阅读说明：本技术 一种肉桂蒸油剩余物的提取物分离制备方法及其用途 (Method for separating and preparing extract of cinnamon steaming oil residues and application of extract ) 是由 程贤 毕良武 曾维星 赵振东 陈玉湘 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及从肉桂蒸油剩余物中分离得到具备抗氧化活性的有效物质群的制备方法,以及该提取物在制备抗氧化药物、保健品、食品添加剂中的应用,具体为采用超声波辅助提取结合大孔吸附树脂富集的分离技术获得有效物质群,用于抗氧化及清除DPPH、OH自由基。(The invention relates to a preparation method for separating an effective substance group with antioxidant activity from cinnamon steaming oil residues and application of an extract in preparing antioxidant drugs, health care products and food additives, in particular to an effective substance group obtained by adopting a separation technology of ultrasonic-assisted extraction combined with macroporous adsorption resin enrichment and used for resisting oxidation and removing DPPH and OH free radicals.)

一种肉桂蒸油剩余物的提取物分离制备方法及其用途

技术领域

本发明公开了一种具有抗氧化活性的提取物，属于天然产物开发领域。

背景技术

氧化与人类健康密切相关，氧化作用是诱发组织器官损伤和病变的重要原因之一，人类的许多重大疾病如：动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等均与机体氧化损伤有关。抗氧化剂通过清除活性氧或阻止活性氧的生成实现对氧化过程的抑制作用，因此抗氧化剂在医药、食品等领域都起着重要作用。人工合成的抗氧化剂如：2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、叔丁基对羟基茴醚(BHA)、没食子酸丙酯(PG)等普遍具有一定的毒性和致畸作用。因此，对于成分明确、质量可控及安全高效的天然抗氧化物在研制抗氧化剂方面，具有诱人的市场前景和开发价值。

肉桂(Cinnamomum cassia Presl)是樟科樟属乔木，为我国南方亚热带地区的主要经济林品种之一，主要分布于我国的广东、广西等省区，此外，东南亚的越南/斯里兰卡/印尼、南亚的印度及非洲某些地区也有分布。肉桂作为一种常见的中药材，其主要活性成分为肉桂油。除此以外，精油提取后的剩余物中含有大量的多酚和黄酮，多酚类成分包括儿茶素、原儿茶酸、羟基查尔酮、原花青素等。黄酮类成分包括槲皮素、山柰酚、香豆素等。研究表明肉桂中的多酚和黄酮类成分具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用，是天然抗氧化剂的重要来源。然而，精油提取后的肉桂剩余物并没有得到充分的利用。中国专利文献CN103372056 A、CN102872195A、CN102274244 A公布了肉桂多酚提取物的制备方法及其用途，上述专利均以肉桂皮为原料，以肉桂多酚为目标产物。研究发现肉桂黄酮成分能有效抑制6-羟基多巴胺诱导的PC12细胞损伤(帕金森模型)，其作用机制在于肉桂黄酮中含有的多个酚羟基具有较高的还原性，因此能有效抑制细胞膜脂质氧化。为了同时开发肉桂中的多酚和黄酮类物质，并且充分利用精油提取后的肉桂剩余物，我们采用超声波辅助提取结合大孔树脂柱分离方法从肉桂蒸油剩余物中分离制备出了具备抗氧化活性的有效物质，迄今为止尚未发现有关该有效物质的分离制备及其抗氧化活性的文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何利用超声波辅助提取结合大孔树脂柱分离技术获得肉桂剩余物的提取物抗氧化部位以及研究其在制备抗氧化剂中的应用。

本发明要解决的技术问题还包括研究肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物可供工业化生产的制备方法及组成，因为在天然提取物中主要化学成分清楚明确，有利于工业化生产中进行质量控制，从根本上保证产品质量的稳定性。

为解决上述技术问题，现提供技术方法如下：

本发明所提供的肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物，按质量百分比计，含有总黄酮和总多酚之和大于21.10％

