阅读说明：本技术 碳化硅@bsa-抗菌肽纳米探针的制备方法及其应用 (Preparation method and application of silicon carbide @ BSA-antibacterial peptide nanoprobe ) 是由 蔡继峰 李杏梅 丁艳君 孟凡明 李介男 于 2019-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的制备方法及其应用,属于法医检测方法技术领域。所述的基于碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的制备方法,包括以下步骤：(1)碳化硅@BSA纳米的制备；(2)碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针-抗菌肽的制备。所述碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针在检测口腔细菌及其在法医唾液鉴定中的应用方法包括：S1：标准溶液中口腔细菌的检测；S2：唾液样本中口腔细菌的检测；S3：法医唾液样本的鉴别。本发明基于碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的荧光传感器,拥有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优良分析性能,在法医微生物检测及法医唾液鉴定检测领域中具有很好的实用前景。(The invention provides a preparation method and application of a silicon carbide @ BSA-antibacterial peptide nanoprobe, and belongs to the technical field of forensic detection methods. The preparation method of the nano probe based on the silicon carbide @ BSA-antibacterial peptide comprises the following steps: (1) preparing silicon carbide @ BSA nano-particles; (2) and (3) preparation of silicon carbide @ BSA-antibacterial peptide nanoprobe-antibacterial peptide. The application method of the silicon carbide @ BSA-antibacterial peptide nanoprobe in detection of oral bacteria and identification of forensic saliva comprises the following steps: s1: detection of oral bacteria in a standard solution; s2: detecting oral bacteria in the saliva sample; s3: and (5) identifying the forensic saliva sample. The fluorescence sensor based on the silicon carbide @ BSA-antibacterial peptide nanoprobe has excellent analysis performances of high sensitivity, wide linear range, low cost and the like, and has good practical prospect in the fields of forensic microbial detection and forensic saliva identification detection.)

碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于法医学技术领域，具体涉及碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的制备方法及其应用。

背景技术

可靠地识别遗留在犯罪现场体液的类型和来源，为犯罪现场的重建提供重要的线索。法医唾液鉴定是犯罪调查的一种越来越有效的辅助手段，特别是在性犯罪方面。在过去的几十年中，各种唾液鉴定技术逐渐发展起来。鉴定唾液的最常用方法是唾液淀粉酶试验。尽管唾液α-淀粉酶是人体唾液中富含的一种酶，但在其他体液中也存在少量，如唇粘液，血液，尿液，***和腹膜液，因为在一定程度上会产生假阳性结果(M.J.Auvdel,％JJournalofForensicSciences,1986,31,426-431)。

经过长期的的发展，现有的唾液鉴定方法，比如化学法和免疫法等，以及细胞特异性mRNA表达和蛋白质水平的分析，(T.Akutsu,K.Y.WatanabeandK.Sakurada,Internationaljournaloflegalmedicine,2010,124,493-498.)。然而，这些传统的方法需要的时间长，和大量的样本，尚不能满足高效率法医鉴定的诉求。

近年来，口腔细菌用于唾液的鉴定越来越受到关注。Nakanishi等通过口腔细菌检测进行唾液鉴定的初步工作，他们发现口服链球菌(S.salivarius和S.mutans)可以通过基于聚合酶链反应(PCR)的方法成功检测出模拟法医样本中的唾液(H.Nakanishi,A.Kido,T.Ohmori,A.Takada,M.Hara,N.AdachiandK.J.F.S.I.Saito,2009,183,20-23.J.)。JungJY团队最近的一项研究描述了口腔特异性细菌(S.salivarius，S.sanguinis和N.Subflava)的检测可用于验证法医样本中唾液的存在(J.Y.Jung,H.K.Yoon,S.An,J.W.Lee,E.R.Ahn,Y.J.Kim,H.C.Park,K.Lee,J.H.HwangandS.K.Lim,ScientificReports,2018,8,10852.R.)。上述研究表明，基于口腔细菌检测的唾液鉴定是未来法医学研究的前景。

