阅读说明：本技术 一种从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法 (Method for screening triploid new germplasm from white loquat seedling ) 是由 王三红 荣志豪 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法。该方法包含(1)通过形态学观测,根据白沙枇杷三倍的形态学特征从实生苗群体中初筛三倍体,满足以下条件的为疑似白沙枇杷三倍体；(2)通过流式细胞仪进一步鉴定疑似沙枇杷三倍体白的倍性。本发明溶液配制简单,操作步骤易上手筛选成功率高,结果可靠,与目前应用在枇杷流式倍性筛选上的其他方法相比优势明显。与传统的染色体计数技术相比,应用该方法筛选效率可以提高4-5倍。通过本发明方法,能实现白沙枇杷三倍体实生苗的大规模快速鉴定。(The invention discloses a method for screening triploid new germplasm from white loquat seedlings. The method comprises (1) primarily screening triploid from seedling group according to morphological characteristics three times of white sand loquat by morphological observation, wherein suspected white sand loquat triploid satisfies the following conditions; (2) and further identifying the ploidy of the suspected eriobotrya japonica triploid white by a flow cytometer. The method has the advantages of simple solution preparation, easy operation steps, high screening success rate and reliable result, and has obvious advantages compared with other methods applied to loquat flow type ploidy screening at present. Compared with the traditional chromosome counting technology, the screening efficiency can be improved by 4-5 times by applying the method. The method can realize large-scale rapid identification of the triploid seedlings of the white sand loquat.)

一种从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法。

背景技术

白沙枇杷因其肉质细腻、甜度高等特点深受消费者的喜爱，江苏苏州是白沙枇杷的主产区之一。白沙枇杷大多品种核多且大，影响了其食用体验。培育三倍体白沙枇杷可以有效解决这一难题，对促进枇杷产业发展具有重要意义。实生苗筛选是枇杷新品种培育的一条重要途径，目前枇杷的主要栽培品种中：白玉(戚子洪，2001)、解放钟(李碧莲，1999)、大五星(陈贵虎等，2002)等品种都是通过实生选育而来。而在枇杷三倍体育种的几种途径中，实生筛选是一条重要途径，近年来西南大学的梁国鲁教授(2011)通过“一步法”获得了天然三倍体突变体单株，后又从300株系中优选出2个株系，获得了“常白1号”Q11、“77-1”K375，三倍体无核枇杷新优系。枇杷三倍体鉴定，以前主要通过根尖染色体压片，在显微镜下进行染色体计数的方法，该方法不仅过程繁琐，而且费时费力，筛选效率低下。目前急需一种能够大规模从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种从白沙枇杷实生苗筛选三倍体新种质的方法，包含以下步骤：

(1)通过通过形态学观测，根据白沙枇杷三倍的形态学特征从实生苗群体中初筛三倍体，满足以下条件的为疑似白沙枇杷三倍体：三倍体枇杷完全展开同一节位的叶片叶面积较二倍体大1.3倍以上，三倍体叶形指数为2.7±0.25,二倍体叶形指数为3.5±0.3；三倍体叶片与枝干夹角比二倍体大,三倍体叶片与枝干夹角为70°±10；二倍体叶片与枝干夹角44°±10；三倍体叶色较深，叶脉凹陷；所述的叶形指数为叶长/叶宽；

(2)通过流式细胞仪进一步鉴定疑似白沙枇杷三倍体的倍性。

所述的步骤(2)通过流式细胞仪进一步鉴定疑似白沙枇杷三倍体的倍性优选包括以下步骤：

(a)取洗净的幼嫩的白沙枇杷叶片，撕碎加入离心管，向离心管中加入洁净的氧化锆珠和提取液A1.5～2mL磨样；

(b)磨样完成后，用400目的尼龙筛过滤；

(c)滤液离心，弃上清，向沉淀中加入提取液B摇匀使沉淀消失，低温避光染色5min，上机检测；

(d)经PI染色的样品通过流式细胞仪检测出荧光强度，使用随机软件CellQuestProTM获取数据，数据采用流式细胞仪的cytExpert统计CV值；

(e)倍性计算方法：待测样本倍性水平＝参照样品的倍性水平×待测样本G0/G1峰荧光均值:参照样本G0/G1峰荧光均值；

其中，所述的提取液A是在核分离缓冲液中添加1～2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP所得；提取液B是将PI粉末加入核分离缓冲液中，配置成0.3～0.5mg·mL^-1的PI染液，再加入0.03～0.05mg·mL^-1的RNA酶所得；所述的核分离缓冲液配方为8～12mmol·L^-1MgSO₄·7H₂O，45～50mmol·L^-1KCl，5～8mmol·L^-1的HEPES，0.25～0.3％(v/v)Triton X-100。

所述的核分离缓冲液配方优选为10mmol·L^-1MgSO₄·7H2O，50mmol·L^-1KCl，5mmol·L^-1的HEPES，0.25％(v/v)Triton X-100。

