一种负载没食子酸胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法及水凝胶的应用
阅读说明：本技术 一种负载没食子酸胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法及水凝胶的应用 (Preparation method of gallic acid-loaded collagen injectable hydrogel and application of hydrogel ) 是由 张瑗 张其清 林越威 杨智炫 刘志刚 于 2021-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物材料领域,特别涉及一种接枝没食子酸胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法及应用。该方法从植物中提取出单宁,水解生成没食子酸,接枝到胶原蛋白上,与氧化海藻酸钠混合制备成可注射水凝胶,可应用于硬脑膜修复材料的制备。该制备方法实现没食子酸从提取到负载于胶原蛋白的工艺步骤可连续进行,中途无需经过重结晶、烘干、再溶解等过程,可节省时间。随着胶原蛋白降解,没食子酸释出,可产生抗炎、抗感染等效果。胶原蛋白和氧化海藻酸钠混合制成可注射水凝胶,在作为硬脑膜修复材料上具有快速凝固、降解速度适中、不会产生有害产物的特点。(The invention belongs to the field of biological materials, and particularly relates to a preparation method and application of gallic acid-grafted collagen injectable hydrogel. The method comprises extracting tannin from plant, hydrolyzing to generate gallic acid, grafting onto collagen, and mixing with oxidized sodium alginate to obtain injectable hydrogel, which can be used for preparing dura mater repair material. The preparation method realizes continuous extraction of gallic acid from collagen-loaded process, and saves time without recrystallization, oven drying, and re-dissolution. Along with the degradation of collagen, gallic acid is released, and has anti-inflammatory and anti-infectious effects. The injectable hydrogel prepared by mixing the collagen and the oxidized sodium alginate has the characteristics of rapid solidification, moderate degradation speed and no generation of harmful products when being used as a dura mater repair material.)
技术领域
本发明属于生物材料领域，特别涉及一种接枝没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法及应用。
背景技术
患者大脑或脊椎外科手术后硬脑膜有一定的几率发生破裂，从而引发脑脊液外漏、颅内感染、脑膨出和脑粘连等，传统的补救措施一般需要进行二次手术，重新对硬脑膜进行缝合，但这种方法会对患者造成二次伤害，且有较大的风险。另一种方法是注射氰基丙烯酸正丁酯与体内的水分反应后聚合并凝固，使硬脑膜封闭，随后聚氰基丙烯酸正丁酯被人体降解吸收，避免进行二次手术，但聚氰基丙烯酸正丁酯降解速度较慢，且不具有引导组织再生的效果。
胶原蛋白是一种性能优异的生物材料，具有良好的弹性和粘性，能有效引导组织再生。没食子酸具有抗氧化、抗自由基、抗炎症、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功效，将其负载到胶原蛋白分子链上可提升胶原蛋白的水溶性，并提高材料的治疗效果。氧化海藻酸钠羟基氧化的醛基与胶原蛋白的氨基反应可使胶原蛋白交联作为可注射水凝胶使用，最终被水凝胶被人体降解吸收，且不会产生有害残留。