生物传感技术在生物化学、环境保护、生物医学等领域得到广泛应用。生物传感器技术为目标细菌检测提供了比其他方法更有吸引力的替代方法,需要简单的操作和快速反应时间,同时又不影响特异性(O.R.Miranda,L.Xiaoning,G.G.Limary,Z.Zheng-Jiang,Y.Bo,U.H.F.BunzandV.M.Rotello,JournaloftheAmericanChemicalSociety,2011,133,9650-9653.M.)。在过去的二十年里,各种抗菌肽作为检测细菌的识别单元来构建生物传感器已经被报道(M.Hoyos-Nogués,F.J.GilandC.Mas-Moruno,Molecules,2018,23,1683.S.)。抗菌肽(AMP)是来自自然资源的抗感染药物,已被公认为潜在的下一代抗生素。此外,Amp还表现出与传统抗体平行的几个突出特征,包括体积小、化学稳定性好、对细菌敏感性高(S.Arcidiacono,P.Pivarnik,C.M.MelloandA.Senecal,Biosensors&bioelectronics,2008,23,1721-1727.)。凭借这些突出的特性,AMP已被引入各种微生物传感应用,具有更高的选择性和灵敏度,使伤寒杆菌、E.coli和牙周致病性细菌的检测得到可靠,口腔细菌的有效检测尚未得到探索。

生物传感器的构建，除了设计出目标物特异结合的配体，荧光探针的设计也是非常重要的组成成分，直接关切到物质检测效率。量子点(quantumdots)是一种半导体纳米微晶体(semi-conductornanocrystal)，是一种由Ⅱ一Ⅵ族或Ⅲ一V族元素组成的纳米颗粒，其独特的光学特性在生物学荧光标记及成像方面备受关注。作为一种新型纳米材料，在生物传感领域的应用越来越受到广泛重视。与传统的荧光探针相比，量子点具备优越的光学效应，发光效率高，不易发生光漂白。碳化硅量子点是一种以碳化硅为原材料的量子点，具有无毒、生物相容性好、制备工艺简单，逐渐被研究学者所重视，目前已初步应用于活体细胞的成像研究(Y.Cao,H.Dong,S.PuandX.Zhang,NanoResearch,2018,1-8.C.)，然而，在尚未用于法医学研究领域。

因此，发展一种操作简单、快速高效且较高灵敏度等优良分析性能的一种基于碳化硅纳米探针和抗菌肽的荧光细菌传感器及其在法医鉴定领域应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明通过提供一种碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的制备方法及其应用，以解决现有技术中法医唾液鉴定操作方法复杂，反应时间长，繁碎的样本预准备等问题。

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)碳化硅@BSA纳米的制备：称取碳化硅粉末加入到蒸馏水中超声，再用氨水调节pH得碳化硅溶液；将适量BSA加入到碳化硅溶液中形成混合物，再将混合物放入到内衬聚四氟乙烯反应釜，加热，最后透析过滤，即可得到纯化的[email protected]纳米探针；

(2)碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针-抗菌肽的制备：将步骤(1)制备的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针和抗菌肽通过EDC和NHS进行耦合，震荡10-20分钟，孵化2-4小时，将多余的抗菌肽通过离心去除，即得碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针于4℃保存待用。

以上所述的碳化硅@BSA为牛蛋白稳定的碳化硅量子点；BSA为牛血清蛋白；EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺。

优选地，步骤(1)中所述的碳化硅与BSA的质量比为1:4～4:1。

优选地，步骤(1)中所述的碳化硅与BSA的质量比为1:1。

优选地，步骤(2)中所述碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针和抗菌肽通过EDC和NHS进行耦合，震荡15分钟，孵化3小时。

优选地，步骤(2)中所述抗菌肽的浓度为0.001～5mg/mL。

本发明还提供一种所述碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针在检测口腔细菌及其在法医唾液鉴定中的应用。