所述的提取液A进一步优选在所述的核分离缓冲液中添加1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP所得；所述的提取液B优选是将PI粉末加入所述的核分离缓冲液中，配置成0.5mg·mL^-1的PI染液，再加入0.05mg·mL^-1的RNA酶所得。

所述的白沙枇杷流式倍性鉴定方法，优选步骤(1)取幼嫩的枇杷叶片用灭菌的双蒸水清洗干净，并用吸水纸吸干水分，将叶片撕碎放入离心管，避开叶脉等部位，叶片体积大约占离心管的1/3，加入6-8颗洁净的氧化锆珠，加入提取液A至2mL刻度线，将磨样机调至50Hz，磨样时间调至2min，开始磨样。

步骤(3)中所述的离心优选采用低温离心机离心，4℃，3000rpm离心5min。

步骤(3)中所述的提取液B的加入量优选为0.5mL/管。

有益效果：

发明人通过观察、鉴定和总结发现，白沙枇杷二倍体和三倍体在叶片夹角，大小，叶形、茎间节的长度等形态学参数方面有着较大区别，因此先通过形态学观测筛选疑似白沙枇杷三倍体，极大范围的缩小了筛查范围，再通过流式细胞仪快速鉴定实生枇杷倍性，特别是通过优化核分离缓冲液，细胞上样速度较快，每管样品均可在2min内完成10000细胞的采集，适合实生枇杷快速筛选的要求，目标细胞团的平均CV值为6.46％，小于8％，说明实验结果是基本可靠。本发明中应用的流式筛选方法溶液配制简单，操作步骤易上手，特别对于操作过程中的环境条件及手法要求不严苛，筛选成功率高，结果可靠，与目前应用在枇杷流式倍性筛选上的其他方法相比优势明显。与传统的染色体计数技术相比，应用该方法筛选效率可以提高4-5倍。通过本发明方法，能实现白沙枇杷三倍体实生苗的大规模快速鉴定。

附图说明

图1.不同方法的流式荧光强度图

图2.48号植株的倍性鉴定

A:二倍体枇杷对照组荧光强度峰；B：48号枇杷荧光强度峰；C：实生二倍体枇杷荧光强度峰；

a:二倍体枇杷对照组染色体计数；b：48号枇杷染色体计数

图3.二倍体及三倍体枇杷气孔密度对比

注：Ⅰ：二倍体枇杷；Ⅱ：三倍体枇杷；Bar＝50μm。

具体实施方式

实施例1细胞核分离液的筛选

1.1试验材料及仪器：

2018年10月以江苏省白沙枇杷资源圃(江苏省太湖常绿果树技术推广中心)内的一年生、两年生苏州东山白沙枇杷实生播种幼苗作为试验材料。

流式细胞仪采用BECKMAN COULTER公司的CytoFLEX，选择PE通道上样检测。

1.2流式细胞术鉴定：

方法I:

提取液配置：

MgSO4缓冲液配置：将缓冲液配置成10mmol·L^-1MgSO4·7H2O，50mmol·L^-1KCl，5mmol·L^-1的HEPES，0.25％(v/v)Triton X-100的混合液，其中HEPES先配置成1mol·L^{- 1}HEPES溶液：23.8g HEPES溶于90ml水中，NaOH调至pH＝8.0，加水定容至100mL。

提取液A：MgSO₄缓冲液中添加1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮PVP，配置好以后放入4℃冰箱备用。

提取液B：将1g PI粉末加入MgSO4缓冲液中，配置成0.5mg·mL^-1的PI染液，注意避光添加，再加入0.05mg·mL^-1的RNA酶(RNase)，现配现用最佳。如果PI配置不便可以配好后放入4℃冰箱避光保存一个月左右，取用时临时加入RNase。

试验步骤：

取幼嫩的枇杷叶片用灭菌的双蒸水清洗干净，并用吸水纸吸干水分，简单将叶片撕碎放入离心管，尽量避开叶脉等部位，叶片体积大约占离心管的1/3，太多则不利于磨样，太少则不利于提取到足量的完整细胞。加入6-8颗洁净的氧化锆珠，加入提取液A至2mL刻度线(不少于1.5mL)，加入完成后若不能立即磨样应先将离心管置于冰上。将磨样机调至50Hz，磨样时间调至2min，开始磨样。磨样完成后，用400目的尼龙筛过滤，吸取过滤后的滤液1mL，置于低温离心机离心(离心机参数设置：3000rpm，5min，4℃)。离心完成后弃掉上清液，加入0.5mL的提取液B，摇匀使沉淀消失，低温避光染色5min即可上机检测。

表1. 3种细胞核分离液的效果对比

1.3 CV值的统计

每种试验方法的数据中各随机统计10组CV值。

1.4倍性计算方法：待测样本倍性水平＝参照样品的倍性水平×待测样本G0/G1峰荧光均值:参照样本G0/G1峰荧光均值.