CN112646078A公开了一种纤维素接枝共聚物及其制备方法与在可注射水凝胶中的应用。纤维素的溶解采用氯化锂/N,N-二甲基乙酰胺(LiCl/DMAc)体系，随后将纤维素溶解液转移至圆底烧瓶中，引入2-溴异丁酰溴(BIBB)反应形成纤维素大分子引发剂。纤维素大分子引发剂以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)为单体，以五甲基二乙烯三胺/溴化亚铜(PMDETA/CuBr)为催化体系，以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂合成纤维素接枝共聚物。该纤维素接枝共聚物在浓度高于5％时于常温下为可流动液体，在37℃以上时即形成不可流动的水凝胶，从而在可注射载药水凝胶领域具有潜在的应用价值。但是纤维素不能溶于水、不能被人体降解吸收，没有实际应用价值。
CN112220963A公开了一种非溶胀UV交联壳聚糖可注射水凝胶及其合成方法。其属于生物高分子材料合成与改性领域，目的是为了解决现有UV交联壳聚糖水凝胶存在溶胀度大的问题，进而导致在植入部位会挤压周围组织。其中水凝胶由N-戊烯基壳聚糖、水性介质和光引发剂经UV交联而成。合成方法：一、将N-戊烯基壳聚糖溶于水性介质，得到N-戊烯基壳聚糖的水性溶液；二、向步骤一得到的N-戊烯基壳聚糖的水性溶液中加入光引发剂，置于UV辐照下交联成水凝胶。该发明利用壳聚糖和戊烯酐之间的酰化反应一步法合成了N-戊烯基壳聚糖，戊烯基单元通过UV交联形成的碳链长度为10强疏水性单元，赋予水凝胶的非溶胀性能，其溶胀度仅为0.6-0.8倍。UV对细胞有一定伤害，且不能穿过颅骨，不适用于硬脑膜修复。
从以上可以看出，至今尚未有适合用于硬脑膜修复、可引导组织再生，且安全无毒的可注射水凝胶。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供由上述胶原蛋白水凝胶在制备硬脑膜修复材料上的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）单宁酸提取
把植物磨成粉末，加入纯化水，置于超声清洗器中提取，过滤固体残渣，滤液经脱色剂脱色，再经离子交换柱吸去杂质，得到单宁溶液；
（2）单宁酸水解
把步骤（1）得到的单宁溶液调节pH值到一定值，水热反应，得到没食子酸溶液；
（3）没食子酸负载于胶原蛋白
把步骤（2）得到的没食子酸溶液调节至一定浓度，加入适当重量的胶原蛋白、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌一定时间，加入一定量无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥后得到负载没食子酸胶原蛋白，分装到西林瓶中，密封、灭菌；
（4）氧化海藻酸钠制备
配制一定浓度的海藻酸钠溶液，加入适量的高碘酸钠搅拌一定时间，然后加入一定量乙二醇再搅拌一定时间，加入一定量无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，得到氧化海藻酸钠，分装到西林瓶中，密封、灭菌；
（5）可注射水凝胶制备
把生理盐水加到步骤（3）和步骤（4）的西林瓶中，分别配成一定浓度的负载没食子酸胶原蛋白溶液和一定浓度的氧化海藻酸钠溶液，把氧化海藻酸钠溶液从西林瓶中全部抽出，注射到装有负载没食子酸胶原蛋白溶液的西林瓶，搅拌一定时间后用注射器抽出，得到负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶。
优选的，步骤（1）所述的药材为五倍子、没食子、果皮、鞣类植物中的任意一种或几种。
优选的，步骤（1）所述的纯化水重量为植物的10~50倍。
优选的，步骤（1）所述的提取条件为超声功率50~200 W、温度30~60℃、时间10~60分钟。
优选的，步骤（1）所述的脱色剂为白土。
优选的，步骤（1）所述的脱色条件为固液比1~10:100g/ml、温度25~90℃、时间10~120分钟。
优选的，步骤（1）所述的离子交换柱的吸附剂为活性炭。
优选的，步骤（1）所述的吸取杂质条件为流速10~100 ml/min。
优选的，步骤（2）所述的调节pH值到一定值使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，调节到4.5~6.5。
优选的，步骤（2）所述的水热反应具体为在100~150 ℃反应3~6小时。
优选的，步骤（3）所述的调节至一定浓度为使用pH值为4.5~6.5的磷酸缓冲溶液调节到0.001~0.01 g/ml。
