丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用 (Sericin/nano-hydroxyapatite tissue engineering bone graft and preparation method and application thereof ) 是由 何春耒 张立兵 张业顺 于 2019-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于组织工程学技术领域,公开了一种含骨形态发生蛋白-2的丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物的构建(制备)方法及其应用。包括生长因子、支架材料和可选的种子细胞,所述种子细胞粘附于所述支架材料上,构成了具有空间结构和生物活性的细胞载体复合物,所述的支架材料是由丝胶蛋白(SS)、纳米羟基磷灰石(nHAP)构成的复合支架材料,丝胶蛋白包裹了含有人重组骨形态发生蛋白-2生长因子,复合支架材料上粘附有骨髓间充质干细胞。本发明可根据SS、nHAP的比例来调节支架的孔径、降解速度及生物力学强度。本发明所述构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植物,在动物实验中已经证明了能很好的修复大段骨缺损。(The invention belongs to the technical field of tissue engineering, and discloses a construction (preparation) method and application of a sericin/nano-hydroxyapatite tissue engineering bone graft containing bone morphogenetic protein-2. The composite scaffold material is a composite scaffold material consisting of sericin (SS) and nano hydroxyapatite (nHAP), the sericin wraps a growth factor containing human recombinant bone morphogenetic protein-2, and bone marrow mesenchymal stem cells are adhered on the composite scaffold material. The invention can adjust the aperture, degradation speed and biomechanical strength of the bracket according to the proportion of SS and nHAP. The bionic artificial tissue engineering bone constructed by the invention can be used for bone graft for repairing large bone defect, and animal experiments prove that the bionic artificial tissue engineering bone can well repair the large bone defect.)
技术领域
本发明涉及骨缺损的一种修复生物可降解活性材料，属于组织工程学技术领域，具体涉及一种仿生人工骨的构建及其在骨科中的应用，更具体涉及丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石组织工程骨移植物及其制备方法和应用。
背景技术
由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的难题之一，植骨术是解决这一问题的主要方法。植骨术主要分为自体来源植骨术、同种异体或异种植骨术。这两种方法的弊端或局限性主要有供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、移植排斥反应等。近年来随着组织工程学科的发展，利用组织工程学原理和方法构建的组织工程骨移植可以改进上述弊端，组织工程为骨缺损的修复带来美好的前景。骨组织工程研究主要有4方面：支架材料、种子细胞、细胞因子、临床使用。
组织工程化骨作为骨修复材料的替代物可以避免生物源修复材料的缺陷。将生物相容性好的有骨传导能力的并在体内可生物降解的支架材料与具有强大诱骨活性的细胞因子结合可以使骨缺损修复材料拥有骨传导和诱导的双重特性，在迅速成骨的同时植入材料逐渐降解，为临床骨缺损的修复提供了全新的思路和方法。
