阅读说明：本技术 一种功能化磁珠、制备方法及特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法 (Functionalized magnetic bead, preparation method and method for specifically capturing colorectal cancer circulating tumor cells ) 是由 王振新 杨致亭 田荣荣 马立娜 杨锋斌 范文翠 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种功能化磁珠、制备方法及特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法,属于化学生物学技术领域。该功能化磁珠是利用酰胺化反应,在羧基化Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>磁珠MBs表面修饰可特异性结合α-1,2-岩藻糖的凝集素UEA-I而得到的。本发明还提供一种功能化磁珠的制备方法。本发明还提供功能化磁珠用于特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法。本发明提供的功能化磁珠在外加磁场的作用下,实现了特定循环肿瘤细胞的分离,其在完全培养基及血液中捕获循环肿瘤细胞的效率分别达到94％和89％,被捕获的细胞可正常的贴壁、增殖及传代,其生长速率与正常培养细胞的生长速率之间没有明显的区别,便于后期对被捕获的细胞进行深入研究。(The invention provides a functionalized magnetic bead, a preparation method and a method for specifically capturing colorectal cancer circulating tumor cells, belonging to the technical field of chemical biology. The functionalized magnetic beads are prepared by carboxylating Fe through amidation reaction 3 O 4 The magnetic bead MBs are surface-modified by agglutinin UEA-I which can specifically bind alpha-1, 2-fucose. The invention also provides a preparation method of the functionalized magnetic bead. The invention also provides a method for specifically capturing the colorectal cancer circulating tumor cells by using the functionalized magnetic beads. The invention provides a functionalized magnetThe separation of specific circulating tumor cells is realized by the beads under the action of an external magnetic field, the efficiency of capturing the circulating tumor cells in a complete culture medium and blood respectively reaches 94 percent and 89 percent, the captured cells can be attached to the wall, proliferated and passaged normally, the growth rate of the captured cells is not obviously different from that of the normally cultured cells, and the captured cells can be deeply researched in the later period.)

一种功能化磁珠、制备方法及特异性捕获结直肠癌循环肿瘤 细胞的方法

技术领域

本发明属于化学生物学技术领域，具体涉及一种功能化磁珠、制备方法及特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指在肿瘤形成或进展过程中从原发灶或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，具有发展为转移病变的潜力。因此，CTCs的捕获和检测在重大疾病的早期诊断、治疗效果评估等方面具有重要的医学意义。但由于高异质性和稀有性(1毫升外周血10⁶-10⁹个血液细胞中有几个到数百个CTCs)，高效、高纯度地富集CTCs仍是一个巨大的挑战。

目前，已开发出许多基于CTCs物理特性(尺寸、密度、变形性和粘附偏好)或生物特性(抗体抗原、适体、肽和E-选择素)的技术和设备用于高效富集和检测CTCs。其中，基于抗体(如上皮细胞粘附分子(EPCAM)、人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)等)的免疫磁珠分离富集法因具有易于磁性操作、与靶细胞高效特异性结合、快速磁响应、方便后续的鉴定和分析(如免疫细胞化学(ICC)和拉曼成像)等优点，已成为从复杂外周血中分离CTCs最常用的方法。但其仍受到不可大规模生产、价格昂贵等限制，且某些肿瘤(如黑色素瘤和肉瘤)抗体的表达较低或几乎无表达。因此，基于其他靶向分子(如DNA、适配体、识别肽或凝集素等)的CTCs富集方法也逐步应用于CTCs的富集分离中。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种功能化磁珠、制备方法及特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，该功能化磁珠能灵敏、特异性地识别和分离循环肿瘤细胞，且成本低。

本发明首先提供一种功能化磁珠，简写为MB-UEA-I，该功能化磁珠是利用酰胺化反应，在羧基化Fe₃O₄磁珠MBs表面修饰可特异性结合α-1,2-岩藻糖的凝集素UEA-I而得到的。

