烷(25：24：1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清。加入0.6倍异丙醇，混匀离心，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤沉淀。

B、DNA文库构建

按照以下顺序处理：

DNA片段化—DNA损伤修复—DNA末端修复—平末端连接接头—酶切反应—片段选择—文库质控

C、实时测序、数据矫正

选择上述微阵列近场结构，圆台形顶端面直径Ds为50nm，底端面直径DB为100nm，该范围产生平均分子数在0.01到1分子之间，选择f29DNA聚合酶因为该聚合酶是一种稳定、亚单位的酶，具有高速、准确和高效率，可以有效的利用磷酸化的DNTP，我们在酶中引入位点特异性突变，并设计一种连锁化学，允许用四个不同的磷酸链接DNTP，百分之百替换天然核苷酸，同时保持接近野生型聚合酶动力学。

(1)在NTP结构上端面使用附加的生物素化聚乙二醇层来定位聚合酶，以防止蛋白质直接与NTP的二氧化硅底部接触；

(2)在待测溶液中注入不同荧光染料标记的脱氧核苷酸(DNTP)；

(3)如图6所示，通过全息相位掩模，使用3000个NTP的有目标的均匀的多激光照射。因为与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留时间，因此统计4种荧光信号与时间关系图即可确定DNA模板序列，荧光根据波长不同被送到不同的事件相关单光子计数器中，四路计数数据被传输到电脑上，软件根据时间顺序得到不同荧光被激发时荧光强度的脉冲，根据脉冲出现的时间顺序及长度，确定DNA碱基排列，得到测序的原始图像，由于测序是根据时间长短判断读取到的时一个碱基还是两个相同的碱基连在一起，而聚合酶和DNTP结合时间是呈指数递减分布的，会判断不准，通过多次测量降低错误率。

D、数据组装

目前已经有多种软件如pacbio ToCA、Canu、AHA等可以通过聚类纠错的方式将测序数据组装，得到基因组的精细图。选择一种将读取的短序列拼接组装。

实施例2

本实施例所述的用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构，为双层结构，下层为蓝宝石基板，上层是高度为110nm的导电金层，导电金层包括金基底和蓝宝石填充部分，所述蓝宝石填充部分均匀的阵列在金基底中，所述蓝宝石填充部分均在高度H方向上贯穿导电金层，所述蓝宝石填充部分为金字塔型，所述金字塔型顶端面为边长50nm的正方形，底端面为边长100nm的正方形。

本实施例在数字蛋白质定量分析的应用：

(1)在近场结构的上端将特异性抗体与固相电介质载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。

(2)加受检标本并使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质。

(3)加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

(4)测量荧光的增加作为酶与荧光底物反应。从实施例2中描述的纳米微阵列近场结构的下端面入射激光，同时接受激发出的荧光，每个荧光点就代表一个抗原被检测到，统计每个固定有特异性抗体的电介质结构下的荧光随时间的增加量，经过指定的孵化时间后，测量荧光量值并与蛋白质浓度相关联。

实施例3

本实施例所述的用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构，为双层结构，下层为PE基板，上层是高度为1000nm的导电银层，导电银层包括银基底和PE填充部分，所述PE填充部分均匀的阵列在银基底中，所述PE填充部分均在高度H方向上贯穿导电银层，所述PE填充部分为金字塔型，所述金字塔型顶端面为边长100nm的正方形，底端面为边长500nm的正方形。

实施例4

本实施例所述的用于单分子荧光限域激发的纳米微阵列近场结构，为双层结构，下层为PE基板，上层是高度为500nm的导电银层，导电银层包括银基底和PE填充部分，所述PE填充部分均匀的阵列在银基底中，所述PE填充部分均在高度H方向上贯穿导电银层，所述PE填充部分为金字塔型，所述金字塔型顶端面为边长80nm的正方形，底端面为边长300nm的正方形。