阅读说明：本技术 水产品中氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法 (Time-resolved fluorescence immunochromatographic assay quantitative detection method for chloramphenicol in aquatic products ) 是由 李云 马立才 赵义良 刘河冰 刘薇 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了水产品中氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法。本发明提供了检测试剂卡,包括底板和放置在其上的样品垫、含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫、含有氯霉素检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜,和吸水垫。本发明采用时间分辨荧光免疫分析技术建立了一种水产品中氯霉素残留量的快速检测方法,方法的检测灵敏度(定量限0.1μg/kg)优于传统的胶体金荧光免疫层析技术,达到了酶联免疫吸附方法和仪器方法的灵敏度水平。(The invention discloses a method for quantitatively detecting chloramphenicol in an aquatic product by time-resolved fluorescence immunochromatography. The invention provides a detection reagent card, which comprises a bottom plate, a sample pad, a release pad, a nitrocellulose membrane and a water absorption pad, wherein the sample pad is arranged on the bottom plate, the release pad contains an europium microsphere labeled anti-chloramphenicol antibody, the nitrocellulose membrane contains a chloramphenicol detection line T and a quality control line C, and the water absorption pad is arranged on the nitrocellulose membrane. The invention adopts the time-resolved fluorescence immunoassay technology to establish a rapid detection method for the residual quantity of chloramphenicol in aquatic products, the detection sensitivity (the limit of quantitation is 0.1 mug/kg) of the method is superior to the traditional colloidal gold fluorescence immunochromatography technology, and the sensitivity level of an enzyme-linked immunosorbent assay method and an instrument method is reached.)

水产品中氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种水产品中氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法。

背景技术

氯霉素(Chloroamphenicol，CAP)属于酰胺醇类抗菌药物，最早是从委内瑞拉链丝菌的培养液中分离得到的。氯霉素的形态通常为针状结晶粉末或长片状结晶粉末，白色，易溶于丙酮和醇类，微溶于水。氯霉素可通过作用于细菌70S核糖体的50S亚基上，破坏酰胺转移酶的活性，阻挠蛋白质的合成，从而发挥抑菌作用；它是一种广谱抗菌药物，对多种革兰氏阴性、***、衣原体和立克次氏体等均可产生良好的抑制作用。因此，氯霉素在食品动物(尤其是水生动物)细菌性疾病防治工作中发挥了较大的应用。该药在动物养殖过程中的使用不可避免地会伴随着动物性食品中药物残留的风险，从而危害消费者健康。氯霉素可抑制哺乳动物骨髓细胞中线粒体蛋白的合成，而引起人类非剂量依懒性再生障碍性贫血，以及溶血、紫癜等症状。为了保护消费者健康，世界上很多国家(如美国、欧盟和日本)已禁止在动物食品中使用氯霉素；我国农业部在2002年12月第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定氯霉素为禁用药物，在动物性食品中不得检出。

目前，水产品中氯霉素残留检测的主要方法有免疫分析法(包括免疫层析法和酶联免疫吸附法Elisa)和色谱方法，如气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)等。胶体金免疫层析技术作为一种传统快检技术，存在灵敏度相对较低，不能定量检测的缺陷，故而不能满足水产品中氯霉素痕量残留检测的需求。酶联免疫吸附法的灵敏度符合要求，但是相对于免疫层析检测方法来说，存在操作上相对复杂，检测时间长的缺陷。色谱方法一般需要昂贵的检测仪器，且存在前处理复杂，操作繁琐，检测时间长，检测成本高的问题，所以色谱方法也不适用于基层实验室大批量样本的检测。

时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是以镧系元素(包括Eu、Tb、Sm、Dy等)作为标记物，综合免疫反应的高特异性和镧系元素标记的高灵敏性相结合而建立的一种新型非放射性免疫检测技术。镧系元素具有Stokes位移大(>200nm)和荧光寿命长(1-2ms)的优点，可以在最大程度上避免和激发光和背景荧光信号的干扰，极大地提高了检测灵敏度。就灵敏度而言，时间分辨荧光免疫技术远高于Elisa方法和胶体金技术。鉴于其上述特点，TRFIA已广泛应用于人医和兽医临床诊断，以及食品安全检测等多个领域。