优选地，所述用于法医唾液鉴定的方法包括：

S1：标准溶液中口腔细菌的检测：配置不同浓度的口腔细菌溶液，将其加入到碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针中，反应0.1～6h后测量其在410nm处的荧光强度，绘制细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准溶液曲线，从而实现标准溶液中口腔细菌的检测；

S2：唾液样本中口腔细菌的检测：制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针中加入含有口腔细菌的唾液样品，反应0.1～6h后测量其在410nm处的荧光强度，通过反应前后的荧光强度对比，建立用于检测的标准工作曲线，从而实现唾液样本中口腔细菌的检测；

S3：法医唾液样本的鉴别：收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、***液样本，进行预处理后，通过碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针对不同体液样本中口腔特异细菌的定性定量检测，只有唾液中才能检出口腔特异细菌，从而从法医体液样本中鉴别出唾液。

本发明的有益效果是：

1.本发明基于碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的荧光传感器，具有制备简单、生物相容性好、光稳定性好，而抗菌肽是一种对细菌有特异性结合效应的多肽，耦合碳化硅纳米探针实现对口腔细菌的特异响应，因而使得该方法拥有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优良分析性能，在法医微生物检测及法医唾液鉴定检测领域中具有很好的实用前景。

2.本发明采用荧光共振能量转移FRET技术实现对唾液链球菌的定量检测，通过制备有抗菌肽的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针溶液，当加入口腔细菌时，由于耦合抗菌肽的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针和口腔细菌之间存在荧光共振能量转移FRET效应，猝灭碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的发光峰位，当口腔细菌与抗菌肽的结合能力更强，碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针和口腔细菌的结合物之间的FRET效应得以破坏，碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的荧光猝灭，从而实现口腔细菌的快速定量检测。

3.本发明构建的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针荧光传感器可以快速、简便的用于法医样本中微生物含量的定量分析，荧光信号可在1.0×10²cfu/mL-1.0×10⁷cfu/mL浓度范围内实现对口腔细菌的定量响应，具有灵敏度高、线性范围宽、无须样品预处理、检测速度快、成本低廉等优良分析性能，很好克服了传统方法操作繁琐、反应时间长，灵敏度低等缺陷。

4.本发明的用于制备碳化硅@BSA纳米荧光探针试剂均为普通的化学试剂，安全无毒，环保无污染，能够广泛应用。

5.本发明所提供的测定细菌浓度的方法，可快速、精确地测定细菌浓度，首次将荧光技术运用到法医唾液鉴定，为法医工作者准确地推断死者死亡原因提供方法。

6.与现有法医鉴定中唾液淀粉酶试验方法进行对比，本发明采用唾液定性结果分析优于唾液淀粉酶结果，实现法医唾液的鉴定。

附图说明

图1是本发明流程示意图。

图2是不同浓度唾液链球菌存在下体系的荧光强度变化(10²-10⁷cfu mL^-1)。

图3是根据图2得出的目标唾液链球菌与体系荧光强度的关系。

图4是不同浓度唾液链球菌存在下体系的荧光强度变化(10³-10⁸cfu mL^-1)。

图5是根据图4得出的目标唾液链球菌与体系荧光强度的关系。

图6是不同浓度血链球菌存在下体系的荧光强度变化(10²-10⁷cfu mL^-1)。

图7是根据图6得出的目标血链球菌与体系荧光强度的关系。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

实施例1

本实施例的一种基于碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的荧光细菌传感器及在法医唾液鉴定的应用，按照以下步骤进行：

(1)碳化硅@BSA纳米的制备：将60mg碳化硅粉末加入到30毫升的蒸馏水，用氨水调节pH到9；将60mg BSA加入到以上的碳化硅溶液中，混合液加入到50毫升的聚四氟乙烯反应釜，加热至140℃，反应650分钟，得浑浊液体，用透析袋透析3天，用0.22μm微孔膜过滤，即可得到纯化的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针；

(2)碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针-抗菌肽的制备：将制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针溶液和0.2mg/mL抗菌肽，通过EDC和NHS进行耦合，震荡15分钟，孵化3小时，多余的抗菌肽通过离心去除，制得碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，将制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，于4℃保存待用；