优选的，步骤（3）所述的适当重量的胶原蛋白、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐为，胶原蛋白0.005~0.1 g/ml，N-羟基琥珀酰亚胺0.0005~0.005 g/ml，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.001~0.005 g/ml。
优选的，步骤（3）所述的搅拌一定时间为4~36小时。
优选的，步骤（3）所述的一定量无水乙醇为没食子酸溶液体积的3~5倍。
优选的，步骤（4）所述的一定浓度的海藻酸钠溶液为1~5%（w/w）。
优选的，步骤（4）所述的适量的高碘酸钠为0.001~0.05 g/ml。
优选的，步骤（4）所述的搅拌一定时间为1~24小时。
优选的，步骤（4）所述的一定量乙二醇为0.01~0.05 ml/ml。
优选的，步骤（4）所述的再搅拌一定时间为0.5~2小时。
优选的，步骤（4）所述的一定量无水乙醇为海藻酸钠溶液体积的3~5倍。
优选的，步骤（5）所述的一定浓度的负载没食子酸胶原蛋白溶液为0.5~2%（w/w）。
优选的，步骤（5）所述的一定浓度的氧化海藻酸钠溶液为5~20%（w/w）。
优选的，步骤（5）所述的搅拌一定时间为10~120秒。
本发明进一步提供上述制备方法得到的负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶。
本发明进一步提供上述负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶在制备硬脑膜修复材料上的应用。
优选的，所述的应用的方法为把负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶作为硬脑膜修复材料使用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）没食子酸从提取到负载于胶原蛋白的工艺步骤可连续进行，中途无需经过重结晶、烘干、再溶解等过程，节省时间。
（2）没食子酸接枝到胶原蛋白，随着胶原蛋白降解，没食子酸释出，可产生抗炎、抗感染等效果。
（3）胶原蛋白和氧化海藻酸钠混合制成可注射水凝胶，在作为硬脑膜修复材料上具有快速凝固、降解速度适中、不会产生有害产物的特点。
附图说明
图1 负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶分子结构。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
实施例1
本发明提供一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法。
一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）单宁酸提取
把五倍子磨成粉末，加入五倍子重量10倍的纯化水，置于超声清洗器中提取，提取条件为超声功率50 W、温度30 oC、时间10分钟，过滤固体残渣，滤液经白土脱色，脱色条件为固液比1:100 g/ml、温度25 oC、时间10分钟，再经活性炭离子交换柱吸去杂质，吸取杂质条件为流速10 ml/min，得到单宁溶液。
（2）单宁酸水解
把步骤（1）得到的单宁溶液使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH值到4.5，加到水热反应釜中，在100 oC反应3小时，得到没食子酸溶液。
（3）没食子酸负载于胶原蛋白
把步骤（2）得到的没食子酸溶液使用pH值为4.5的磷酸缓冲溶液调节到0.001 g/ml，加入胶原蛋白0.005 g/ml，N-羟基琥珀酰亚胺0.0005 g/ml，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.001 g/ml，搅拌4小时，加入没食子酸溶液体积3倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥后得到负载没食子酸胶原蛋白，分装到西林瓶中，密封、灭菌。
（4）氧化海藻酸钠制备
配制1%（w/w）的海藻酸钠溶液，加入高碘酸钠0.001 g/ml搅拌1小时，然后加入乙二醇0.01 g/ml再搅拌0.5小时，加入海藻酸钠溶液体积3倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，得到氧化海藻酸钠，分装到西林瓶中，密封、灭菌。
（5）可注射水凝胶制备
把生理盐水加到步骤（3）和步骤（4）的西林瓶中，分别配成0.5%（w/w）负载没食子酸胶原蛋白溶液和5%（w/w）氧化海藻酸钠溶液，把氧化海藻酸钠溶液从西林瓶中全部抽出，注射到装有负载没食子酸胶原蛋白溶液的西林瓶，搅拌10秒后用注射器抽出，得到负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶。