发明内容

为了检测水产品中氯霉素残留，本发明提供如下技术方案：

本发明一个目的是提供一种氯霉素时间分辨荧光免疫检测试剂卡。

本发明提供的检测试剂卡，包括底板和放置在其上的样品垫、含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫、含有氯霉素检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜，和吸水垫。

上述试剂卡中，所述抗氯霉素抗体为抗氯霉素单克隆抗体；

所述抗氯霉素单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为序列1；

所述抗氯霉素单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为序列2。

上述试剂卡中，含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫为将铕微球标记的抗氯霉素抗体溶液喷于释放垫上形成；

所述铕微球标记的抗氯霉素抗体溶液的包被浓度为0.02mg/mL。

上述试剂卡中，所述铕微球标记的抗氯霉素抗体溶液中，所述抗氯霉素抗体和铕微球的质量比为1：25；

或，所述铕微球为200nm羧基化铕微球。

上述试剂卡中，所述氯霉素检测线T由氯霉素抗原或其溶液形成；

或，所述氯霉素抗原溶液的包被浓度具体为0.3mg/ml；

或，所述质控线C由IgG抗体或IgG抗体溶液形成；

或，所述IgG抗体溶液的包被浓度具体为0.875mg/mL；

或，所述含有氯霉素检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜为将所述氯霉素抗原溶液包被在硝酸纤维素膜形成检测线T，且将所述IgG抗体溶液包被在硝酸纤维素膜形成质控线C，得到含有氯霉素检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜。

本发明另一个目的是提供一种制备上述第一个目的试剂卡的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：先制备含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫和制备含有氯霉素检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；再将样品垫、所述含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫、所述含有氯霉素检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到试剂卡；

所述含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫为将铕微球标记的抗氯霉素抗体溶液喷于释放垫上形成；

所述铕微球标记的抗氯霉素抗体溶液的浓度为0.02mg/mL。

所述抗氯霉素抗体为抗氯霉素单克隆抗体；

所述抗氯霉素单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为序列1；

所述抗氯霉素单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列为序列2；

所述氯霉素检测线T由氯霉素抗原或其溶液形成；

或，所述氯霉素抗原溶液的包被浓度具体为0.3mg/ml；

所述质控线C由IgG抗体或IgG抗体溶液形成；

或，所述IgG抗体溶液的浓度具体为0.875mg/mL；

所述含有氯霉素检测线T以及质控线C的硝酸纤维素膜为将所述氯霉素抗原溶液包被在硝酸纤维素膜形成检测线T，且将所述IgG抗体溶液包被在硝酸纤维素膜形成质控线C，得到含有氯霉素检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜。

上述第一个目的中的所述试剂卡在制备检测或辅助检测氯霉素产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述第一个目的中的所述试剂卡在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有氯霉素产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述第一个目的中的所述试剂卡在制备检测或辅助检测待测样品中氯霉素含量产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述第一个目的中的所述试剂卡在检测或辅助检测氯霉素中的应用也是本发明保护的范围；

或上述第一个目的中的所述试剂卡在检测或辅助检测待测样品中是否含有氯霉素中的应用也是本发明保护的范围；

或上述第一个目的中的所述试剂卡在检测或辅助检测待测样品中氯霉素含量中的应用也是本发明保护的范围；

或上述第一个目的中的所述试剂卡中的铕微球标记的抗氯霉素抗体在检测或辅助检测待测样品中是否含有氯霉素或待测样品中氯霉素含量中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还有一个目的是提供如下方法：

本发明提供的一种检测或辅助检测待测样品中是否含有氯霉素的方法，包括如下步骤：有机溶剂提取待测样品,收集提取液；再将所述提取液加入上述试剂卡的样品垫上，反应，再用荧光免疫定量分析仪检测反应的产物；