本发明还提供一种功能化磁珠的制备方法，包括：

1)、将MBs清洗，然后加入EDC和NHS进行活化，得到活化后的MBs；

2)、对活化后的MBs进行磁分选去除上清，并用HEPES缓冲液清洗，然后加入含UEA-I的HEPES缓冲液，在室温下进行反应；

3)、反应结束后，磁分选去除上清，并用HEPES缓冲液清洗，去除未反应的UEA-I，将修饰后的MB-UEA-I悬浮在HEPES缓冲液中，保存备用。

优选的是，所述的MBs的质量mg:EDC的体积μL:NHS的体积μL为0.5～1:500～800:500～800。

优选的是，所述的EDC和NHS溶液的浓度均为100mmol/L。

优选的是，所述的步骤1)活化温度为室温，活化时间为30～120min。

优选的是，所述的步骤2)反应时间为1～3h。

优选的是，所述MBs和UEA-I的HEPES缓冲液中UEA-I的质量比为0.5～1:0.025。

本发明提供了上述功能化磁珠用于特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，是非疾病诊断和非治疗目的，包括以下步骤：

步骤一、将SW480细胞加入健康人的血液中制备模拟结直肠癌病人血液样本，将功能化磁珠MB-UEA-I加入待测血液样本中，混匀后放在摇床上孵育；

步骤二、通过磁分选去除上清，得到MB-UEA-I捕获的细胞；

步骤三、利用ICC染色法对捕获的细胞进行染色，并通过共聚焦荧光成像准确识别捕获到的肿瘤细胞。

优选的是，所述的步骤一的磁珠用量为每1mL待测血液样本中加入0.05～0.1mg功能化磁珠MB-UEA-I。

优选的是，所述的步骤一的孵育温度为25～37℃，孵育时间为30～60min。

本发明的原理

本发明的功能化磁珠是利用酰胺化反应，将凝集素UEA-I修饰在羧基化的MBs表面而获得。通过凝集素UEA-I与结直肠癌SW480细胞表面α-1,2-岩藻糖的特异性结合，功能化磁珠MB-UEA-I可对该种肿瘤细胞进行高效、特异性地捕获，并通过磁分选分离出被捕获的细胞。同时，利用ICC染色法结合共聚焦荧光成像，可对被捕获到的肿瘤细胞进行准确鉴定。

本发明的有益效果

(1)、用于循环肿瘤细胞捕获的凝集素修饰的功能化磁珠，制备方法简单，所需时间短，且靶向分子凝集素比于其他抗体相对廉价易得，可解决现有捕获方法成本造价较高的问题。

(2)、细胞识别具有特异性，UEA-I是利用凝集素微阵列芯片通过高通量分析筛选得到的一种可特异性结合结直肠癌SW480细胞表面α-1,2-岩藻糖的凝集素，其能够高效、特异性的识别肿瘤细胞，即该捕获CTCs的方法具有较好的特异性。

(3)、捕获效率高，该功能化磁珠在完全培养基及血液中捕获循环肿瘤细胞的效率分别达到94％、89％。。

(4)、对被捕获细胞影响小，该功能化磁珠对被捕获细胞的活性几乎没有影响，且随着细胞表面糖代谢，功能化磁珠可逐渐脱离细胞表面，无需经过特殊处理进行释放，被捕获的细胞可正常的贴壁、增殖及传代，其生长速率与正常培养细胞的生长速率之间没有明显的区别，便于后期对被捕获的细胞进行深入研究。

附图说明

图1为本发明实施例1中MBs修饰UEA-I前后的SEM表征图。

图2为本发明实施例2中MB-UEA-I捕获肿瘤细胞的特异性结果柱状图。

图3为本发明实施例3、4中MB-UEA-I在完全培养基及血液中的捕获效率曲线图；

图4为本发明实施例5中被捕获细胞的荧光图像；

图5为本发明实施例5中正常培养的细胞与被捕获细胞的增殖速率对比曲线图；

图6为本发明实施例5中被捕获细胞的贴壁、增殖及传代后的荧光图像。

图7为本发明实施例6中模拟结直肠癌病人血液样本中CTCs(SW480细胞)的捕获结果图。

具体实施方式

本发明首先提供一种功能化磁珠，简写为MB-UEA-I，该功能化磁珠是利用酰胺化反应，在羧基化Fe₃O₄磁珠(magnetic beads,MBs)表面修饰可特异性结合α-1,2-岩藻糖的凝集素UEA-I而得到的。

