阅读说明：本技术 一种拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法 (Method for measuring astaxanthin content of haematococcus pluvialis by Raman microscope ) 是由 李珂 李清毅 李国能 郑友取 卜钟鸣 程军 于 2019-11-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法,其特征在于,包括下述测定步骤:a.取不同生长阶段的含有虾青素的红色雨生红球藻活体细胞,分为两组,一组取1mL离心得浓缩藻液用于拉曼光谱的测定,一组取50mL离心后冷冻干燥制备成雨生红球藻藻粉,用于高效液相色谱测定虾青素含量。本发明提供一种可以即时监测雨生红球藻活体细胞内部虾青素积累情况,所需样本量少,可以对单个细胞内的代谢物质含量进行检测,无需对样品进行破坏性预处理,可对活体细胞直接进行检测的拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法。(The invention relates to a method for measuring astaxanthin content of haematococcus pluvialis by using a Raman microscope, which is characterized by comprising the following measuring steps of a, dividing red haematococcus pluvialis living cells containing astaxanthin at different growth stages into two groups, centrifuging 1mL of the red haematococcus pluvialis living cells to obtain concentrated algae liquid for measuring a Raman spectrum, centrifuging 50mL of the red haematococcus pluvialis living cells, and freeze-drying the centrifuged 50mL of the concentrated algae liquid to prepare haematococcus pluvialis algae powder for measuring the astaxanthin content by using a high performance liquid chromatography. The invention provides a method for measuring astaxanthin content of haematococcus pluvialis by using a Raman microscope, which can immediately monitor the astaxanthin accumulation condition in living cells of the haematococcus pluvialis, has small required sample amount, can detect the content of metabolic substances in single cells, does not need to perform destructive pretreatment on the sample, and can directly detect the living cells.)

一种拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物活性物质无损检测技术领域，尤其是涉及利用拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素的方法。

背景技术

雨生红球藻虾青素含量的确定通常使用溶剂萃取法、超声波萃取法、微波萃取法和超临界CO₂萃取法等方法提取，然后再通过分光光度法、高效气相色谱法和高效液相色谱-质谱联用进行测定。检测过程费时费力，无法满足快速检测的需求。溶剂萃取法使用的萃取剂通常具有毒性，对实验和操作人员的健康不利。高效液相色谱和气相色谱虽然测定结果精确可靠，但仪器操作复杂，并且仍需要复杂的预处理过程。此外，上述方法都需要从样本中提取大量的目标物质才可测定，不适于少量培养的雨生红球藻虾青素的测定，或者需要破坏细胞结构，并不能即时监测雨生红球藻活体细胞内部虾青素积累情况。

发明内容

本发明主要解决现有技术所存在的现有方法都需要从样本中提取大量的目标物质才可测定，不适于少量培养的雨生红球藻虾青素的测定，或者需要破坏细胞结构，并不能即时监测雨生红球藻活体细胞内部虾青素积累等的技术问题，提供一种可以即时监测雨生红球藻活体细胞内部虾青素积累情况，所需样本量少，可以对单个细胞内的代谢物质含量进行检测，无需对样品进行破坏性预处理，可对活体细胞直接进行检测的拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法。

为了解决上述技术问题实现上述发明目的，本发明提供拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法，其特征在于，包括下述测定步骤:

a.取不同生长阶段的含有虾青素的红色雨生红球藻活体细胞，分为两组，一组取1mL离心得浓缩藻液用于拉曼光谱的测定，一组取50mL离心后冷冻干燥制备成雨生红球藻藻粉，用于高效液相色谱测定虾青素含量；

b.拉曼光谱样品预处理：取雨生红球藻红色阶段细胞，采集活体细胞的拉曼光谱信号，使用4%浓度的低温琼脂固定细胞，将浓缩藻液和低温琼脂液混合制成雨生红球藻样本，滴加到载玻片上，盖上盖玻片，待低温琼脂冷却凝固后，置于拉曼显微镜下观察；

c.拉曼光谱信息采集：将制好的雨生红球藻样本固定在激光共聚焦拉曼显微镜物镜下方载物台上，用532 nm激光束通过20X的物镜聚焦到雨生红球藻单细胞样本表面，瞬时激光强度为1mW，实验过程中保持在恒温25℃条件下进行；