所述有机溶剂包括乙酸乙酯和正己烷；

若所述试剂卡的检测线T荧光信号值小于等于质控线C荧光信号值，则待测样本中含有或候选含有氯霉素；

若所述试剂卡的检测线T荧光信号值大于质控线C荧光信号值，则待测样本中不含有或候选不含有氯霉素。

或，本发明提供了一种检测或辅助检测待测样品中氯霉素含量的方法，包括如下步骤：

1)制备标准曲线；

取与待测样品同样来源且氯霉素含量小于0.1μg/kg的样本，有机溶剂提取所述样本,收集提取液；所述有机溶剂包括乙酸乙酯和正己烷；

再向所述提取液中加入不同浓度的氯霉素,得到不同浓度的标准品溶液；

再将所述不同浓度的标准品溶液加入上述试剂卡的样品垫上，反应，再用荧光免疫定量分析仪检测反应的产物，得到不同浓度的标准品溶液的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值；

以添加的氯霉素不同浓度为X轴，不同浓度对应的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值为Y轴，作标准曲线；

2)有机溶剂提取待测样本，收集待测样本提取液；所述有机溶剂包括乙酸乙酯和正己烷；

再将所述待测样本提取液加入上述试剂卡的样品垫上，反应，再用荧光免疫定量分析仪检测反应的产物，得到待测样本的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值；

将所述待测样本的检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值代入所述1)得到的标准曲线中，得到待测样本中氯霉素含量。

上述方法中，所述有机溶剂提取样本包括如下步骤：均质样本的可食用肌肉组织，再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，干燥后再加入正己烷，弃去上层正己烷及中间层杂质，收集下层溶液为样本提取液。

上述方法中，反应为40℃反应5min。

上述中，所述待测样本为食品动物或该食品动物组织样本；

或，所述食品动物具体为水产品动物；所述食品动物组织样本具体为水产品动物肌肉；

或，所述水产品动物具体为鱼、虾或蟹；所述鱼、虾或蟹组织样本具体为鱼肌肉、虾肌肉或蟹肌肉。

本发明拟利用铕微球作为抗体标记物建立一种简单、快速、高灵敏的鱼、虾和蟹中氯霉素残留的荧光定量免疫层析检测方法，并对所建立方法的灵敏度，准确性和精密度的指标进行评价，以期提供一种适用于水产品中氯霉素痕量残留的快速检测方法，保障水产品的质量安全和消费者健康。

为了能够更加简单、高效地对水产品中氯霉素残留进行检测，本发明建立了一种水产品氯霉素时间分辨荧光免疫层定量检测方法。本发明使用镧系元素铕(365/610nm,λex/λem)的羧基微球作为抗体标记物建立免疫层析方法。铕元素具有较大的Stokes位移(>200nm)，因此检测过程中激发的信号不会对发射光的荧光信号造成干扰；另外，镧系元素的荧光寿命相对比较长，可达1-2ms，故而可待其它荧光信号消失之后再行检测，以达到降到背景信号干扰的目的。上述两个方面的优势极大地提高了时间分辨荧光免疫分析方法的灵敏度。

同传统的胶体金免疫层析方法相比，本发明所建立时间分辨荧光免疫层析方法具有更高的灵敏度，且可以对水产品中氯霉素进行定量检测，定量检测限为0.1μg/kg，显著地低于胶体金的定性检测限(0.5μg/kg)。

本发明采用时间分辨荧光免疫分析技术建立了一种水产品中氯霉素残留量的快速检测方法，方法的检测灵敏度(定量限0.1μg/kg)优于传统的胶体金荧光免疫层析技术，达到了酶联免疫吸附方法和仪器方法的灵敏度水平；该方法对水产品中氯霉素的添加回收率(73.5％-114.2％)和变异系数3.9％-11.5％均能满足检测要求，与国标仪器检测方法的符合率较高。因此，本发明建立的时间分辨荧光免疫层析方法在水产品氯霉素检测工作具有较高应用价值和应用前景。

