一种可再生的太赫兹生物样品检测池的制备和应用
阅读说明：本技术 一种可再生的太赫兹生物样品检测池的制备和应用 (Preparation and application of reproducible terahertz biological sample detection cell ) 是由 张阳 谢明真 府伟灵 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明申请属于生物样品检测技术领域,具体公开了一种超灵敏、无标记、可再生的特异性生物大分子检测方法,包括以下步骤：(1)可再生的太赫兹生物样品检测池的制备,包括衬底基片清洗、深硅刻蚀、镀膜、涂胶、曝光、显影、后烘、湿法刻蚀、切割；(2)通过聚乙烯亚胺－戊二醛交联法修饰高聚物膜条,制备抗体交联的检测膜条；(3)THz-TDs检测；(4)加入抗原孵育；(5)THz-TDs检测；计算其频移改变量Δf；(6)重复上述(3)-(5)步骤,可检测不同浓度的生物大分子溶液。本发明主要用于检测不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液,解决了太赫兹检测灵敏度不够、超材料的较难清洗的问题、实现了特异性、无标记的抗原检测。(The invention belongs to the technical field of biological sample detection, and particularly discloses an ultrasensitive, label-free and reproducible specific biomacromolecule detection method, which comprises the following steps: (1) the preparation method of the reproducible terahertz biological sample detection pool comprises the steps of substrate cleaning, deep silicon etching, film coating, gluing, exposure, development, post-baking, wet etching and cutting; (2) modifying the high polymer membrane strip by a polyethyleneimine-glutaraldehyde crosslinking method to prepare an antibody crosslinked detection membrane strip; (3) THz-TDs detection; (4) adding antigen for incubation; (5) THz-TDs detection; calculating the frequency shift change quantity delta f of the frequency shift; (6) repeating the steps (3) to (5) to detect the biomacromolecule solutions with different concentrations. The method is mainly used for detecting oxidized low-density lipoprotein solutions with different concentrations, solves the problems that the terahertz detection sensitivity is insufficient and the metamaterial is difficult to clean, and realizes specific unmarked antigen detection.)
技术领域
本发明属于生物样品检测技术领域，具体公开了一种可再生的太赫兹生物样品检测池及超灵敏、特异性、定量检测方法。
背景技术
太赫兹波是频率在0.1～10THz的电磁波，基于THz可以对生物物质进行无标记、非接触和无损检测。核酸、蛋白质等生物大分子之间弱的相互作用(如：氢键、范德华力等)、骨架振动及偶极子旋转等正好位于THZ频谱范围，每种生物大分子均具有特定THz波谱指纹，因此THz波能够探测到其他电磁波段无法获得的生物大分子组成、结构和功能等信息。THz波能够以一种纯物理过程、无需标记的方式在同一时间节点揭示多种生物大分子的结构和功能信息，从而可能为生物分子的无标记检测提供一种革命性新型技术手段。然而有些生物大分子在太赫兹范围内并没有特征性的吸收峰，限制了太赫兹在生物分子传感的应用。