本实例中所用的抗菌肽序列为多肽序列列表ID No.所示序列(GLLWHLLHHLLH)

(3)标准溶液中唾液链球菌的检测：配置浓度为10²-10⁷cfu/mL(梯度为10倍)的口腔细菌溶液，将其加入至步骤(2)制备的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，反应0.1h后测量其在410nm处的荧光强度，绘制细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准曲线；如图2和图3所示；

(4)唾液样本中口腔细菌的检测；制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度(10³-10⁵cfu/mL)的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向步骤(2)中制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针中加入含有口腔细菌的唾液样品，反应0.1h后测量其在410nm处的荧光强度。为了验证本方法的实际可靠性，开展了回收率实验，添加已知的不同浓度口腔细菌在唾液中，之后通过该方法计算得到的浓度和已知浓度进行对照，获得回收率在87.6％-105.0％，说明该方法在实际样本中具有较好的准确测定结果。

(5)法医唾液样本的鉴别：基于(4)，该纳米探针能够在唾液样本中进行有效检测，进一步用于法医唾液样本的鉴别中。因为口腔特异性菌仅存在于唾液中，通过对口腔特异性菌的定性定量检测，进而可实现从多种体液中出检出唾液。首先收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、***液样本，进行简单的预处理后，通过碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针对不同体液样本中口腔特异细菌定量检测，检出口腔细菌。

实施例2

本实施例的一种基于碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的荧光细菌传感器及在法医唾液鉴定的应用，按照以下步骤进行：

(1)碳化硅@BSA纳米的制备：将20mg碳化硅粉末加入到30毫升的蒸馏水，用氨水调节pH到9；将80mg BSA加入到以上的碳化硅溶液中，混合液加入到50毫升的聚四氟乙烯反应釜，加热至140℃，反应650分钟，得浑浊液体，用透析袋透析3天，用0.22μm微孔膜过滤，即可得到纯化的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针；

(2)碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针-抗菌肽的制备：将制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针溶液和0.001mg/mL抗菌肽，通过EDC和NHS进行耦合，震荡10分钟，孵化4小时，多余的抗菌肽通过离心去除，制得碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，将制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，于4℃保存待用；

本实例中所用的抗菌肽序列为多肽序列列表ID No.所示序列(TFFRLFNR-GG-GWGSFFKKAAHVGKL)

(3)标准溶液中唾液链球菌的检测：配置浓度为10³-10⁸cfu/mL(梯度为10倍)的口腔细菌溶液，将其加入至步骤(2)制备的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，反应6h后测量其在410nm处的荧光强度，绘制细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准曲线；如图4和图5所示；

(4)唾液样本中口腔细菌的检测；制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度(10³-10⁵cfu/mL)的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向步骤(2)中制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针中加入含有口腔细菌的唾液样品，反应6h后测量其在410nm处的荧光强度。为了验证本方法的实际可靠性，开展了回收率实验，添加已知的不同浓度口腔细菌在唾液中，之后通过该方法计算得到的浓度和已知浓度进行对照，获得回收率在89％-107.0％，说明该方法在实际样本中具有较好的准确测定结果。

(5)法医唾液样本的鉴别：基于(4)，该纳米探针能够在唾液样本中进行有效检测，进一步用于法医唾液样本的鉴别中。因为口腔特异性菌仅存在于唾液中，通过对口腔特异性菌的定性定量检测，进而可实现从多种体液中出检出唾液。首先收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、***液样本，进行简单的预处理后，通过碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针对不同体液样本中口腔特异细菌定量检测，检出口腔细菌。

实施例3

本实施例的一种基于碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针的荧光细菌传感器及在法医唾液鉴定的应用，按照以下步骤进行：

(1)碳化硅@BSA纳米的制备：将80mg碳化硅粉末加入到30毫升的蒸馏水，用氨水调节pH到9；将20mg BSA加入到以上的碳化硅溶液中，混合液加入到50毫升的聚四氟乙烯反应釜，加热至140℃，反应650分钟，得浑浊液体，用透析袋透析3天，用0.22μm微孔膜过滤，即可得到纯化的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针；

