阅读说明：本技术 一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用 (Cancer stem cell-like drug-resistant cell-derived ubiquitinated protein and application thereof in preparation of anti-cancer drugs ) 是由 王立新 黄芳 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用,其主要由以下方法制备所得：(1)利用化疗药诱导癌细胞耐药,得到富集了癌干细胞的癌干细胞样耐药细胞株；(2)将泛素化蛋白募集蛋白偶联至佐剂,得偶联佐剂；(3)培养上述癌干细胞样耐药细胞株,抑制其泛素化蛋白降解,然后利用步骤(2)所得的偶联佐剂募集泛素化蛋白,即得所述泛素化蛋白。本发明在原有基础上改变了泛素化蛋白来源,制备获得了具有癌干细胞样耐药肿瘤细胞抗原特异性的泛素化蛋白,诱导了具有癌干细胞样耐药肿瘤细胞特异性的免疫应答,并且联合STING激动剂,大大提高疫苗的治疗肿瘤的效果。(The invention discloses a cancer stem cell-like drug-resistant cell-derived ubiquitination protein and application thereof in preparation of anti-cancer drugs, and the cancer stem cell-like drug-resistant cell-derived ubiquitination protein is mainly prepared by the following method: (1) inducing cancer cell drug resistance by using chemotherapeutic drugs to obtain a cancer stem cell-like drug-resistant cell strain enriched with cancer stem cells; (2) coupling the ubiquitinated protein recruiting protein to an adjuvant to obtain a coupled adjuvant; (3) culturing the cancer stem cell-like drug-resistant cell strain, inhibiting degradation of ubiquitinated protein, and then recruiting the ubiquitinated protein by using the coupling adjuvant obtained in the step (2) to obtain the ubiquitinated protein. The invention changes the source of ubiquitinated protein on the original basis, prepares and obtains ubiquitinated protein with the specificity of cancer stem cell-like drug-resistant tumor cell antigen, induces the immune response with the specificity of cancer stem cell-like drug-resistant tumor cell, and greatly improves the tumor treatment effect of the vaccine by combining with STING agonist.)

一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药 物中的应用

技术领域

本发明涉及一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于肿瘤疫苗技术领域。

背景技术

随着肿瘤学、免疫学及分子生物学等学科的不断发展，肿瘤免疫治疗成为继手术治疗，化疗，放疗等传统治疗以外的新兴治疗方法。肿瘤免疫治疗通过激发和增强机体自身的抗肿瘤免疫应答杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长和转移。在临床研究中，在黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等，免疫治疗已经取得了引人注目的结果，部分免疫疗法已经获得美国FDA批准。以乳腺癌为例，乳腺癌目前仍然是女性常见的癌症，是女性死亡的第二大原因，发病率也在逐年上升。目前对乳腺癌的常规治疗包括采用手术，放射治疗和化疗的传统癌症治疗方法，也包括靶向治疗和激素治疗等方法。而根据临床资料显示，乳腺癌异质性高，高转移，易复发，预后差且大部分肿瘤病人对化疗、放疗等不敏感，长期化疗和靶向治疗也会引起乳腺癌病人耐药性的产生，尤其是对于那些出现或者发展成为IV期疾病的患者，5年生存率仍然很差。因此，乳腺癌的临床治疗迫切需要新的手段和治疗策略，而近年来免疫治疗的出现有望成为治疗乳腺癌的新转机。免疫治疗包括肿瘤疫苗在内，具有靶向性强和毒副作用小等优点，在临床上取得了许多成果的试验，尤其是治疗性肿瘤疫苗越来越受到人们的关注。