超材料(MMs)作为一种周期性排列的亚波长人工复合电磁材料，具有天然材料难以比拟的特性。一定结构的超材料可在太赫兹频域范围内激发出高品质的谐振峰，可以有效的进行物质的传感。但是基于THz-MMs的传感仍然面临以下问题：1.缺乏特异性识别系统，特异性较差；2.少数特异性捕获基于对超材料表面金的修饰，不具有可再生性，检测成本较高；3.超材料表面金表面积较小，所结合的抗体量有限，限制了检测的灵敏度。
单克隆抗体具有高选择特异性，其可识别特异性抗原，并形成稳定的抗原抗体复合物。通过抗体的特异性捕获，可实现抗原的特异性检测。同时，通过抗体的捕获增加了检测的灵敏度。目前对抗原抗体反应的检测方法有酶联免疫(ELISA)、免疫荧光、放射免疫和化学发光等，其均需要利用酶、荧光素和放射元素进行标记；这样增加了检测过程中的操作步骤，使得检测更为复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可再生的太赫兹生物样品检测池及超灵敏定量检测方法，以解决抗原特异性检测过程中操作步骤多、需要特殊标记、检测复杂的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种可再生的太赫兹生物样品检测池的制备，包括以下步骤：
包括以下步骤：
(1)衬底基片清洗：取4英寸硅晶圆放入超声波清洗仪中清洗，取出后先用有机溶剂清洗再用去离子水漂洗干净，再用气体把硅片表面吹干并烘干得到基片；
(2)深硅刻蚀：在步骤(1)中烘干的硅晶圆上每1.5*1.5cm的区域正中刻制单个长、宽为7.2mm，深为220nm的槽道；
(3)镀膜：在槽道表面镀厚度为120nm的金膜；
(4)涂胶：将光刻胶均匀旋涂在金膜的表面并烘干，在暗室中自然冷却；
(5)曝光：使用曝光机在均匀涂的表面进行周期性结构单元曝光；单元结构为单开口谐振环，长宽为26μm，线宽6μm，开口间隙2μm；
(6)显影：选取显影液行显影；
(7)后烘：对显影后的基片进行烘焙，去除残留水分和显影液，提高光刻胶与衬底基片之间粘附力；
(8)湿法刻蚀：采用湿法刻蚀完成后，未被光刻胶保护的金膜被腐蚀掉，然后用去离子水冲洗，直至表面刻蚀混合液被清洗干净；
(9)切割，将4英寸硅晶圆切割为大小1.5*1.5cm的芯片得到检测池。
进一步，步骤(1)中的有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇中的一种。
进一步，步骤(1)中所用的气体为高压氮气。
一种可再生的太赫兹生物样品检测池的应用，可用于特异性检测不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液。
进一步，检测包括以下步骤：
(1)在检测池内光刻出周期性SRRs超材料结构。单元结构为单开口谐振环，其长宽为26μm，线宽6μm，开口间隙2μm；
(2)将构建的可再生样品池THz-TDS检测，记录其谐振频率f、谐振峰半高宽；
(3)在反应池中加入1ml 0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液，置于70℃恒温器中避光反应3h，冷却至室温；
(4)去离子水充分的冲洗2-3次；加入1ml 1％戊二醛溶液，室温下避光放置30min；
(5)去离子水充分的冲洗2-3次；加入1ml 0.1％DPBS溶液0.001g DDM溶于1ml10mmol/L PH 7.4缓冲液中浸泡5min；
(6)去离子水充分的冲洗2-3次；取500μl抗体E06、anti-Ox-LDL溶液浸泡(保鲜膜包裹，防止挥发，置于4℃的冰箱中冷藏过夜待用；
(7)将结合了抗体的膜条取出，氮气吹干，置于样品池上，THz-TDS检测，谐振峰发生频移，记录其谐振频率f、谐振峰半高宽FWHM；计算Δf谐振率变化量；
(8)在反应池中加入50μl氧化低密度脂蛋白溶液，孵育4h，使抗原抗体充分结合；
(9)取出待测膜条，氮气吹干；置于太赫兹检测样品池上，THz-TDS检测记录其谐振频率(f)、谐振峰半高宽FWHM；计算Δf谐振率变化量；
(10)弃去检测膜条，检测样品池可继续用于下一样本的测量。
进一步，依次重复步骤(7)-(9)，加入不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液，能检测不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液。
本技术方案的工作原理及有益效果在于：
(1)太赫兹超材料是一种灵敏的可用于太赫兹传感领域的器件，但是其清洗与重复利用问题一定程度上限制了其使用，故发明拟开发一种可再生的太赫兹超材料样本池，用于太赫兹传感。
(2)太赫兹超材料生物传感器实现生物分子的特异性检测，需结合抗体的特异性捕获，但将抗体修饰在金/硅表面存在较大难度，且超材料表面金表面积较小，所结合的抗体量有限，修饰效率不高，限制了检测的灵敏度，限制了其检测效率；同时将抗体修饰在超材料表面，超材料只能使用一次，成本较高，不利于其普及应用；PDMS成本较低，且可通过多种化学方法进行修饰，便于其普及性应用。