d.拉曼成像提取光谱信号：在雨生红球藻细胞内以步长0.6 μm画网格取点，采用静态扫描方式，以1525 cm ^-1为中心在1250~1750 cm ^-1范围内进行扫描，曝光时间为5 s，提取每个取样点的拉曼光谱；

e.拉曼光谱数据预处理：首先，对原始光谱数据进行基线校正，以消除背景值的干扰；然后，采用卷积平滑法处理基线校正后的数据，除去实验过程中仪器、样本、人为因素造成的数据噪声；

f.半定量虾青素含量：在雨生红球藻细胞的拉曼光谱中，取1525 cm ^-1处的特征峰用于虾青素的诊断，特征峰信号的强度与物质的含量成线性正相关，可用于量化虾青素含量，取各取样点1525 cm ^-1波段处的拉曼强度做平均值，代表整个雨生红球藻细胞内虾青素的拉曼强度；

g.虾青素含量—拉曼强度曲线：采用高效液相色谱法测定不同生长阶段的雨生红球藻虾青素含量，与拉曼强度一一对应，以拉曼强度为横坐标，以虾青素含量为纵坐标绘制虾青素含量—拉曼强度曲线，计算虾青素含量对拉曼强度的拟合方程；

h.拉曼光谱确定虾青素含量：取待测雨生红球藻红色阶段细胞，采集细胞的拉曼光谱信号，样品处理方法如步骤（b）所示；拉曼光谱信息采集如步骤（c）所示；拉曼成像提取光谱信号如步骤（d）所示；拉曼光谱数据预处理如步骤（e）所示；

i.虾青素含量的确定：取步骤（h）处理后的拉曼数据，代入虾青素含量—拉曼强度曲线中，计算得出待测雨生红球藻虾青素含量。

作为本发明拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法，步骤a中，红色雨生红球藻活体细胞离心得浓缩藻液步骤为，采用高速冷冻离心机离心收获微藻生物质，转数为5000rpm-10000rpm/min，离心5min-10min。

作为本发明拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法，步骤（a）中，红色雨生红球藻活体细胞冷冻干燥得雨生红球藻藻粉步骤为将离心后的藻泥至于-70℃至-80℃超低温冰箱中冷冻20h-30h，再置于冷冻干燥机中进行真空干燥，冷冻干燥机运行温度为-55℃，真空度为0.1 mbar。

作为本发明曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法，在步骤b中4%浓度的低温琼脂具体制备方法如下：

A.将低温琼脂粉加到去离子水中，升温到40℃后，按照1：5的体积比将浓缩藻液和低温琼脂液混合，滴加到载玻片上，盖上盖玻片，待琼脂冷却凝固。

作为本发明拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法，步骤（3）中，激光共聚焦拉曼显微镜为雷尼绍共聚焦激光显微拉曼仪的仪器配置：

1）共焦显微镜，5X，20X，50X，100X，拉曼光谱仪系统总通光效率大于30%，250 mm焦长，真共焦模式，在100X物镜下，空间分辨率横向好于1μm，纵向好于2μm；光谱重复性≤ ±0.2cm-1，三点机械定位仪器底板；研究级徕卡显微镜；半导体激光器532 nm，50 mW；雷尼绍高功率半导体激光器785 nm，大于250 mW；高光谱分辨率＜0.65 cm-1。

本发明带来的有益效果是，提供一种可以即时监测雨生红球藻活体细胞内部虾青素积累情况，所需样本量少，可以对单个细胞内的代谢物质含量进行检测，无需对样品进行破坏性预处理，可对活体细胞直接进行检测的拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法。