进一步，本发明所提供的抗氧化提取物，含有肉桂黄酮18.50％～53.93％、肉桂多酚2.60％～28.16％。

进一步，肉桂黄酮和肉桂多酚以紫外分光光度法测定。

本发明所提供的肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物，可单独或与其它提取物组配，用于制备天然抗氧化剂。

进一步，本发明所提供的肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物，可与药学上可接受的载体混合，用于制备有助于抗氧化的食品添加剂，用于制备有助于抗氧化的保健品、药物。

本发明肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物可以作为活性部位与其它天然提取物/有效部位或相关化学合成药物与药学上可接受的赋型剂或辅料一起用于制备药物组合物，该药物组合物可采用制剂学的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、缓释剂等。

本发明所提供的肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物，可以用精油提取后的肉桂皮剩余物作为原料。

进一步，肉桂蒸油剩余物可采用本领域常规的制备方法进行制备，如水蒸气蒸馏法等，优选按中国药典2005版附录中所述的用于提取挥发油的标准设备，取干燥的肉桂皮粉碎、过筛，转移到水蒸气蒸馏装置，加水进行水蒸馏3h～5h，同时使用乙酸乙酯进行液-液萃取，滤过，得到肉桂皮蒸油剩余物。

本发明所提供的肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物，还可以用包括精油提取后的肉桂枝剩余物和肉桂叶剩余物为原料或者肉桂枝蒸油剩余物、肉桂叶蒸油剩余物、渣肉桂皮蒸油剩余物的任意组合。

进一步，肉桂枝蒸油剩余物采用本领域常规的制备方法进行制备，优选中国药典2005版附录中所述的用于提取挥发油的标准设备，取干燥的肉桂枝粉碎、过筛，转移到水蒸气蒸馏装置，加水进行水蒸馏3h～5h，同时使用乙酸乙酯进行液-液萃取，滤过，得到肉桂枝蒸油剩余物。肉桂叶蒸油剩余物采用本领域常规的制备方法进行制备，优选中国药典2005版附录中所述的用于提取挥发油的标准设备，取干燥的肉桂叶粉碎、过筛，转移到水蒸气蒸馏装置，加水进行水蒸馏3h～5h，同时使用乙酸乙酯进行液-液萃取，滤过，得到肉桂叶蒸油剩余物。

本发明的肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物的一种制备方法，包括以下步骤：

(1)提取：取肉桂皮蒸油剩余物、肉桂枝蒸油剩余物或肉桂叶蒸油剩余物，或三者任意组合，加入提取溶剂，超声处理；

(2)过滤：将步骤(1)所得提取物进行过滤；

(3)合并：将步骤(2)所得滤液与分离肉桂渣所得水提液合并；

(4)浓缩：将步骤(3)所得提取液旋转蒸发浓缩；

(5)富集：将步骤(4)所得浓缩液，大孔树脂吸附、解析，收集解析液；

(6)浓缩：将步骤(5)所得解析旋转蒸发浓缩；

(7)干燥：将步骤(6)所得浓缩液真空干燥成粉末，即为产品。

进一步，步骤(1)中，料液质量比1∶20～1∶50(g/mL)，提取溶剂为醇溶剂，超声时问为20～30min，超声频率为25Hz～45Hz。步骤(2)中过滤可以为离心或微滤，微滤膜可以为有机微滤膜或者无机陶瓷、金属滤膜等，过滤后所得滤渣可以重复步骤(1)2～3次。步骤(4)中旋转蒸发温度为40℃～60℃，浓缩至原体积的1/20～1/50。步骤(5)中，将先将浓缩液放冷，大孔吸附树脂为AB-8或D101或同类型树脂，先水洗再用70％～80％的乙醇溶液解析。步骤(6)中旋转蒸发温度为40℃～60℃。步骤(7)中使用25℃～45℃真空干燥浓缩液即得产品。

本发明提供了一种以肉桂蒸油剩余物为原料的抗氧化提取物，实现了肉桂的综合利用，本发明的提取物具有较好的抗氧化活性，对OH自由基、DPPH自由基具有显著的清除作用。

本发明的原料廉价易得，制备方法为条件温和、高效、环保的超声提取和大孔树脂相结合的方式，该方法简单易行，具有很强的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明实例4中肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物总抗氧化能力。