按照本发明，所述的凝集素UEA-I是利用凝集素微阵列芯片通过高通量分析筛选得到的一种可特异性结合结直肠癌SW480细胞表面α-1,2-岩藻糖的凝集素，其能够高效、特异性的识别肿瘤细胞，具有较好的特异性。

本发明还提供一种功能化磁珠的制备方法，包括：

1)、将MBs清洗，然后加入EDC和NHS进行活化，得到活化后的MBs；

2)、对活化后的MBs进行磁分选去除上清，并用HEPES缓冲液清洗，然后加入含UEA-I的HEPES缓冲液，在室温下进行反应；

3)、反应结束后，磁分选去除上清，并用HEPES缓冲液清洗，去除未反应的UEA-I，将修饰后的MB-UEA-I悬浮在HEPES缓冲液中，保存备用。

按照本发明，先将MBs加入到离心管中，用MES缓冲液清洗3～5次后，加入EDC和NHS在进行活化；所述的活化温度优选为室温，活化时间优选为30～120min，所述的MES缓冲液的浓度优选为100mmol/L，pH值为5.5～6.7，所述的MBs的质量mg:EDC的体积μL:NHS的体积μL为0.5～1:500～800:500～800；EDC和NHS溶液的浓度优选均为100mmol/L；

按照本发明，将活化后的MBs进行磁分选去除上清，并利用HEPES缓冲液清洗3～5次，所述的HEPES缓冲液的浓度优选为10mmol/L，pH值为7.2～8.5，然后加入含UEA-I的HEPES缓冲液，在室温下进行反应，所述的反应时间优选为1～3h；所述MBs磁珠和UEA-I的HEPES缓冲液中UEA-I的质量比优选为0.5～1:0.025。

按照本发明，反应结束后，磁分选去除上清，并用HEPES缓冲液清洗3～5次，去除未反应的凝集素，将修饰后的MB-UEA-I悬浮在HEPES缓冲液中，2～8℃保存备用。

本发明提供了上述功能化磁珠用于特异性捕获结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：

步骤一、将SW480细胞加入健康人的血液中制备模拟结直肠癌病人血液样本，将功能化磁珠MB-UEA-I加入待测血液样本中，混匀后放在摇床上孵育；所述的磁珠用量为每1mL待测血液样本中优选加入0.05～0.1mg功能化磁珠MB-UEA-I；所述的孵育温度优选为25～37℃，孵育时间优选为30～60min。

步骤二、通过磁分选去除上清，得到MB-UEA-I捕获的细胞；

步骤三、利用ICC染色法对被捕获的细胞进行染色，并通过共聚焦荧光成像准确识别捕获到的肿瘤细胞。

本发明步骤三中利用ICC染色法对被捕获的细胞进行染色，具体包括以下步骤：

1)、将磁分选获得的细胞用4％多聚甲醛固定10～30min；

2)、磁分选去除上清后，加入0.1％Triton X-100透膜10～30min；

3)、磁分选去除上清后，加入1％BSA室温封闭30～60min；所述的BSA溶解在0.05％PBS-Tween中。

4)、磁分选去除上清并用0.05％PBS-Tween，PBS各清洗3～5次；

5)、加入AF568-CK19和AF488-CD45混合液，避光放在4℃冰箱孵育；所述的AF568-CK19和AF488-CD45的浓度优选为10μg/mL，加入的体积为100～200μL，孵育时间为2～8h；

6)、磁分选去除上清，并用PBS清洗3～5次；

7)、加入Hoechst 33342，避光放在4℃冰箱中染色；所述的Hoechst 33342的浓度为4μg/mL，加入的体积为100～200μL，染色时间为10～30min。