肿瘤疫苗发挥作用的至关重要的因素就是肿瘤相关性抗原(TAAs，tumor-associated antigens)，肿瘤疫苗主要由专职抗原提成细胞(pAPC，professional antigenpressing cell)交叉递呈TAAs,诱导初始T细胞应答，活化后的T细胞识别TAAs，特异性杀伤靶细胞。申请人前期研究发现，富含泛素化蛋白的自噬小体DRibble是有效的抗原载体，DRibble携带的肿瘤抗原能被DC摄取，并通过交叉提呈方式诱导特异性CD8⁺T细胞应答。进一步研究发现，泛素化蛋白Ub是DRibble发挥抗肿瘤作用的主要成分，申请人前期通过带有三个泛素分子结合基序(UIM)的Vx3融合蛋白(His-Vx3-eGFP)直接从富含泛素化蛋白的肿瘤细胞裂解液中富集泛素化蛋白能够在多种肿瘤模型上发挥抗肿瘤作用。为了进一步优化泛素化蛋白疫苗，申请人将His-Vx3-eGFP蛋白共价偶联至纳米铝，利用纳米铝的物理特性，可以通过一步离心法快速、简便、高效地募集泛素化蛋白，同时纳米铝作为免疫佐剂，进一步提高了泛素化蛋白的免疫效果，成功制备了“泛素化蛋白-纳米铝佐剂复合疫苗”，在荷瘤小鼠模型上可以有效的发挥抗肿瘤作用。

乳腺癌病人极易发生转移和产生肿瘤耐药性，且在耐药肿瘤细胞中富集了癌干样的乳腺癌肿瘤细胞，癌干细胞是存在于肿瘤组织中的具有自我更新、增殖、分化功能的一小部分细胞群，被认为是肿瘤复发、转移以及药物耐受发生的关键因素甚至源头。发展以癌干细胞为靶点的治疗新策略，在关注肿瘤整体体积消减的同时，重点靶向癌干细胞的清除，有望克服肿瘤复发、转移以及药物耐受的发生，已成为肿瘤治疗领域的新思路。

现有的常规治疗性肿瘤疫苗往往针对原发性不耐药未转移的乳腺癌，对一些晚期或发生转移或耐药的乳腺癌患者不能发挥有效的作用。

发明内容

发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，尤其是该泛素化蛋白联合Sting激动剂DMXAA治疗转移性癌的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，所述耐药细胞来源泛素化蛋白主要由以下方法制备所得：

(1)癌耐药细胞的建立：利用化疗药诱导癌细胞耐药，得到富集了癌干细胞的癌干细胞样耐药细胞株；

(2)佐剂的修饰：将泛素化蛋白募集蛋白偶联至佐剂，得偶联佐剂；

(3)募集泛素化蛋白：培养上述癌干细胞样耐药细胞株，抑制其泛素化蛋白降解，然后利用步骤(2)所得的偶联佐剂募集泛素化蛋白，即得所述癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白。

步骤(1)中，所述癌细胞优选为乳腺癌细胞，所述化疗药可以选自乳腺癌病人临床常用药物包括烷化剂类(如环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥等)、抗代谢性药物类(如氟尿嘧啶、氨甲喋呤等)、抗生素类(如阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素C等)、生物碱类(如长春新碱、秋水仙碱等)和紫杉醇类(如多西他赛等)，优选抗生素类表阿霉素。其他类似的癌细胞也同样适用，例如所述癌细胞还可以选自肺癌细胞，利用化疗药顺铂诱导肺癌细胞耐药等。

步骤(1)中，通过低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导癌细胞耐药，方法优选如下：

培养癌细胞，待到细胞成长到55-85％时，换成含化疗药的培养基，从一开始(0.01-5)μg/ml的培养基含药浓度逐步递增到到(100-500)μg/ml，培养，每1～3天换液一次，传代。

步骤(2)中，所述泛素化蛋白募集蛋白可以选自泛素抗体(如UbiquitinAntibody，K11-linkage Specific Polyubiquitin Antibody，K48-linkage SpecificPolyubiquitin Antibody，K63-linkage Specific Polyubiquitin Antibody等)或者泛素结合蛋白，优选泛素结合蛋白如Vx3蛋白等，进一步优选Vx3蛋白。

为制备和纯化Vx3蛋白，可选用His蛋白、MyC蛋白、GST蛋白或HA蛋白等标签蛋白进行标记，优选His蛋白。

所述佐剂选自纳米磷酸钙佐剂、纳米四氧化三铁佐剂、锰佐剂或纳米铝，优选纳米铝。

Vx3蛋白可通过吸附或共价偶联至纳米铝佐剂，优选偶联剂共价偶联方法。更一步优选，所述偶联剂选自三乙氧基硅烷，其通过醛基连接至纳米铝佐剂，然后与His-Vx3蛋白反应，通过氨基与羧基生成稳定的碳氮双键。