图2为本发明实例4中肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物对DPPH自由基清除能力。

图3为本发明实例4中肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物对OH自由基清除能力。

图4为本发明实例5中富集前后肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物中黄酮和多酚的含量。

具体实施方式

实例1、本发明肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物的分离制备。

肉桂皮蒸油剩余物中具备抗氧化活性有效群的分离制备方法：

肉桂皮蒸油剩余物的制备：取干燥的肉桂皮粉碎、过筛，转移到水蒸气蒸馏装置中，按照料液比1∶50(g/mL)加入蒸馏水，于100℃恒温水浴加热3h，同时使用乙酸乙酯进行液液萃取，滤过，得到肉桂皮蒸油剩余物。

肉桂皮蒸油剩余物按照料液比1∶50(g/mL)加入乙醇，进行超声辅助提取30min，采用抽滤方式分离，将滤液与分离肉桂蒸油剩余物时所得水提液合并，减压浓缩至原有体积的1/50，AB-8大孔吸附树脂进行吸附，先水洗再用80％的乙醇溶液解析；将解析液旋转蒸发浓缩，真空干燥成粉末即为产品。产品中肉桂黄酮含量为44.48％，肉桂多酚含量为28.16％。

实例2、本发明肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物的分离制备。

肉桂枝蒸油剩余物中具备抗氧化活性有效群的分离制备方法：

肉桂枝蒸油剩余物的制备：取干燥的肉桂皮粉碎、过筛，转移到水蒸气蒸馏装置中，按照料液比1∶50(g/mL)加入蒸馏水，于100℃恒温水浴加热3h，同时使用乙酸乙酯进行液液萃取，滤过，得到肉桂枝蒸油剩余物。

肉桂枝蒸油剩余物按照料液比1∶50(g/mL)加入乙醇，进行超声辅助提取30min，采用抽滤方式分离，将滤液与分离肉桂蒸油剩余物时所得水提液合并，减压浓缩至原有体积的1/50，AB-8大孔吸附树脂进行吸附，先水洗再用80％的乙醇溶液解析；将解析液旋转蒸发浓缩，真空干燥成粉末即为产品。产品中肉桂黄酮含量为53.93％，肉桂多酚含量为37.56％。

实例3、本发明肉桂蒸油剩余物的抗氧化提取物的分离制备。

肉桂叶蒸油剩余物中具备抗氧化活性有效群的分离制备方法：

肉桂叶蒸油剩余物的制备：取干燥的肉桂皮粉碎、过筛，转移到水蒸气蒸馏装置中，按照料液比1∶50(g/mL)加入蒸馏水，于100℃恒温水浴加热3h，同时使用乙酸乙酯进行液液萃取，滤过，得到肉桂叶蒸油剩余物。

肉桂叶蒸油剩余物按照料液比1∶50(g/mL)加入乙醇，进行超声辅助提取30min，采用抽滤方式分离，将滤液与分离肉桂蒸油剩余物时所得水提液合并，减压浓缩至原有体积的1/50，上AB-8大孔吸附树脂进行吸附，先水洗再用80％的乙醇溶液解析；将解析液旋转蒸发浓缩，真空干燥成粉末即为产品。产品中肉桂黄酮含量为18.50％，肉桂多酚含量为26.03％。

实例4、本发明肉桂渣抗氧化提取物的抗氧化活性

本实例对案例1、案例2、案例3所制备的肉桂渣抗氧化提取物分别进行了总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力的测试，同时以抗坏血酸(Vc)作为对照。

一、试验方法

1.1总抗氧化能力

采用总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒测定样品和Vc总抗氧化能力，使用蒸馏水分别配制不同浓度的样品和Vc溶液，浓度分别为5、10、25、50、100、150、200、250、300μg/mL按照T-AOC测定试剂盒说明书进行操作，在520nm测定样品吸光度(A₁)和对照品吸光度(A₂)，根据公式计算总抗氧化能力(η_总)。