(3)实现生物分子的特异性检测，需通过抗体的特异性捕获，目前通过抗体捕获检测的方法主要有酶联免疫(ELISA)、免疫荧光、放射免疫和化学发光等，其均需要利用酶、荧光素和放射元素进行标记；拟开发一种超灵敏、无标记的特异检测生物分子的方法。
(2)
附图说明
图1是本发明一种可再生的太赫兹生物样品检测池及超灵敏定量检测方法实施例的正视图；
图2是本发明检测样品池的俯视图；
图3是图2中单开口谐振环的俯视图；
图4是通用型样品池及一次性PDMS膜条组装侧视图示意图；
图5是中不含待测靶标的检测示意图；
图6是特异识别待测靶标的检测示意图；
图7是本发明检测样本池的实物图；
图8是单开口谐振环的扫描电镜图；
图9是pdms检测膜条的实物图；
图10是其太赫兹检测的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
结合图1-9所示，一种可再生的太赫兹生物样品检测池的制备，包括以下步骤：(1)衬底基片清洗：取硅片剪切，将裁剪好的硅片放入超声波清洗仪中清洗，取出后先用有机溶剂清洗再用去离子水漂洗干净，本实施例中有机溶剂可选用为乙醇、丙酮或甲醇，优选为乙醇，再用高纯氮气把硅片表面吹干；
(2)深硅刻蚀：在步骤(1)中烘干的硅晶圆上每1.5*1.5cm的区域正中刻制单个长、宽为7200μm，深为220nm的槽道；
(3)镀膜：在槽道表面镀厚度为120nm的金膜；
(4)涂胶：光刻胶(SU-8)均匀旋涂在金膜的表面并烘干，在暗室中自然冷却；
(5)曝光：使用曝光机在均匀涂的表面进行周期性结构单元曝光；结合图2和图3所示，单元结构为单开口谐振环，长宽为26μm(L＝26μm)，线宽6μm(W＝6μm)，开口间隙2μm(g＝2μm)；
(6)显影：选取显影液行显影；
(7)后烘：对显影后的基片进行烘焙，去除残留水分和显影液，提高光刻胶与衬底基片之间粘附力；
(8)湿法刻蚀：采用湿法刻蚀完成后，未被光刻胶保护的金膜被腐蚀掉，然后用去离子水冲洗，直至表面刻蚀混合液被清洗干净；
(9)切割，将4英寸硅晶圆切割为大小1.5*1.5cm的芯片得到检测池。
检测膜条的制备
在太赫兹高聚物膜条的表面通过聚乙烯亚胺－戊二醛交联法交联抗体。
检测
在反应池中加入待测样本，与反应膜条在室温下放置4h，使抗原抗体充分反应。取出检测膜条，置于可再生检测池上，THz-TDS检测。得到浓度随频移改变量变化的曲线，即可对不同浓度的生物样品进行定量。
检测池的应用：
结合图4、图5和图6所示，利用上述可再生样品池及特异性检测膜条检测氧化低密度脂蛋白。
可再生检测样品池的构建
深硅刻蚀出检测池，结构参数如下：长7.2mm、宽7.2mm、高220nm；1.2在检测池内光刻出亚波长周期性SRRs超材料结构。单元结构为单开口谐振环，其长宽为26μm(L＝26μm)，线宽6μm(W＝6μm)，开口间隙2μm(g＝2μm)；将构建的可再生样品池THz-TDS检测，记录其谐振频率(f)、谐振峰半高宽(FWHM)；
抗体的筛选
E06来源于免疫缺失的ApoE基因敲除小鼠的单克隆抗体。识别Ox-PC，识别表位为磷酸卵磷脂(PhoCho)——卵磷脂中的亲水部分。
E06抗体固定到PDMS表面；
在反应池中加入1ml 0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液，置于70℃恒温器中避光反应3h，冷却至室温。
去离子水充分的冲洗2-3次；加入1ml质量浓度为1％戊二醛溶液(l g的溶质溶于99ml的水中，即量浓度为1％)，室温下避光放置30min；
去离子水充分的冲洗2-3次；加入1ml质量浓度为0.1％的DPBS溶液(0.001g的DDM溶于1ml的10mmol/L、PH7.4的缓冲液)中浸泡5min。
去离子水充分的冲洗2-3次；取500μl抗体(anti-Ox-LDL)溶液浸泡(保鲜膜包裹，防止挥发)，置于4℃冰箱中冷藏过夜，待用。
将结合了抗体的膜条取出，氮气吹干，置于样品池上，THz-TDS检测，谐振峰发生频移，记录其谐振频率(f)、谐振峰半高宽(FWHM)；计算Δf(谐振率变化量)；加入50μl氧化低密度脂蛋白溶液，孵育4h，使抗原抗体充分结合；取出待测膜条，氮气吹干；置于太赫兹检测样品池上，THz-TDS检测记录其谐振频率(f)、谐振峰半高宽(FWHM)；计算Δf(谐振率变化量)。弃去检测膜条，检测样品池可继续用于下一样本的测量；重复上述步骤，加入不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液，Δf(谐振率变化量)不同，可检测不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。