1.5结果

三种不同细胞核分离缓冲液，三种试验方法在枇杷倍性鉴定上的应用效果见表1和图1。方法Ⅰ适合本试验采集的白沙枇杷材料的流式倍性鉴定，目标细胞团的平均CV值为6.46％，小于8％，说明实验结果是基本可靠的，此外该试验方法处理下，细胞上样速度较快，每管样品均可在2min内完成10000细胞的采集，适合实生枇杷快速筛选的要求。方法Ⅱ参考BECKMAN COULTER流式细胞仪技术手册，是OTTO缓冲液的改良方法，试验需要经过反复3次离心加液，程序较为繁琐，获得目标峰的纵坐标值较高但成功率不稳定且CV值在11.00％，无法保证结果的准确可靠。方法Ⅲ参考陈丙义(2013)在草莓中的应用方法，该方法较难获得理想的目标细胞团，流式细胞仪得到的散点图中获得大量细胞碎片，因此该方法无法计算CV值且不适宜枇杷倍性的快速鉴定。综合以上分析，本试验采用方法Ⅰ作为实生枇杷倍性快速鉴定的流式细胞术方法，该方法溶液配制步骤简洁，CV值控制较低可以获得清晰的目标细胞团，可以达到本试验对实生枇杷倍性的快速筛选要求。

通过流式细胞术对924株白沙枇杷实生幼苗倍性鉴定，在其中发现6株编号分别为48、548、563、592、530和893号的幼苗，在流式细胞仪鉴定结果中细胞团以及荧光强度峰位于横坐标120的位置(图2.B所示)，而在之前已经鉴定过的对照组中确定二倍体(2n＝2x＝34)的峰值位于80(图2.A、a所示)。因此初步确定它们为三倍体，对上述植株的根尖染色体压片，染色体计数结果清晰可见51条染色体(图2.b所示)，由此确认48、548、563、592、530和893号植株是实生三倍体(2n＝3x＝51)白沙枇杷新品系。由此也进一步证明了该流式鉴定方法在枇杷倍性鉴定方面的可靠性。图2.C是试验中鉴定的普通实生二倍体枇杷的荧光强度峰值图。

观察发现，三倍体枇杷植株在形态外观与二倍体不同，三倍体枇杷同一节位完全展开的叶片叶面积较二倍体大1.3倍以上，叶形指数(叶长/叶宽)较二倍体小(三倍体为2.70±0.25，二倍体为3.5±0.3)；叶片与枝干夹角比二倍体大(分别为70°±10°；44°±7°)，部分叶片甚至弯曲略下垂，叶色较深，叶脉凹陷。二倍体与三倍体植株叶形及茎叶夹角统计结果见表2，二倍体与三倍体植株气孔长度及密度统计结果见表3，二倍体及三倍体枇杷(48号植株)气孔密度对比结果见图3。

表2.二倍体与三倍体植株叶形及茎叶夹角统计

注:P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

表3.二倍体与三倍体植株气孔长度及密度统计

注:P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

根据上述结果，确定区分白沙枇杷二倍体和三倍体的形态学参数标准如下：三倍体叶形指数较二倍体较小，均值在2.7±0.25，叶片与茎干夹角比二倍体大，均值为70°±10°；气孔密度远远小于二倍体，其密度为16.0个/mm²，叶脉凹陷，叶色较深。

实施例2

按照本发明方法对924株白沙枇杷实生苗进行三倍体筛选。按照实施例1中记载的形态学参数标准，初步筛选出17株疑似三倍体白沙枇杷。

取疑似三倍体白沙枇杷幼嫩叶片用灭菌的双蒸水清洗干净，并用吸水纸吸干水分，简单将叶片撕碎放入离心管，尽量避开叶脉等部位，叶片体积大约占离心管的1/3，太多则不利于磨样，太少则不利于提取到足量的完整细胞。加入6-8颗洁净的氧化锆珠，加入提取液A至两毫升刻度线，加入提取液的量不少于1.5mL，加入完成后若不能立即磨样应先将离心管置于冰上。将磨样机调至50Hz，磨样时间调至2分钟，开始磨样。磨样完成后，用400目的尼龙筛过滤，吸取过滤后的滤液1ml，置于低温离心机离心(离心机参数设置：3000rpm，5min，4℃)。离心完成后弃掉上清液，加入0.5mL的提取液B，摇匀使沉淀消失，低温避光染色5min即可上机检测。其中提取液A和B的配置方法同实施例1。

流式细胞仪采用BECKMAN COULTER公司的CytoFLEX，选择PE通道上样检测，统计CV值，按照实施例记载的公式并计算倍性。结果显示有6株确定为三倍体，对确定为三倍体的植株进行根尖染色体压片验证，结果显示流式结果确定的三倍体植株准确率为100％。