8)、磁分选去除上清，并用PBS清洗3～5次。

下面通过具体实施例结合附图对本发明做进一步详细的描述：

实施例1功能化磁珠MB-UEA-I的制备

取100μL MBs(5mg/mL)至2mL离心管中，加入1mL的MES缓冲液清洗三次,每次通过磁分选去除上清，然后加入100mmol/L EDC和100mmol/L NHS各500μL，室温下放在摇床震荡活化1h(160rpm)。

活化结束后，利用HEPES缓冲液清洗三次，再加入1mL HEPES(含0.025mg UEA-I)，室温下放在摇床上震荡反应3h(160rpm)。

偶联反应结束后，用HEPES缓冲液清洗三次，去除未反应的凝集素，最后加入1mLHEPES缓冲液悬浮MB-UEA-I，放在4℃保存备用。

图1为本发明实施例1中MBs修饰UEA-I前后的SEM表征图。其中(a)为MBs的SEM表征图，(b)为MB-UEA-I的SEM表征图。图1说明MBs修饰前后其形貌没有明显的区别，获得的功能化磁珠依然具有较好的分散性。

实施例2 MB-UEA-I高效、特异性地捕获肿瘤细胞

实验组：将约100个SW480细胞加入到1mL完全培养基中，再加入0.05mg实施例1制备得到的功能化磁珠MB-UEA-I。

对照组：将约100个HCT116细胞和NCM460细胞分别加入到1mL完全培养基中，再加入0.05mg实施例1制备得到的功能化磁珠MB-UEA-I；将约100个SW480细胞加入到1mL完全培养基中，再加入0.05mg未修饰的MBs。

设置以上四组实验，每组三个平行实验。将细胞与MB-UEA-I或MBs混合后，放在37℃的摇床上孵育45min(150rpm)。反应结束后，磁分选获得被捕获的细胞，同时将上清加入到48孔板中，静置20min后，利用倒置显微镜对上清液中未被捕获到的细胞进行计数。此外，在制备细胞悬液时，将等量体积的细胞加入到48孔板中，静置后计数，计算加入反应中的实际细胞数量，从而计算每组实验的捕获效率。

图2为本发明实施例2中MB-UEA-I捕获肿瘤细胞的特异性结果柱状图。图2说明功能化磁珠MB-UEA-I对细胞表面α-1,2-岩藻糖表达较强的SW480细胞具有较高的特异性捕获效率，而对细胞表面α-1,2-岩藻糖表达较弱的HCT116、NCM460细胞的捕获效率较低。

实施例3 MB-UEA-I捕获完全培养基中的SW480细胞

将0.05mg实施例1制备得到的功能化磁珠MB-UEA-I加入1mL含有不同SW480细胞数量(3～1000)的完全培养基中,混匀后放在37℃的摇床上孵育45min(150rpm)。反应结束后，磁分选获得被捕获的细胞。利用实施例2中相同的方法，计算出MB-UEA-I在完全培养基中的捕获效率。

实施例4MB-UEA-I捕获血液中的SW480细胞

用4μg/mL Hoechst 33342将SW480细胞预染10min后再进行消化，并加入到新鲜血液中，制备含不同SW480细胞数量的血液样本。将0.05mg实施例1制备得到的功能化磁珠MB-UEA-I加入1mL含有不同SW480细胞数量(3～1000)的血液中,混匀后放在37℃的摇床上孵育45min(150rpm)。反应结束后，磁分选获得被捕获的细胞。将被捕获的细胞加入到共聚焦小皿中，利用共聚焦显微镜对捕获到的SW480细胞进行计数，利用实施例2中相同的实验方法计算实际加入血液中的细胞数量，从而计算MB-UEA-I在血液中的捕获效率。

图3为本发明实施例3、4中MB-UEA-I在完全培养基及血液中的捕获效率曲线图，分别为94％、89％，说明MB-UEA-I具有较好的抗干扰能力，在完全培养基及血液中均具有较高的特异性捕获能力。