附图说明

图1为时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡结构示意图。

图2为TRFIA与HPLC检测结果线性相关图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中部分材料如下:

微量移液器(德国Eppendorf)、天子天平(天津德安特传感技术有限公司)、冷冻离心机(德国Thermo Fisher Scientific)、超声波清洗仪KQ-100E(昆山市超声仪器有限公司)、液相色谱-串联质朴仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)、样品粉碎机(九阳JYL-C090)；检测卡恒温孵育器(WH-400)和时间分辨荧光免疫定量分析仪(FQ-S2，365/610nm)由维德维康生物技术有限公司研制。

甲醇、乙腈、磷酸氢二钾、盐酸、氢氧化钠、吐温20、乙酸乙酯和正己烷等购自国药集团化学试剂有限公司；牛血清蛋白(BSA)购自美国Amresco公司；200nm羧基化铕微球(365/610nm,λ_ex/λ_em)购自美国Creative Diagnostics公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国Millipore公司；样品垫、吸收垫、PVC底板均购自上海良信科技有限公司。

氯霉素标准品购自美国Sigma公司，标准品溶液配制：准确称取1.0mg氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成100mg/kg的标准品溶液，于-20℃保存，备用。

羊抗鼠二抗由北京维德维康生物技术有限公司获得。

鱼、虾、蟹水产品购自北京市海淀区、昌平区的超市和农贸市场。

实施例1、氯霉素半抗原、人工抗原及单克隆抗体制备

1、氯霉素半抗原的制备

氯霉素半抗原的制备方法，具体操作步骤依次包括：

①取氯霉素644mg溶于10mL 1M盐酸，加入锌粉300mg，于80℃水浴中反应15min；

②再次加入锌粉300mg，继续反应15min；

③将反应后的溶液过滤，调整滤液pH至8.5，用10mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，真空干燥；

④将得到的固体产物溶于10mL二甲基甲酰胺(DMF)，加氢氧化钠150mg，4-溴丁酸501mg，于80℃水浴中搅拌反应3h；

⑤冷却至室温，加蒸馏水50mL，调整pH至5.0，用50mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，真空干燥，即可得到氯霉素半抗原。

2、氯霉素人工抗原的制备

氯霉素人工抗原的制备方法，具体操作步骤包括：

①称取上述1制备的氯霉素半抗原8.5mg溶于2mL DMF，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)4.3mg，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)5.2mg，室温搅拌反应2h；

②称取BSA50mg，溶于5mL 0.1M碳酸氢钠缓冲液；

③将氯霉素半抗原反应液逐滴加入到BSA溶液中，室温搅拌反应过夜；

④用PBS在4℃条件透析72h，期间换透析液6次；

⑤将透析液在无菌条件下用0.22μm孔径的滤膜过滤，-20℃保存。

3、氯霉素单克隆抗体的制备

①取步骤2制备的免疫原(CAP-BSA)溶液，按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6-8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

②按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

③细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被化学发光微孔板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的氯霉素等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的化学发光微孔板中。同时用PBS取代氯霉素作对照，其余步骤同上。若经氯霉素阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

④将2-3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8-10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞1-2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，纯化得到氯霉素单克隆抗体。

测序结果，氯霉素单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如序列表的序列1所示，氯霉素单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如序列表的序列2所示。