骨髓间充质干细胞主要存在于骨髓中，现证实MSCs至少可向9种以上成熟细胞分化，其中包括成骨细胞及内皮细胞，分化多向性提示它可能成为细胞治疗和组织工程人工骨构建的理想种子细胞，因此，骨髓MSCs成为骨组织工程理想的种子细胞。
骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，BMP-2被认为具有最高的生物活性，是最具有前途的骨诱导蛋白，能促使原位和异位成骨，被认为是最具有前途的骨诱导物质，美国食品和药物管理局2004年正式批准rhBMP-2用于临床治疗长骨骨折，但由于BMP-2在体内含量极微，半衰期短，需要反复给药，使得对BMP-2的进一步研究和应用受到局限。因此，生物材料持续可控释放生长因子的能力对于其在临床治疗中的有效性具有重要意义。
羟基磷灰石(HA)是人体和动物骨骼的主要无机矿物成分，人们对HA做了广泛的研究，通过改进工艺技术已能制备出不同形状、孔隙率和降解率的HA产品，已研制出商业化生产的HA人工骨，并已经美国FDA认证，获准应用于临床。羟基磷灰石的孔径达到纳米级时将表现出一系列的独特性能，nHAP复合材料比相应的微米复合材料具有更好的生物学性能；同时优化材料的组成、结构和工艺将可能得到力学性能与天然骨更为匹配的骨修复材料。
近年来在骨组织工程中，有关纳米羟基磷灰石(nHAP)材料学的研究在国际上得到迅速发展，完整的科学体系正在形成。nHAP具有与人体骨组织相似的无机成分(钙、磷)能制备出不同形状、孔隙率和降解率的产品，羟基磷灰石纳米粒子引入到非亲水性的可生降解聚酯基体材料中去，就有可能得到能被降解，力学性能较好，骨诱导性能优越的新型骨修复材料。
但是单一人工材料一般难以满足骨组织工程用细胞外支架材料的要求，还有nHAP的难降解性、脆性制约了它在临床中的使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的骨组织工程用细胞外支架材料中nHAP的难降解性、脆性，以及生物材料在体内含量极微，半衰期短，需要反复给药的缺陷，提供一种能够可持续释放生物材料的组织工程骨移植物及其制备方法和应用。
生长因子例如骨形态发生蛋白-2属于β-转化生长因子(Transforming growthfactor-β，TGF-β)超家族成员之一，在胚胎发生和发育，组织与细胞的增殖分化等方面起着重要作用，BMP-2的高效诱导成骨活性已被越来越多的实验证实，天然BMP-2在体内含量极微，半衰期短，难以在体内维持持续的促成骨效应。在细胞与细胞外基质之间的信息传递方面，生长因子起着重要的作用。重组生长因子的控释成为影响生物材料能否有效应用于组织再生的重要因素之一。骨形态蛋白2(BMP-2)已被广泛应用于骨缺损的科学研究和临床治疗。用于临治疗的BMP-2应具有可控持续释放的能力，以指导细胞的增殖、成骨分化和骨的成型。因此，生物材料持续可控释放生长因子的能力对于其在临床治疗中的有效性具有重要意义。纳米材料在传递靶向药物、调控细胞分化和促进骨组织再生方面具有显著地优势。相关研究表明由胶团和树枝状大分子组成的聚合物纳米颗粒和磷酸钙、生物玻璃等无机纳米颗粒作为生物活性药物的加载体系已经在肌肉、骨骼等组织工程中得到应用。但是单一人工材料一般难以满足骨组织工程用细胞外支架材料的要求，还有nHAP的难降解性、脆性制约了它在临床中的使用。
丝胶蛋白(SS)主要来源于娟丝类昆虫，丝胶蛋白由蚕的中部丝腺分泌，是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，但丝胶蛋白长期以来在脱胶过程中被当作废物丢弃，降解过程中需要大量的氧，丝胶的直接排放造成环境的污染。通过对天然结构未破坏的纯丝胶蛋白水凝胶研究，发现丝胶蛋白具有良好的生物相容性、粘附性、高孔隙率和维持药物释放等特性，由此本发明首次采用丝胶蛋白生物材料作为新型的组织工程天然支架材料及药物缓释载体。
本发明将丝胶蛋白与纳米羟基磷灰石复合(根据骨修复部位对生物力学的要求可以调整复合比例)制备复多孔支架材料，以其为载体，加载并控释生长因子例如骨形态蛋白2(BMP-2)，检测BMP-2的加载和释放情况，并对其成骨诱导性进行了研究，用体外构建仿生人工骨，经实验证实细胞复合前后可高效、持续释放BMP-2并促进其增殖分化；优选实施方式中，种子细胞在复合支架中扫描电镜见细胞贴附生长良好，复合支架材料可缓慢、持续释放BMP-2，时间长达42天。用上述方法构建的仿生人工骨植入桡骨缺损模型可以很好的修复桡骨节段性骨缺损。通过实验证实缺损模型12周时骨折完全愈合，皮质骨连续，髓腔再通。本研究结果表明，利用生物材料持续可控释放生长因子的能力对于其在临床治疗中的有效性具有重要意义，其主要是通过软骨化骨的方式诱导成骨，是治疗节段性骨缺损的理想方法。