实施例5被捕获细胞的活性及增殖能力

取0.05mg实施例1中制备的MB-UEA-I加入到适当浓度的SW480细胞悬液(约含3万个细胞)中，在37℃的摇床上孵育45min(150rpm)。反应结束后，通过磁分选得到被捕获的细胞，并用PBS清洗三次。将AM/PI染色液加入到含有被捕获细胞的离心管中，放在培养箱中染色30min。将染色后的细胞移至48孔板内，静置20min后，用荧光显微镜进行成像。统计200个细胞，计算未被PI染红细胞的数目占总细胞数的百分比即为被捕获细胞的活率。

将捕获到的细胞重新分散于新鲜培养基中，并置于48孔板中培养。利用Hoechst33342(4μg/mL)和罗丹明B(10μg/mL)混合染色液在细胞培养不同时间后对细胞进行染色(30min)，并利用荧光显微镜对细胞进行荧光成像，以监测细胞的生长状况。此外，在细胞培养不同时间后统计同一区域细胞的数量，对比正常培养的细胞与被捕获细胞的增殖速率。

图4为本发明实施例5中被捕获细胞的荧光图像，其中(a)为正常培养细胞的荧光图像(b)为被捕获细胞的荧光图像，(c)为正常培养细胞与被捕获细胞的活率值。图4表明被捕获的细胞依然保持较高的活率，说明该功能化磁珠MB-UEA-I对细胞的活性影响较小。

图5为本发明实施例5中正常培养的细胞与被捕获细胞的增殖速率对比曲线图。图5说明被捕获的细胞能够保持较好的增殖能力，其增殖速率与正常培养细胞的增殖速率之间没有明显的区别。

图6为本发明实施例5中被捕获细胞的贴壁、增殖及传代后的荧光图像。图6说明被捕获的细胞能够进行正常的培养，可进行多次传代。

实施例6模拟结直肠癌病人血液样本中CTCs(SW480细胞)的捕获

采用肝素钠抗凝管收集正常人的血液样本，将极少量的SW480细胞加入到1mL全血中制备模拟结直肠癌病人血液样本。取0.05mg实施例1制备的MB-UEA-I加入到1mL模拟病人血液样本中，放在37℃摇床上孵育45min(150rpm)。磁分选去除多余的血细胞、血浆等，并用PBS清洗5次。之后利用ICC染色法结合共聚焦荧光成像准确识别被捕获到的肿瘤细胞。ICC染色方法的具体操作如下:

1)、将磁分选获得的细胞用4％多聚甲醛室温固定10min。

2)、磁分选去除上清后，加入0.1％Triton X-100透膜10min。

3)、磁分选去除上清后，加入1％BSA室温封闭1h。

4)、磁分选去除上清并用0.05％PBS-Tween，PBS各清洗3次。

5)、加入200μL 10μg/mL AF568-CK19和AF488-CD45，避光放在4℃冰箱孵育4h。

6)、磁分选去除上清，并用PBS清洗3次。

7)加入200μL 4μg/mL Hoechst 33342，避光放在4℃冰箱中染色10min。

8)磁分选去除上清，并用PBS清洗3次。

将染色处理好的细胞加入到共聚焦小皿中，静置10分钟后，利用共聚焦显微镜对捕获到的细胞进行成像。在荧光显微镜下观察CK-18(红色荧光信号)和Hoechst 33342(蓝色荧光信号)呈阳性，CD45(绿色荧光信号)呈阴性表达的细胞为肿瘤细胞(SW480)；CK-18呈阴性，CD-45和Hoechst 33342呈阳性表达的细胞为白细胞。

图7为本发明实施例6中模拟结直肠癌病人血液样本中CTCs(SW480细胞)的捕获结果图。图7说明功能化磁珠MB-UEA-I能够较好的捕获CTCs(SW480细胞)，通过ICC染色结合共聚焦荧光成像，可准确识别出肿瘤细胞。