所述His-Vx3蛋白是可以通过以下方法制得：

复苏转化了His-Vx3表达质粒的大肠杆菌，诱导其表达蛋白，采用镍离子层析法提取所述His-Vx3蛋白。

所述His-Vx3蛋白为具有泛素结合结构域的Vx3(A7)融合蛋白，Vx3(A7)融合蛋白为串联了三个来源于Vps27(a yeast homologue of HRS,Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)的UIM(ubiquitin-interacting motif)的人工构建体，是近年来报道的人工构建串联有泛素结合结构域的对泛素化蛋白有很高亲和力的蛋白。

步骤(3)中，所述抑制泛素化蛋白降解的方法优选为：培养的癌干细胞样耐药细胞生长至75-85％，加入蛋白酶体抑制剂(如PSI、乳胞素、MG132、或硼替佐米，优选硼替佐米)和氯化铵，加入量分别为(200-500)nmol/L和(50-100)mmol/L，干预细胞100-200小时，抑制泛素化蛋白的降解。

步骤(3)中，抑制耐药细胞中泛素化蛋白降解后，再经细胞裂解液处理，离心得上清液，然后与偶联纳米铝颗粒共孵育，即可募集泛素化蛋白，再经低温(2℃-15℃)离心，所得沉淀即为所述癌干细胞样耐药细胞来源的泛素化蛋白。所述共孵育优选在4℃下共孵育过夜。

本发明还提供了所述癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白在制备抗癌药物中的应用。优选，所述泛素化蛋白来源为乳腺癌细胞时，其能够用于治疗乳腺癌。

优选，所述癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白在制备治疗耐药转移性癌药物中的应用，进一步优选，所述泛素化蛋白来源为乳腺癌细胞时，其能够用于治疗耐药转移性乳腺癌。

本发明最后提供了所述癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白联合Sting激动剂在制备抗癌药物中的应用。优选，所述泛素化蛋白来源为乳腺癌细胞时，其联合Sting激动剂能够用于治疗乳腺癌，效果更加显著。

优选，所述癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白联合Sting激动剂在制备治疗耐药转移性癌药物中的应用。进一步优选，所述泛素化蛋白来源为乳腺癌细胞时，其联合Sting激动剂能够用于治疗耐药转移性乳腺癌，效果更加显著。

所述Sting激动剂选自DMXAA或2’3’-c-di-Amp等，或者与2’3’-c-di-Amp结构类似的2'3'-cGAMP，3'3'-cGAMP，c-di-AMP，c-di-AMP等，也可以达到类似的效果，优选DMXAA或2’3’-c-di-Amp。

本发明针对临床化疗产生的耐药且多发转移的癌症患者，尤其是乳腺癌病人，利用模拟人IV期乳腺癌的高转移性小鼠4T1模型，制备了癌干细胞样的耐药细胞来源泛素化蛋白的新型疫苗，来解决乳腺癌肿瘤耐药和高转移性问题，探索新型疫苗的抗肿瘤效应和机制。通过体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导癌干细胞样的表阿霉素耐药细胞，并在体内、体外进一步对其耐药性和癌干细胞性进行鉴定，成功诱导了癌干细胞样的表阿霉素耐药细胞4T1/EPB，并且通过4T1/EPB细胞建立了乳腺癌耐药转移性荷瘤小鼠模型。

此外，本发明在原有疫苗的基础上将癌干细胞样的耐药肿瘤细胞来源的泛素化蛋白与纳米铝连接制备新型疫苗，并联合Sting激动剂DMXAA等，探索一种新的免疫治疗策略，在耐药性高转移性乳腺癌4T1/EPB小鼠模型上研究观察治疗效果，为临床上多发的化疗耐药和转移的癌患者的治疗的研究提供实验基础。

相对于现有的研究，本发明研究具有以下优势：

1、本发明制备的疫苗α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)大大提高了上一代纳米铝疫苗α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)对4T1/WT乳腺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤效果，显著延长了小鼠的生存时间；