计算公式：

N：反应体系稀释倍数(反应液总量、取样量)；n：样品测试前稀释倍数

1.2 DPPH自由基清除能力

取不同浓度的样品和Vc溶液0.5mL，加入0.5mL DPPH乙醇溶液，混匀室温放置30min，测定517nm处的吸光度(A₁)。取不同浓度的样品和Vc溶液0.5mL，加入0.5mL乙醇，混匀室温放置30min，测定517nm处的吸光度(A₂)。取0.5mL蒸馏水，加入0.5mL DPPH乙醇溶液，混匀室温放置30min，测定517nm处的吸光度(A₃)。根据公式计算DPPH自由基清除能力(η_DPPH·)。

计算公式：

1.3 OH自由基的清除能力

取2mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液0.2mL，加入9mmol/L硫酸亚铁溶液0.2mL，分别加入0.6mL不同浓度的样品和Vc溶液0.6mL，最后加入6mmol/L双氧水0.2mL，37℃反应1h，在510nm下测定吸光度(A₁)。取2mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液0.2mL，加入0.2mL蒸馏水，分别加入0.6mL不同浓度的样品和Vc溶液0.6mL，最后加入6mmol/L双氧水0.2mL，37℃反应1h，在510nm下测定吸光度(A₂)。取2mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液0.2mL，加入9mmol/L硫酸亚铁溶液0.2mL，分别加入0.6mL蒸馏水，最后加入6mmol/L双氧水0.2mL，37℃反应1h，在510nm下测定吸光度(A₃)。根据公式计算OH自由基清除能力(η_·OH)。

计算公式：

二、试验结果

2.1总抗氧化能力

抗氧化物质能使Fe³⁺还原为Fe²⁺，Fe²⁺可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色测出其总抗氧化能力的高低。三种原料的抗氧化提取物及Vc在不同浓度时的总抗氧化能力见图1。由图1可见，所有抗氧化提取物的总抗氧化能力都随着溶液浓度的增加而增强，与Vc总抗氧化能力随浓度变化的趋势相同。肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物的总抗氧化能力在溶液浓度为0.15～0.2mg/mL时达到最大，分别为8.12U/mL和7.5U/mL。肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物的总抗氧化能力超过Vc总抗氧化能力的60％。肉桂叶蒸油剩余物的抗氧化提取物的总抗氧化能力等于Vc总抗氧化能力的40％。

2.2 DPPH自由基清除能力

如图2所示，随着抗氧化提取物和Vc的浓度增加，各种物质对DPPH自由基的清除率均表现为先增加最后趋于稳定。当浓度低于0.1mg/mL时，Vc、肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物的DPPH自由基清除能力随浓度的增加而逐渐增加。当浓度低于0.2mg/mL时，肉桂叶蒸油剩余物抗氧化提取物的DPPH自由基清除能力随浓度的增加而逐渐增加。计算各物质的IC₅₀值，结果表明Vc、肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物、肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂叶蒸油剩余物的抗氧化提取物的IC₅₀分别为0.012mg/mL、0.017mg/mL、0.021mg/mL和0.150mg/mL，上述结果表明肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物在清除DPPH自由基上具有较好虽然次于Vc，但是效果较好。该结果与总抗氧化能力的结果一致。

2.3 OH自由基的清除能力

如图3所示，当浓度低于0.05mg/mL时，Vc的OH自由基清除能力随浓度的增加而逐渐增加。当浓度低于0.2mg/mL时，肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物的OH自由基清除能力随浓度的增加而逐渐增加，其IC₅₀为0.12mg/mL。当OH自由基清除率趋于稳定时，肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物对OH自由基的清除能力超过Vc对OH自由基的清除能力的80％，肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂叶蒸油剩余物的抗氧化提取物相对较差，约等于Vc对OH自由基的清除能力的30％。该结果与总抗氧化能力的结果一致。