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种含生长因子的组织工程骨移植物，包括复合支架材料和生长在所述复合支架材料上的生长因子，所述的复合支架材料包括通过交联剂交联的丝胶蛋白和纳米羟基磷灰石的复合物。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种制备本发明所述的组织工程骨移植物的方法，该方法包括：配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液，然后在交联剂存在下与纳米羟基磷灰石的悬浮液混合得到混合溶液；将混合溶液注入模型进行冷冻、干燥。
根据本发明的第三方面，提供一种制备组织工程骨移植物的方法，其中，纳米羟基磷灰石是采用溶胶-絮凝法制备，丝胶蛋白溶液采用LiBr方法提取，细胞支架载体复合物采用超声混匀后注入磨具后低温冻干制备，具体包括：
复合人工骨制备包括以下步骤：
A、nHAP人工骨材料粉末制备
(1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，加入氨水，调整溶液的pH值为8-13，可选地添加分散剂，调整搅拌器速率和搅拌时间，使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤；
(2)将沉淀物在80-120℃干燥，在600-800℃温度下烧结2-3小时，得到粉末粒径小于100nm与人体骨组织成分相似的纳米级粉末；
B、丝胶蛋白溶液的制备(根据需要可制备不同的浓度)
将185Nd-s蚕茧剪碎，浸于6M LiBr水溶液中，35℃下裂解24h，然后将丝胶液用超纯水在室温透析两天，得到丝胶蛋白溶液；
其负载rhBMP-2的丝胶蛋白缓释溶液合成步骤如下：
取丝胶蛋白浓度约3重量％的丝胶蛋白溶液，将生长因子BMP-2与上述3重量％的丝胶蛋白溶液按照1:50(质量比)混合，配置浓度为5μg/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶液；
C.丝胶蛋白/羟基磷灰石为载体的缓释体系复合支架材料的制备
将载有rhBMP-2的丝胶蛋白溶液混入nHAP混合物悬浮液中，然后通过冷冻干燥制备缓释rhBMP-2的复合支架；
D.复合支架负载种子细胞，采用负压抽吸制备，其步骤如下：
(1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中，含10重量％胎牛血清的DMEM培养液预湿24小时，37℃、5体积％CO2培养箱培养24h，
(2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压，放入37℃孵箱中保持10分钟后，放入37℃、5％CO2培养箱中贴附2小时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37℃、5体积％CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。
根据本发明的第四方面，本发明提供一种本发明所述的组织工程骨移植物和本发明的制备方法制备得到的组织工程骨移植物作为仿生人工骨在骨科中的应用。
本发明通过对天然结构未破坏的纯丝胶蛋白水凝胶研究，发现丝胶蛋白具有良好的生物相容性、粘附性、高孔隙率和维持药物释放等特性，由此本发明首次采用丝胶蛋白生物材料作为新型的组织工程天然支架材料及药物缓释载体，采用本发明的组织工程骨移植物作为仿生人工骨在骨科中应用时，生长因子能够持续可控释放，由此克服了BMP-2直接应用的不足。
本发明的生长因子如rhBMP-2采用丝胶蛋白作为载体缓释来解决
rhBMP-2释放的问题，由此可以最大限度的发挥rhBMP-2的作用时间，本发明所述构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植物，在动物实验中已经证明了能很好的修复大段骨缺损，使丝胶蛋白组织工程骨的临床应用成为可能。
本发明利用生物材料丝胶蛋白作为载体缓释来解决BMP-2释放的问题，经过试验证实被认为是有效的手段，其应用于组织工程骨治疗骨缺损的应用，用于解决临床上因骨缺损及骨创伤引起的骨修复问题。
附图说明
图1为本发明实施例组织工程骨移植物结构示意图；
图2为本发明实施例nHAP粉末人工骨扫描电镜下(200kv×100000)；
图3为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv×300)(SS/HA质量比1：1)；