因此，本发明具有样本预处理过程简单，仪器操作流程简明，测定时间短等特点。

附图说明

附图1是本发明的一种流程示意图。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：

根据图1所示的拉曼显微镜测定雨生红球藻虾青素含量的方法具体包括下述步骤：

a.取经高光诱导虾青素合成12、24、48、96、100h的雨生红球藻活体细胞，分为两组，一组取1mL离心得浓缩藻液用于拉曼光谱的测定，一组取50mL离心后冷冻干燥制备成雨生红球藻藻粉，用于高效液相色谱测定虾青素含量;

b.拉曼光谱样品预处理：取雨生红球藻红色阶段细胞，采集活体细胞的拉曼光谱信号，使用4%浓度的低温琼脂固定细胞，将浓缩藻液和低温琼脂液混合制成雨生红球藻样本，滴加到载玻片上，盖上盖玻片，待低温琼脂冷却凝固后，置于拉曼显微镜下观察；

c.拉曼光谱信息采集：将制好的雨生红球藻样本固定在激光共聚焦拉曼显微镜物镜下方载物台上，用532 nm激光束通过20X的物镜聚焦到雨生红球藻单细胞样本表面，瞬时激光强度为1mW，实验过程中保持在恒温25℃条件下进行；

d.拉曼成像提取光谱信号：在雨生红球藻细胞内以步长0.6 μm画网格取点，采用静态扫描方式，以1525 cm ^-1为中心在1250~1750 cm ^-1范围内进行扫描，曝光时间为5 s，提取每个取样点的拉曼光谱；

e.拉曼光谱数据预处理：首先，对原始光谱数据进行基线校正，以消除背景值的干扰；然后，采用卷积平滑法处理基线校正后的数据，除去实验过程中仪器、样本、人为因素造成的数据噪声；

f.半定量虾青素含量：在雨生红球藻细胞的拉曼光谱中，取1525 cm ^-1处的特征峰用于虾青素的诊断，特征峰信号的强度与物质的含量成线性正相关，可用于量化虾青素含量，取各取样点1525 cm ^-1波段处的拉曼强度做平均值，代表整个雨生红球藻细胞内虾青素的拉曼强度；

g.虾青素含量—拉曼强度曲线：采用高效液相色谱法测定不同生长阶段的雨生红球藻虾青素含量，与拉曼强度一一对应，以拉曼强度为横坐标，以虾青素含量为纵坐标绘制虾青素含量—拉曼强度曲线，计算虾青素含量对拉曼强度的拟合方程；

h.拉曼光谱确定虾青素含量：取高光诱导虾青素合成36h后的雨生红球藻红色阶段细胞，采集细胞的拉曼光谱信号。样品处理方法如步骤（b）所示；拉曼光谱信息采集如步骤（c）所示；拉曼成像提取光谱信号如步骤（d）所示；拉曼光谱数据预处理如步骤（e）所示；

i.虾青素含量的确定：取步骤（h）处理后的拉曼数据，代入虾青素含量—拉曼强度曲线中，计算得出待测雨生红球藻虾青素含量。

本实施例中，步骤a中，红色雨生红球藻活体细胞离心得浓缩藻液的步骤为采用高速冷冻离心机离心收获微藻生物质，转数为5000rpm-10000rpm/min，离心5min-10min。

本实施例中，步骤a中，红色雨生红球藻活体细胞冷冻干燥得雨生红球藻藻粉步骤为将离心后的藻泥至于-70℃至-80℃，超低温冰箱中冷冻20h-30h，再置于冷冻干燥机中进行真空干燥。冷冻干燥机运行温度为-55℃，真空度为0.1 mbar。

本实施例中，步骤a和步骤g中，所诉高效液相色谱法是国家标准《GB/T 31520-2015红球藻中虾青素的测定液相色谱法》中描述的虾青素测定方法。

本实施例中，步骤b中，4%（w/v）浓度的低温琼脂具体制备方法如下：将低温琼脂粉（Sigma, type I-A, low EEO）加到去离子水中，升温到40℃后，按照1：5的体积比将浓缩藻液和低温琼脂液混合，滴加到载玻片上，盖上盖玻片，待琼脂冷却凝固。

本发明中，所述步骤c中，激光共聚焦拉曼显微镜为雷尼绍共聚焦激化显微拉曼仪（Renishaw inVia）。

1）共焦显微镜，5X，20X，50X，100X，拉曼光谱仪系统总通光效率大于30%，250 mm焦长，真共焦模式，在100X物镜下，空间分辨率横向好于1μm，纵向好于2μm；光谱重复性≤ ±0.2cm-1，三点机械定位仪器底板；研究级徕卡显微镜；半导体激光器532 nm，50 mW；雷尼绍高功率半导体激光器785 nm，大于250 mW；高光谱分辨率＜0.65 cm-1。