三、试验结论

三种原料对应的抗氧化提取物抗氧化能力与溶液浓度有较强的相关性。肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物的总抗氧化能力在溶液浓度为0.15～0.2mg/mL时达到最大，分别为8.12U/mL和7.5U/mL；肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物、肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物和肉桂叶蒸油剩余物的抗氧化提取物清除DPPH自由基的IC₅₀分别为0.017mg/mL、0.021mg/mL和0.150mg/mL；肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物对OH自由基的清除能力超过Vc对OH自由基的清除能力的80％。

实例5、本发明抗氧化提取物制备方法对主要成分含量的影响

一、试验方法

分别对实例1、2、3富集前后抗氧化提取物的成分含量进行测定，其中总黄酮使用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH比色法测定，总多酚使用Folin-Ciocalteu比色法测定。

1.1总黄酮含量测定

精密称取芦丁对照品，加入80％乙醇溶液，超声溶解，定容，制得1mg/mL的芦丁对照品溶液。精密称取富集前后样品作为供试品，加入80％乙醇溶液，超声溶解，定容，制得1mg/mL的供试品溶液。精密称取亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠，分别加入蒸馏水溶解，定容，制得5％亚硝酸钠溶液，10％硝酸铝溶液和4％氢氧化钠溶液。

分别准确移取10、50、100、150、200、250、300μL的芦丁对照品溶液，以80％乙醇补充至0.5mL。加5％亚硝酸钠溶液0.15mL，静置6min，加10％硝酸铝溶液0.15mL，静置6min，加4％氢氧化钠溶液2mL，加蒸馏水2.2mL，混匀，静置3min。测定508nm吸收波长下的吸光度。准确移取250μL供试品溶液，同上操作，每份供试品平行制备3份。取其中一份供试品重复测量6次，考察仪器精密度，每隔10min测量一次考察样品稳定性。

1.2总多酚含量测定

精密称取没食子酸对照品，加入蒸馏水，超声溶解，定容，制得0.1mg/mL的没食子酸对照品溶液。精密称取富集前后样品作为供试品，加入蒸馏水，超声溶解，定容，制得1mg/mL的供试品溶液。精密称取碳酸钠，加入蒸馏水溶解，定容，制得20％碳酸钠溶液。

分别准确移取50、100、150、200、250、300、400μL的没食子酸对照品溶液，以蒸馏水补充至3mL，加入福林酚试剂250μL，静置5min，加入20％Na₂CO₃溶液0.75mL，混匀，静置30min，测定763nm吸收波长下的吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。准确移取250μL供试品溶液，同上操作，每份供试品平行制备3份。取其中一份供试品重复测量6次，考察仪器精密度，每隔10min测量一次考察样品稳定性。

二、试验结果

采用紫外分光光度计测定抗氧化提取物中总黄酮的含量，方法学考察包括线性、精密度和稳定性，结果见表1。结果表明在一定线性范围内，溶液浓度与吸光度呈现良好的线性关系，相关系数＞0.99。仪器精密度良好。显色反应后溶液能在50min内保持稳定。综上所述该含量测定方法的线性、精密度、稳定性良好，适用于总黄酮和多酚含量测定。

表1黄酮、多酚含量测定的线性、精密度、稳定性

以肉桂叶蒸油剩余物为原料，富集之后抗氧化提取物中黄酮的含量从43.10mg/g提高到185.00mg/g，多酚的含量从低于定量限提高到26.03mg/g。以肉桂枝蒸油剩余物为原料，黄酮的含量从150.50mg/g提高到539.25mg/g，多酚的含量从82.43mg/g提高到375.63mg/g。以肉桂皮蒸油剩余物为原料，黄酮的含量从85.30mg/g提高到444.79mg/g，多酚的含量从71.60mg/g提高到281.60mg/g。本专利所使用的大孔吸附树脂富集方法使总黄酮和总多酚含量提高3～5倍，其中肉桂皮蒸油剩余物的抗氧化提取物中总黄酮和总多酚的含量之和达到72.64％，肉桂枝蒸油剩余物的抗氧化提取物中总黄酮和总多酚的含量之和达到91.49％。