图4为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv×100)(SS/nHAP质量比4：6)；
图5为本发明实施例A组12周X线；
附图标记说明
1：组织工程骨移植物；
2：丝胶蛋白；
3：生长因子；
4：种子细胞；
5：纳米羟基磷灰石。
具体实施方式
以下通过实施例来描述本发明，应该指出的是，所列举的实施例不应理解对发明的限制。
如图1所示，本发明提供一种含生长因子的组织工程骨移植物1，包括复合支架材料和生长在所述复合支架材料上的生长因子3，所述的复合支架材料包括通过交联剂交联的丝胶蛋白2和纳米羟基磷灰石5的复合物。
根据本发明的骨移植物，其中，如图1所示，所述生长因子与复合支架材料构成具有三维空间结构和生物活性的细胞载体复合物，其中，所述复合支架材料呈多孔状，孔的形状主要为圆形，复合支架材料的孔与孔之间相互贯通使得所述复合支架材料形成连通空隙。
根据本发明的骨移植物，为了使生长因子能够进行更好的持续可控释放，优选所述生长因子生长在丝胶蛋白上。
根据本发明的骨移植物，优选以所述的复合支架材料的总重计，丝胶蛋白的含量为20-80重量％，纳米羟基磷灰石的重量为20-80重量％。
根据本发明的骨移植物，优选所述交联剂为辣根过氧化物酶与H2O2的混合物、戊二醛和京尼平中的一种或多种，由于戊二醛与京尼平的体内毒性，优选所述交联剂为辣根过氧化物酶与H2O2的混合物。
根据本方面，所述辣根过氧化物酶与H2O2的质量比无特殊要求，例如为0.1-1:1。
根据本发明的骨移植物，优选丝胶蛋白与交联剂的重量比为0.01-100:1。
根据本发明的骨移植物，优选所述生长因子与丝胶蛋白的重量比为0.01-1:1。
按照前述比例构建本发明的骨移植物，不仅生长因子能够进行更好的持续可控释放，而且能够改善支架材料的难降解性和脆性，提高生物材料在体内的含量和延长其半衰期。
根据本发明的一种优选实施方式，优选所述骨移植物还包括种子细胞4，所述种子细胞4粘附在所述复合支架材料上，更优选所述种子细胞为骨髓间充质干细胞。
根据本发明，所述种子细胞的类别无特殊要求，可以为本领域的常规选择，根据本发明，优选所述骨髓间充质干细胞为经分离、扩增经体外传代为第3代的骨髓间充质干细胞。
根据本发明，更优选所述种子细胞密度为1×106-5×106个/ml。
根据本发明的一种优选实施方式，所述纳米羟基磷灰石的孔隙直径为100～250μm、孔隙率为90％以上，并且孔隙为连通孔隙。
根据本发明的一种优选实施方式，所述丝胶蛋白分子量为50kDa～250kDa。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的丝胶蛋白为从丝素缺失突变型家蚕185N-ds蚕种提取的天然结构未破坏的丝胶蛋白。
根据本发明的一种优选实施方式，所述交联剂为戊二醛、京尼平、辣根过氧化物酶和H2O2的混合物的一种，优选所述交联剂为辣根过氧化物酶和H2O2的混合物。
根据本发明的一种优选实施方式，所述生长因子可以为本领域的常规选择，例如所述生长因子为BMP2，优选为rhBMP2。本发明对此无特殊要求，在此不详细赘述。
按照本发明的前述组成和结构的骨移植物，作为仿生人工骨在骨科中应用时，生长因子能够持续可控释放。对其制备方法无特殊要求，只要具有前述组成和结构均可实现本发明的目的。
根据本发明的优选实施方式，本发明所述的组织工程骨移植物，包括由骨髓间充质干细胞、含rhBMP-2生长因子、纳米羟基磷灰石和丝胶蛋白构建的具有三维空间结构及生物活性的仿生人工骨。
本发明的构建方法，可以包括：
采用溶胶-絮凝法制备纳米羟基磷灰石(nHAP)；
采用低温LiBr法制备提取结构未破坏的丝胶蛋白溶液；
采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞；
采用负压抽吸法构建细胞支架载体复合物仿生人工骨。
根据本发明的一种优选实施方式，提供一种制备本发明所述的组织工程骨移植物的方法，该方法包括：配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液，然后在交联剂存在下与纳米羟基磷灰石的悬浮液混合得到混合溶液；将混合溶液注入模型进行冷冻、干燥。
根据本发明的方法，优选所述的丝胶蛋白采用低温LiBr法制备，更优选包括如下步骤：将蚕茧剪碎，浸于LiBr水溶液中进行裂解，然后将裂解的丝胶液进行纯化，可选择地进行对所述丝胶液进行提浓或降浓，得到所述浓度的丝胶蛋白溶液。
根据本发明的一种优选实施方式，优选裂解的条件包括：LiBr水溶液的浓度为4-12M，和/或温度为25-40℃，和/或，时间为12-36h。
根据本发明的一种优选实施方式，优选所述蚕茧为185Nd-s蚕茧。
本发明中，优选所述纯化的步骤包括：在室温下，用超纯水进行透析。