实施例2、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡的制备及检测方法的建立

一、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡的的制备

1、羧基化铕微球的抗体标记

本发明用的200nm羧基化时间分辨，抗体标记方法的基础之上，进行了优化。具体标记方法如下：

①50μL羧基化铕微球(200nm羧基化铕微球(365/610nm,λ_ex/λ_em)；浓度：1％，质量kg/体积L)中加入450μL活化缓冲液(0.05mol/L MES，pH 5.0)，超声5min；②然后，向①处理后的溶液中依次加入EDC和NHS使其终浓度为分别为0.1mM和0.2mM，室温振荡反应30min，15000g离心10min，弃去上清液；③将②得到的沉淀用500μL偶联缓冲液(0.04mol/L PB，pH8.0)复溶，超声5min，加入10μL 2mg/mL氯霉素单克隆抗体(单抗与微球的质量比1:25)，室温振荡反应2h，15000g离心5min；④向③得到的沉淀中加入500μL封闭缓冲液(0.01mol/LPB，2％BSA，pH 8.0)，4℃振荡反应过夜；⑤将④得到的反应液以15000g离心5min，弃去上清，加入1mL的Tris-HCl(1％BSA，0.5％Tween-20，0.02％Proclin-300，pH 7.0)复溶沉淀，超声5min，4℃避光保存备用，得到羧基化铕微球标记的氯霉素单抗(浓度为0.02mg/mL)。

2、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡的的组装

用划膜仪将实施例1步骤2得到氯霉素抗原，1.8mg/mL，1:6稀释)和羊抗鼠IgG(17.5mg/mL，1:20稀释)包被于NC膜上分别作为检测线(T线，0.7μL/cm，氯霉素抗原包被浓度为0.3mg/mL)和质控线(C线，0.7μL/cm，羊抗鼠IgG包被浓度为0.875mg/mL)，置于37℃烘箱中过夜干燥，得到含有氯霉素检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜。

将上述1制备的羧基化铕微球标记的氯霉素单抗喷于释放垫(上海金标生物科技有限公司,SB08，300*200mm)上，喷量为3.0μL/cm，置于37℃烘箱中干燥2h，得到含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫。

然后，将样品垫、含有铕微球标记的抗氯霉素抗体的释放垫、含有氯霉素检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜、吸水垫(上海金标生物科技有限公司,CH37，300*46mm)依次粘PVC底板上，并用切割机切成3.95mm宽度的试纸条，得到氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡，其结构如图1所示。

二、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡检测方法的建立

1、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡定性检测方法的建立

1)、样本提取

取鱼、虾、蟹可食用肌肉组织的样本，称取3g均质后的样品置于50mL离心管中，加入6mL的乙酸乙酯，涡动1min，放到摇床上(300rpm)振摇10min。取出后离心(4000g)10min，取4mL上层乙酸乙酯置于新的离心管中，50-60℃水浴条件下氮气吹干；向吹干的离心管中加入2mL正己烷，充分涡动10s，再加入1mL 10mM PB(2％BSA，0.5％Tween-20，1％蔗糖)，低速涡动1min后(4000g以上)，离心5min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50μL下层溶液作为样本待测液。

2)、检测步骤

取100μL样本待测液滴加至上述一制备的氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡(图1)的样本垫上，40℃检测卡恒温孵育器中准确反应5min后，取出并使用荧光免疫定量分析仪检测。

若检测线T荧光信号值小于等于质控线C荧光信号值，则待测样本中含有或候选含有氯霉素；

若检测线T荧光信号值大于质控线C荧光信号值，则待测样本中不含有或候选不含有氯霉素。

2、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡定量检测方法的建立

1)、标准曲线的绘制

取鱼、虾、蟹阴性样品(低于仪器方法检测限的，氯霉素含量<0.1μg/kg)各8份(每份不少于100g)，向其中添加氯霉素标准溶液使其终浓度分别为：0.00μg/kg，0.05μg/kg，0.10μg/kg，0.20μg/kg，0.40μg/kg，0.80μg/kg和1.60μg/kg充分混匀后，按照上述1中的方法进行样本提取，得到各个浓度样本的提取液。

将上述各个浓度样本的提取液按照上述1的2)进行检测。每个浓度重复检测5次，取平均值。以样本中添加的氯霉素终浓度为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T/C)为Y轴，用origin8.0(OriginLab Corp.,Northampton,MA,USA)做非线性拟合分析，形成四参数拟合曲线如下所示：

Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D

通过测试数据的拟合表明，所建立的氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法对应鱼、虾和蟹样本的标准曲线依次分别为：

Y＝6.0430/(1.1755+(X/0.1365)^1.6210)(R²＝0.9994)；

Y＝6.6051/(1.0654+(X/0.1335)^1.4208)(R²＝0.9970)；

Y＝5.6996/(1.3283+(X/0.1376)^1.4764)(R²＝0.9966)。

^表示次方，如(X/0.1365)^1.6210表示(X/0.1365)的1.6210次方。

其中，X为氯霉素浓度值，Y为T/C值。

2)、样本提取液

按照上述1中的1)制备样本待测液。

3)、检测

取100μL样本待测液滴加至上述一制备的氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡中的样本垫上，40℃检测卡恒温孵育器中准确反应5min后，取出并使用荧光免疫定量分析仪检测，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值。

将上述T线荧光信号值与C线荧光信号值的比值代入上述对应鱼、虾和蟹样本的标准曲线中，得到各个样本中氯霉素含量。

三、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡的最低检测限

取经仪器方法确证为鱼、虾、蟹空白样品(氯霉素含量<0.1μg/kg)各20份。

按照上述二中的2的方法检测上述20份鱼、虾、蟹空白样品中的氯霉素含量。分别计算20份鱼、虾、蟹空白样品中的氯霉素含量的平均值和标准差：平均值加上9倍标准差，即为定量限。

结果如表1所示，可以看出，依据20个样本的所测平均值和标准差计算得到该方法对鱼、虾和蟹样本中氯霉素的定量检测限依次分别为：0.084μg/kg，0.096μg/kg和0.091μg/kg。

表1 鱼、虾和蟹空白样品的氯霉素测定结果(μg/kg)

四、准确度和精密度

分别取鱼、虾、蟹均质后空白样品(氯霉素<0.1μg/kg)各20份，分别加入氯霉素溶液，并使其终浓度为0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.4μg/kg和0.8μg/kg，每个浓度梯度添加5个平行。

按照上述二的方法检测，最后，依据添加回收数据对所建立时间分辨荧光免疫层析定量分析方法的准确度和精密度进行分析。

结果如表2所示，对水产品中氯霉素的添加回收率为73.5％-114.2％，变异系数3.9％-11.5％，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

表2 准确性和精密度实验结果(μg/kg)

回收率＝(平均值/添加浓度)×100％

变异系数＝(标准差/平均值)×100％；

五、氯霉素时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡检测与HPLC检测结果比较

取鱼、虾、蟹均质后空白样品(氯霉素含量<0.1μg/kg)各4份，分别加入氯霉素溶液，并使其终浓度为0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.4μg/kg和0.8μg/kg。

将上述样本采用二的方法(TRFIA)检测，且同时采用GB/T 22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》中液相色谱-质谱方法(HPLC)进行检测，并对两种方法检测结果的一致性进行分析。

测试结果如表3和图2所示。上述两种方法检测结果的线性相关方程为：Y＝0.02+1.07X，相关系数R²＝0.973。由此可知，两种方法对鱼、虾和蟹中氯霉素检测结果一致性较高。

表3为氯霉素时间分辨荧光免疫层析与HPLC检测结果

SEQUENCE LISTING

<110>石家庄市畜产品质量监测中心 北京维德维康生物技术有限公司

<120> 水产品中氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 2

<211> 100

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

1 5 10 15

Ser Leu Gly Gln Ser Ala Thr Ile Ser Tyr Ser Pro Ala Asn Val Thr

20 25 30

Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Ile Asp Trp Asn Gln Gln Asn Pro Gly

35 40 45

His His Gln Thr Leu Ile Tyr Leu Ser His Tyr Leu Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Ser Thr Ser Ile

65 70 75 80

Leu Trp Ser Ser Ser Met Leu Gln Pro Ile Thr Val Ser Pro Leu Gly

85 90 95

Ser Leu His Val

100