2、本发明疫苗α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)在4T1/EPB耐药高度转移性乳腺癌荷瘤小鼠能够有效抑制肿瘤生长和肿瘤肺转移并显著延长小鼠生存时间；

3、本发明疫苗α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合Sting激动剂DMXAA或2’3’-c-di-Amp在4T1/EPB耐药高度转移性乳腺癌荷瘤小鼠能够使大部分小鼠肿瘤消退，且肿瘤消退的荷瘤小鼠具有免疫记忆，可以抵抗4T1/EPB肿瘤的再次攻击。

技术效果：相对于现有技术，本发明在原有基础上改变了泛素化蛋白来源，制备获得了具有癌干细胞样耐药肿瘤细胞抗原特异性的泛素化蛋白，诱导了具有癌干细胞样耐药肿瘤细胞特异性的免疫应答，并且联合STING激动剂，大大提高疫苗的治疗效果，尤其是对于耐药转移性癌，治疗效果更加显著。

附图说明

图1：小鼠乳腺癌表阿霉素耐药细胞4T1/EPB的诱导与耐药性鉴定；A.耐药指数的检测；B.耐药相关基因的基因表达水平检测；C.耐药相关基因的蛋白表达水平检测；D.小鼠体内化疗药物敏感性的检测；E.两种肿瘤建立的小鼠模型的转移情况的检测。

图2：小鼠乳腺癌表阿霉素耐药细胞4T1/EPB癌干细胞性的鉴定：A.4T1/EPB癌干细胞表面标志CD44⁺CD24^-/low亚群的检测；B.4T1/EPB癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1(ALDH1)的检测；C.4T1/EPB迁移能力的检测；D.4T1/EPB侵袭能力的检测；E.4T1/EPB致瘤能力的检测。

图3：α-Al₂O₃-His-Vx3-分别从4T1/WT和4T1/EPB细胞中募集泛素化蛋白；A.样品蛋白上样量的检测；B.Ub的表达的检测。

图4：α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗的抗肿瘤效果的检测；A.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗在4T1/WT荷瘤小鼠模型中治疗小鼠的肿瘤生长曲线；B.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗在4T1/WT荷瘤小鼠模型中治疗小鼠的生存时间；C.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗在4T1/WT荷瘤小鼠模型中治疗小鼠的转移情况；D.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗在4T1/EPB荷瘤小鼠模型中治疗小鼠的肿瘤生长曲线；E.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗在4T1/WT荷瘤小鼠模型中治疗小鼠的生存时间；F.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗在4T1/WT荷瘤小鼠模型中治疗小鼠的转移情况。

图5：观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)诱导的免疫应答及其特异性的检测：A.不同免疫后小鼠脾脏细胞中CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺的T细胞的比例；B.不同免疫后小鼠脾脏细胞中CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺的T细胞的比例统计数据；C.不同免疫后小鼠脾脏细胞中IFN-γ水平的检测。

图6：α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗混合Sting激动剂对BMDC的作用的检测：A.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)混合Sting激动剂2’3’-c-di-Amp对BMDC分泌I型干扰素IFN-β的检测；Β.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)混合Sting激动剂DMXAA对BMDC分泌I型干扰素IFN-β的检测。

图7：α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗联合Sting激动剂DMXAA的抗肿瘤效果的检测；A.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)疫苗联合Sting激动剂DMXAA对4T1/EPB荷瘤小鼠治疗的肿瘤生长曲线；B.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)疫苗联合Sting激动剂DMXAA治疗的4T1/EPB荷瘤小鼠的生存时间；C.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)疫苗联合Sting激动剂DMXAA对4T1/EPB荷瘤小鼠治疗的转移情况；D.α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗联合Sting激动剂DMXAA诱导的免疫记忆的检测。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐明本发明。

实施例1癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白的制备

1、小鼠癌干细胞样乳腺癌表阿霉素耐药细胞4T1/EPB的诱导：

(1)表阿霉素耐药细胞4T1/EPB的诱导：

选用表阿霉素(epiricin,EPB)在体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导小鼠4T1乳腺癌细胞(4T1/WT)耐药，4T1/WT，购买于ATCC细胞库，复苏冻存4T1/WT细胞，用含10％(V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养，待到细胞成长到60％左右时，换成加药培养基，从一开始2.0μg/ml的培养基含药浓度逐步递增到到250μg/ml，在37℃、5％(V/V)CO2的恒温培养箱中培养，每3天换液一次，常规0.25％(g/mL)胰蛋白酶消化传代。