根据本发明，优选所述纳米羟基磷灰石采用溶胶-絮凝法制备，更优选包括如下步骤：在碱性水溶液条件下，在分散剂存在下，将硝酸钙与磷酸铵接触沉淀，将得到的沉淀物进行干燥，烧结得到100nm以下粒径的纳米羟基磷灰石。
根据本发明，优选通过氨水调节溶液的pH值为8-13，更优选干燥的条件包括温度为80-120℃，和/或烧结的条件包括温度为600-800℃，和/或时间为2-3小时。
根据本发明，所述分散剂可以为常规选择，本发明对此无特殊要求，在此不进行详细说明。
根据本发明，其中优选配置含有生长因子和丝胶蛋白的溶液的步骤包括：
将生长因子与丝胶蛋白溶液混合，其中，优选生长因子与丝胶蛋白溶液的用量比为5-10μg生长因子：ml丝胶蛋白溶液；更优选丝胶蛋白溶液的浓度为1-10重量％。
根据本发明，其中，优选交联剂源为辣根过氧化物酶和双氧水的混合物、戊二醛和京尼平中的一种或多种；优选所述的交联剂源为辣根过氧化物酶和双氧水的混合物，更优选所述辣根过氧化物酶与双氧水的用量体积比为1-10:1。
根据本发明，其中，优选丝胶蛋白溶液与交联剂的体积比为100:1-50。
根据本发明，其中，优选该方法还包括：冷冻、干燥结束后进行负压抽吸负载种子细胞：优选包括如下步骤：
(1)将干燥材料进行预湿培养得到预湿支架；
(2)将种子细胞均匀加入预湿支架，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压培养。
根据本发明，预湿和真空负压抽吸均可以参照现有技术的步骤进行，本发明对此无特殊要求，例如可以按照如下步骤进行，但不能因此本发明仅适用于下述步骤：(1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中，含10重量％胎牛血清的DMEM培养液预湿24小时，37℃、5体积％CO2培养箱培养24h，
(2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压，放入37℃孵箱中保持10分钟后，放入37℃、5％CO2培养箱中贴附2小时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37℃、5体积％CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。
根据本发明的一种优选的实施方式，本发明提供一种制备本发明所述的组织工程骨移植物的方法，其中，纳米羟基磷灰石是采用溶胶-絮凝法制备，丝胶蛋白溶液采用LiBr方法提取，细胞支架载体复合物采用超声混匀后注入磨具后低温冻干制备，具体包括：
复合人工骨制备包括以下步骤：
A、nHAP人工骨材料粉末制备
(1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，加入氨水，调整溶液的pH值为8-13，添加分散剂，调整搅拌器速率和搅拌时间，使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤；
(2)将沉淀物在80-120℃干燥，在600-800℃温度下烧结2-3小时，得到粉末粒径小于100nm与人体骨组织成分相似的纳米级粉末；
B、丝胶蛋白溶液的制备(根据需要可制备不同的浓度)
将185Nd-s蚕茧剪碎，浸于6M LiBr水溶液中，35℃下裂解24h，然后将丝胶液用超纯水在室温透析两天，得到丝胶蛋白溶液；
其负载rhBMP-2的丝胶蛋白缓释溶液合成步骤如下：
取丝胶蛋白浓度约3重量％的丝胶蛋白溶液，将生长因子BMP-2与上述3重量％的丝胶蛋白溶液按照1:50(质量比)混合，配置浓度为5μg/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶液；
C.丝胶蛋白/羟基磷灰石为载体的缓释体系复合支架材料的制备
将载有rhBMP-2的丝胶蛋白溶液混入nHAP混合物悬浮液中，然后通过冷冻干燥制备缓释rhBMP-2的复合支架；
D.复合支架负载种子细胞，采用负压抽吸制备，其步骤如下：
(1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中，含10重量％胎牛血清的DMEM培养液预湿24小时，37℃、5体积％CO2培养箱培养24h，
(2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压，放入37℃孵箱中保持10分钟后，放入37℃、5％CO2培养箱中贴附2小时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37℃、5体积％CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。
本发明采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，大大提高了分离的成功率。