(2)碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针-抗菌肽的制备：将制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针溶液和5mg/mL抗菌肽，通过EDC和NHS进行耦合，震荡20分钟，孵化2小时，多余的抗菌肽通过离心去除，制得碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，将制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，于4℃保存待用；

本实例中所用的抗菌肽序列为多肽序列列表ID No.所示序列(K-Acp-Acp-Acp-RRRRSVQWCA)

(3)标准溶液中血链球菌(口腔中特异细菌的另一种)的检测：配置浓度为10²-10⁷cfu/mL(梯度为10倍)的口腔细菌溶液，将其加入至步骤(2)制备的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针，反应2h后测量其在410nm处的荧光强度，绘制细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准曲线；如图6和图7所示；

(4)唾液样本中口腔细菌的检测；制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度(10³-10⁵cfu/mL)的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向步骤(2)中制备好的碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针中加入含有口腔细菌的唾液样品，反应2h后测量其在410nm处的荧光强度。为了验证本方法的实际可靠性，开展了回收率实验，添加已知的不同浓度口腔细菌在唾液中，之后通过该方法计算得到的浓度和已知浓度进行对照，获得回收率在89％-107.0％，说明该方法在实际样本中具有较好的准确测定结果。

(5)法医唾液样本的鉴别：基于(4)，该纳米探针能够在唾液样本中进行有效检测，进一步用于法医唾液样本的鉴别中。因为口腔特异性菌仅存在于唾液中，通过对口腔特异性菌的定性定量检测，进而可实现从多种体液中出检出唾液。首先收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、***液样本，进行简单的预处理后，通过碳化硅@BSA-抗菌肽纳米探针对不同体液样本中口腔特异细菌定量检测，检出口腔细菌。

实施例4

本实施例的检测方法与实施例1相同，仅将实施例中的多肽链换成多肽序列表所示多肽序列(GLLWHLLHHLLH-NH2)，最终测量结果同样可以实现对口腔细菌的定量检测，通过在实际样本中检出口腔细菌，从而进行法医学中的唾液鉴定。

实施例5

本实施例的检测方法与实施例1相同，仅将实施例中的多肽链换成多肽序列表所示多肽序列(GLLWHLLHHLLH-COOH)，最终测量结果同样可以实现对口腔细菌的定量检测，通过在实际样本中检出口腔细菌，从而进行法医学中的唾液鉴定。

实施例6

本实施例的检测方法与实施例2相同，仅将实施例中的多肽链换成多肽序列表所示多肽序列(TFFRLFNR-GG-GWGSFFKKAAHVGKL-NH2)，最终测量结果同样可以实现对口腔细菌的定量检测，通过在实际样本中检出口腔细菌，实现法医学中的唾液鉴定。

实施例7

本实施例的检测方法与实施例2相同，仅将实施例中的多肽链换成多肽序列表所示多肽序列(TFFRLFNR-GG-GWGSFFKKAAHVGKL-COOH)，最终测量结果同样可以实现对口腔细菌的定量检测，通过在实际样本中检出口腔细菌，从而进行法医学中的唾液鉴定。

实施例8

本实施例的检测方法与实施例3相同，仅将实施例中的多肽链换成多肽序列表所示多肽序列(K-Acp-Acp-Acp-RRRRSVQWCA-NH2)，最终测量结果同样可以实现对口腔细菌的定量检测，通过在实际样本中检出口腔细菌，实现法医学中的唾液鉴定。

实施例9

本实施例的检测方法与实施例3相同，仅将实施例中的多肽链换成多肽序列表所示多肽序列(K-Acp-Acp-Acp-RRRRSVQWCA-COOH)，最终测量结果同样可以实现对口腔细菌的定量检测，通过在实际样本中检出口腔细菌，实现法医学中的唾液鉴定。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。