(2)诱导后的细胞的IC50检测：

CCK8法检测诱导后的细胞和4T1/WT细胞对EPB的IC50，如图1A所示计算，耐药指数达到35.0，说明诱导后的细胞达到高度耐药，命名为耐表阿霉素耐药细胞株(4T1/EPB)。

2、小鼠乳腺癌表阿霉素耐药细胞4T1/EPB的耐药性鉴定

(1)4T1/EPB的耐药基因的检测：

a)将4T1/WT细胞和4T1/EPB细胞按照常规肿瘤细胞培养方式，分别培养至80％时，消化计数取1×10⁶个细胞用TRIzol提取RNA，制备样本，检测多药耐药基因(MDR1)、谷胱甘肽S-转移酶-π(GST-π)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、基质金属蛋白酶-7(MMP7)的基因表达水平，取1×10⁶个细胞，加入RIPA细胞裂解液冰上作用40，离心后收集上清，取适量上清加入SDS-PAGE loading buffer，电泳后将蛋白转至PVDF膜，加入抗MDR1的抗体和抗BCRP的抗体。4℃孵育过夜，第二天PBST洗膜5次，每次5min，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1h，PBST细胞5次，每次5min，加显色试剂并拍照检测MDR1和BCRP耐药基因的蛋白表达水平。如图1B和图1C所示，4T1/EPB细胞的耐药基因表达水平相比4T1/WT显著增加。

b)在小鼠体内检测4T1/EPB对化疗药物EPB的敏感性：取12只BALB/c雌性6-8周小鼠，分别在它的左右乳垫处接种1×10⁴个4T1/WT和4T1/EPB细胞，此为第0天，在触摸到肿瘤的第3天，随机分成2组，分为生理盐水(NS)对照组和EPB组，小鼠在第7和第14天接受含500μg/500μl的EPB或生理盐水尾静脉治疗，观察两侧肿瘤生长情况。如图1D所示，发现4T1/WT对EPB敏感，肿瘤大小受到明显抑制，而4T1/EPB对EPB不敏感，肿瘤生长没有受到抑制。

c)两种肿瘤建立的小鼠模型的转移情况的检测：取24只BALB/c雌性6-8周小鼠，随机分成2组，第0天分别在两组小鼠乳垫处接种1×10⁴个4T1/WT、4T1/EPB细胞建立两种小鼠肿瘤模型，在触摸到肿瘤的第3天，将4T1/WT组和4T1/EPB组分别再随机分为4组，即接受生理盐水治疗的4T1/WT+NS组和4T1/EPB+NS组，接受EPB治疗的4T1/WT+EPB组和4T1/EPB+EPB组，分别再第7和第14天进行500μg/500μl EPB或生理盐水尾静脉治疗，在第30天安乐死小鼠，观察两种模型中小鼠转移情况，如图1E所示，4T1/WT小鼠模型中小鼠发生转移率为67％，接受EPB治疗的小鼠发生转移率为30％，而4T1/EPB小鼠模型中小鼠发生转移率为100％，接受EPB治疗的小鼠发生转移率为100％，说明4T1/EPB细胞的转移能力比4T1/WT增强，且EPB治疗对且转移抑制几乎没有作用，说明4T1/EPB诱导的小鼠模型是一个多转移性乳腺癌的小鼠模型。

3、小鼠乳腺癌表阿霉素耐药细胞4T1/EPB的癌干细胞性的鉴定

(1)4T1/EPB癌干细胞表面标志的检测：

a)将4T1/WT细胞和4T1/EPB细胞按照常规肿瘤细胞培养方式，分别培养至80％时，消化计数取1×10⁶个细胞按照说明书染色，用流式细胞仪检测符合乳腺癌干细胞表面标志的亚群CD44⁺CD24^-/low亚群，如图2A所示，4T1/WT的CD44⁺CD24^-/low亚群比例为28％，4T1/EPB亚群比例为81％，提示4T1/EPB中富集了干细胞。