按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物1，包括含生长因子3的复合支架材料2和种子细胞4，所述种子细胞4粘附于所述支架材料1上，构成了具有三维空间结构和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料2是采用成型复合的丝胶蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架，复合支架含有生长因子，其上粘附有骨髓间充质干细胞。
按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物，所述纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nHAP)是孔隙直径为100～250μm、孔隙率为90％以上的多孔活性材料，并且所得孔隙为连通孔隙。
按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物，优选所述的丝胶蛋白(sericin silk，SS)溶液是丝胶蛋白从丝素缺失突变型家蚕蚕185N-ds品种提取。
按照本发明前述的制备方法制备的组织工程骨移植物，通过上述结构使得复合支架能缓慢释放生长因子人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)
按照本发明前述的制备方法，优选所述的种子细胞是取自于骨髓，经分离、扩增经体外传代为第3代的骨髓间充质干细胞，细胞密度为1×106～5×106个/ml。
根据本发明，优选所述的丝胶蛋白溶液是包裹了含一定浓度的rhBMP-2生长因子的混合溶液。
根据本发明，优选所述的rhBMP-2的配置浓度为5μg/ml。
根据本发明，能够缓慢、持续、高效释放细胞因子骨形态发生蛋白-2。
根据本发明，采用LiBr方法获得的丝胶蛋白在交联剂存的情况下，成胶性好，能形成水凝胶的结构未破坏的丝胶蛋白溶液。
本发明提供了本发明所述的组织工程骨移植物和按照本发明的制备方法制备得到的组织工程骨移植物作为仿生人工骨在骨科中的应用。
以下通过实施例对本发明进行详细说明：
本发明的实施例按照如下步骤构建：
nHAP人工骨材料粉末制备
(1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成(硝酸钙与磷酸铵的摩尔比为1:1)，加入氨水，调整溶液的pH值为10，调整搅拌器速率和搅拌时间，使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤；
(2)将沉淀物在100℃干燥，在700℃温度下烧结2小时，得到粉末粒径小于100nm与人体骨组织成分相似的纳米级粉末(扫描电镜下观察(5kv×300)，见图2)；
所述的丝胶蛋白通过下列的步骤构建：
1)称取蚕茧(185 Nd-s)600mg置于试剂瓶中；
2)加入24ml 6M LiBr溶液；
3)35℃水浴24h；
4)4000rpm×5min初步去除不溶性物质；
5)加入6ml Tris-HCl(1M pH 9.0)；
6)将上述溶液转入到预处理好的透析袋(NWCO 3000Da)中；
7)透析袋放置含有超纯水的试剂瓶中；
8)置于搅拌器上慢速搅拌透析；
9)每6h换水一次；
10)透析48h；
11)采用PEG 6000水溶液浓缩丝胶液直到达到需要的浓度；
所述的仿生人工骨通过以下步骤构建：
(1)取上述制备浓度约3重量％(浓度可根据制备人工骨的生物力学要求调整)的丝胶蛋白溶液，为了生产载有rhBMP-2的丝胶溶液，将生长因子以1:50(质量比)的rhBMP-2与SS上述3重量％的丝胶蛋白溶液(w/w)混合，配置浓度为5μg/ml rhBMP-2的丝胶蛋白溶液。
(2)将纳米羟基磷灰石与上述制备的含rhBMP-2生长因子的3％丝胶蛋白溶液以一定的质量比例混合(根据应用生物力学的需要调整SS、nHAP的比例)，然后放入超声波振荡仪中充分搅拌，加入HPR/H2O2(HRP5mg/ml，H2O2万分之3)按100:3:3的体积使其混合均匀。将混匀的溶液用注射注放入模型中，立即放入-20℃冰箱中冷冻24小时，分别制备的圆柱形或方形支架材料，随后用真空冷冻干燥机干燥72h，得到含rhBMP-2的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料，人工骨材料采用Co60辐照灭菌备用。
人工骨材料负载种子细胞，采用负压抽吸制备，其步骤如下：
(1)rhBMP-2的复合支架置入6孔板中，含10重量％胎牛血清的DMEM培养液预湿24小时，37℃、5体积％CO2培养箱培养24h，