实施例2
本发明提供一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法。
一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）单宁酸提取
把没食子磨成粉末，加入没食子重量30倍的纯化水，置于超声清洗器中提取，提取条件为超声功率100 W、温度45 oC、时间35分钟，过滤固体残渣，滤液经白土脱色，脱色条件为固液比5:100g/ml、温度55 oC、时间60分钟，再经活性炭离子交换柱吸去杂质，吸取杂质条件为流速60 ml/min，得到单宁溶液。
（2）单宁酸水解
把步骤（1）得到的单宁溶液使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH值到5.5，加到水热反应釜中，在120 oC反应4小时，得到没食子酸溶液。
（3）没食子酸负载于胶原蛋白
把步骤（2）得到的没食子酸溶液使用pH值为5.5的磷酸缓冲溶液调节到0.005 g/ml，加入胶原蛋白0.05 g/ml，N-羟基琥珀酰亚胺0.001 g/ml，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.0025 g/ml，搅拌24小时，加入没食子酸溶液体积4倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥后得到负载没食子酸胶原蛋白，分装到西林瓶中，密封、灭菌。
（4）氧化海藻酸钠制备
配制3%（w/w）的海藻酸钠溶液，加入高碘酸钠0.01 g/ml搅拌12小时，然后加入乙二醇0.025 g/ml再搅拌1小时，加入海藻酸钠溶液体积4倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，得到氧化海藻酸钠，分装到西林瓶中，密封、灭菌。
（5）可注射水凝胶制备
把生理盐水加到步骤（3）和步骤（4）的西林瓶中，分别配成1%（w/w）负载没食子酸胶原蛋白溶液和10%（w/w）氧化海藻酸钠溶液，把氧化海藻酸钠溶液从西林瓶中全部抽出，注射到装有负载没食子酸胶原蛋白溶液的西林瓶，搅拌60秒后用注射器抽出，得到负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶。
实施例3
本发明提供一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法。
一种负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）单宁酸提取
把果皮磨成粉末，加入果皮重量50倍的纯化水，置于超声清洗器中提取，提取条件为超声功率200 W、温度60 oC、时间60分钟，过滤固体残渣，滤液经白土脱色，脱色条件为固液比10:100g/ml、温度90 oC、时间120分钟，再经活性炭离子交换柱吸去杂质，吸取杂质条件为流速100 ml/min，得到单宁溶液。
（2）单宁酸水解
把步骤（1）得到的单宁溶液使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节pH值到6.5，加进水热反应釜，在150 oC反应6小时，得到没食子酸溶液。
（3）没食子酸负载于胶原蛋白
把步骤（2）得到的没食子酸溶液使用pH值为6.5的磷酸缓冲溶液调节到0.01 g/ml，加入胶原蛋白0.1 g/ml，N-羟基琥珀酰亚胺0.005 g/ml，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.01 g/ml，搅拌36小时，加入没食子酸溶液体积5倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥后得到负载没食子酸胶原蛋白，分装到西林瓶中，密封、灭菌。
（4）氧化海藻酸钠制备
配制5%（w/w）的海藻酸钠溶液，加入高碘酸钠0.05 g/ml搅拌24小时，然后加入乙二醇0.05 g/ml再搅拌2小时，加入海藻酸钠溶液体积5倍的无水乙醇，收集释出物并用无水乙醇冲洗，干燥，得到氧化海藻酸钠，分装到西林瓶中，密封、灭菌。
（5）可注射水凝胶制备
把生理盐水加到步骤（3）和步骤（4）的西林瓶中，分别配成2%（w/w）负载没食子酸胶原蛋白溶液和20%（w/w）氧化海藻酸钠溶液，把氧化海藻酸钠溶液从西林瓶中全部抽出，注射到装有负载没食子酸胶原蛋白溶液的西林瓶，搅拌120秒后用注射器抽出，得到负载没食子酸的胶原蛋白可注射水凝胶。
应用例
本发明所制得的水凝胶用于制备硬脑膜填充修复的材料，可以达到快速凝固，封堵硬脑膜损伤，并且材料降解速度适中，不会产生有害产物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。