(2)把骨髓间充质干细胞均匀加入上述预湿处理的支架中(以SS/nHAP质量比1:1为本次的实验样品，可以依据情况调整)，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压，放入37℃孵箱中保持10分钟后，放入37℃、5％CO2培养箱中贴附2小时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液于37℃、5体积％CO2培养箱继续培养2-3d换液一次。
图1为本发明实施例组织工程骨移植物结构示意图，图1说明；本发明的一种组织工程骨移植物包括支架材料、生长因子和种子细胞，构成了具有孔隙率的三维空间结构和生物活性的细胞载体复合物。
图2为本发明实施例制备的纯nHAP粉末人工骨扫描电镜下(200kv×100000)，图2看出本发明制备出尺寸均一、水分散性良好的纳米羟基磷灰石颗粒。
图3为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察(5kv×300)(SS/nHAP质量比1：1)，图3说明丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架具有良好的多孔结构，羟基磷灰石纳米颗粒均匀分布在丝胶蛋白支架中。
图4为本发明实施例复合后人工骨扫描电镜下观察((5kv×100)(SS/nHAP质量比4：6)，图4说明丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架具有良好的多孔结构，羟基磷灰石纳米颗粒均匀分布在丝胶蛋白支架中，且随着nHA P含量的增大，孔隙变小。
图5为本发明实施例A组12周X线，图5说明12周时植入材料降解完毕，髓腔完全再通，骨塑形完全，骨缺损修复。
仿生人工骨在动物骨缺损修中的应用：
1、动物实验手术操作(新西兰大白兔)
1.选用盐酸***注射液20mg/kg，由耳缘静脉注入麻醉。
2.右侧前臂常规脱毛，消毒，手术铺巾。
3.取前臂桡侧中段作2cm纵形切口，暴露桡骨干，在距桡骨近端2.5cm处用线锯连同骨膜一起锯断桡骨做成2cm的骨缺损动物模型。
4.生理盐水冲洗伤口后按不同的组别分别植入A组:rhBMP2/SS/nHAp+BMSCs(本发明的骨移植物)、B组:SS/nHAP+BMSC(按照本发明方法制备，不引入丝胶蛋白)、C组:单纯SS/HAP(按照本发明的方法制备，不引入生长因子及骨髓间充质干细胞)，空白对照组则不填充任何材料，依层次缝合伤口、D组:空白对照组。
5.局部肢体不作内、外固定，伤口不予包扎。
6.麻醉清醒后放入笼内常规喂养，术后三天每天80万单位青霉素肌注抗炎。
观察指标及方法
1.一般情况及大体标本
术后观察兔的饮食、活动、伤口反应，4周、8周、12周取材观察植入材料的表面情况、成骨和炎症反应等。取出标本后观察骨缺损连接情况、骨端骨痂生长情况。
2.X线检查
术后4周、8周、12周进行试验肢体的X线摄片检查。
3.生物力学检测
各组在4周、8周、12周各时间点分别随机取4只动物处死后，切取术侧完整桡骨标本，剔净骨膜及软组织后在858 miniBionix力学测试机上行三点抗弯试验。
4.扫描电镜观察
处死动物后取出桡骨全段，从各材料组各个时期标本中随机取出2个标本，截取骨缺损部位及与材料交界处两端各0.5cm，用3％戊二醛固定后用利刀从中间剖开，脱水、临界点干燥、喷金镀膜后在扫描电镜(SEM)下观察骨与材料界面相容性情况及骨缺损修复情况。
结果：
1.一般情况及大体标本
术后实验动物饮食、活动正常，无伤口感染，术后1周左右伤口一期愈合，伤口缝线自行脱落，肢体活动正常，无受限及跛行。
2.X线表现
实验组A组：4周时材料部分降解，材料与骨组织融合，骨痂形成；8周时材料进一步降解，骨质与材料接触界限模糊；12周时材料降解完毕，髓腔完全再通，塑形完全，骨缺损修复；B组、C组骨缺损修复效果欠佳；D组：骨缺损未得到修复。
3.力学分析
各时期试验组标本在三点弯曲试验中，测得的弯曲强度数据统计学分析显示：A、B、C组各组组内比较，4周＜8周＜12周，差异均有统计学意义(P＜0.05)；4周、8周、12周各组间比较，A组＞B组＞C组差异有统计学意义(P＜0.01)；表明A组材料的成骨能力优于B组和C组材料，而同一材料植入骨缺损处后随着时间的增长，其力学强度也随之增强。
4.扫描电镜观察
A组：4周时材料出现降解，材料与正常骨质间出现间隙，间隙内有骨痂产生充填；8周：材料进一步降解，但材料与正常骨质“融合”，其间产生大量新生类骨组织；12周时，材料降解完全，骨缺损区被新生板层状骨组织充填，骨缺损完全修复。B、C组可见材料吸收欠佳，新生骨量少。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。