(2)4T1/EPB癌干细胞标志物乙醛脱氢酶1(ALDH1)的检测：

将4T1/WT细胞和4T1/EPB细胞按照常规肿瘤细胞培养方式，分别培养至80％时，消化计数取1×10⁶个细胞按照说明书染色，用流式细胞仪检测符合乳腺癌干细胞标志物ALDH1的检测，如图2B所示，4T1/WT的ALDH1阳性表达为0.8％，4T1/EPBALDH1阳性表达为11.6％，提示4T1/EPB中富集了干细胞。

(3)4T1/EPB迁移和侵袭能力的检测：

a)4T1/EPB迁移能力的检测：将4T1/WT细胞和4T1/EPB细胞按照常规肿瘤细胞培养方式，分别培养至80％时，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为7×10³/ml，取出insert放入24孔板中，先加入下室培养基(含血清5％)500μl，insert中加入200μl细胞悬液。将insert放入24孔板中，37℃，36h，染色后拍照统计数，如图2C所示，4T1/EPB的迁移能力相比4T1/WT明显提高；

b)4T1/EPB侵袭能力的检测：用50mg/L基质胶1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。将4T1/WT细胞和4T1/EPB细胞按照常规肿瘤细胞培养方式，分别培养至80％时，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为1×10³/ml，取出insert放入24孔板中，先加入下室培养基(含血清5％)500μl，insert中加入200μl细胞悬液。将insert放入24孔板中，37℃，24h，染色后拍照统计数，如图2D所示，4T1/EPB的侵袭能力相比4T1/WT明显提高；

(4)4T1/EPB致瘤实验的检测：

将4T1/WT细胞和4T1/EPB细胞按照常规肿瘤细胞培养方式，分别培养至80％时，消化计数，分别设置5个梯度(2×10²、2×10³、2×10⁴、2×10⁵、2×10⁶)，每个梯度5只6-8周的BALB/c小鼠，分别在一只小鼠的左边乳垫接种4T1/WT肿瘤，右边乳垫接种4T1/EPB肿瘤，观察每个梯度小鼠成瘤情况。如图2E所示，最少需要2×10⁵个4T1/WT肿瘤细胞才能致小鼠成瘤，而只需200个4T1/EPB肿瘤细胞就能致小鼠成瘤，说明4T1/EPB肿瘤的致瘤能力显著提高，提示4T1/EPB的癌干细胞性增强。

综上所述，已经成功制备癌干细胞样的小鼠乳腺癌表阿霉素耐药细胞株4T1/EPB，且4T1/EPB诱导的小鼠模型是一个多转移性乳腺癌的小鼠模型。

4、α-Al₂O₃-His-Vx3分别从4T1/WT和4T1/EPB细胞中募集泛素化蛋白，制备α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗

(1)肿瘤细胞的处理：分别培养4T1/WT和4T1/EPB细胞，待细胞生长至80％，加入量400nmol/L的硼替佐米和80mmol/L的氯化铵，干预肿瘤细胞166小时，消化肿瘤细胞，用PBS洗三遍后，离心取细胞沉淀，加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂及RP-619的RIPA裂解液低温裂解细胞，抑制泛素化蛋白的降解，冰上放置40分钟，高速低温离心40分钟，取上清，得到富含泛素化蛋白的肿瘤细胞裂解液。

(2)α-Al₂O₃-Vx3纳米颗粒的制备：

a)纳米铝颗粒的制备：称取干燥的纳米铝(α-Al₂O₃)500mg，置于150ml平底试管中，加入1629.39mg三乙氧基硅烷及37.58mL无水乙醇，室温搅拌反应12h，将上述反应产物于15000g，离心10min弃去上清，沉淀用大量无水乙醇洗三次，取上步沉淀加入3.2784mL戊二醛(25％)及20.605mL超纯水，室温搅拌反应2h，将上述反应产物于15000g，离心10min弃去上清，沉淀用大量超纯水洗三次，取沉淀得到α-Al₂O₃；

b)His-Vx3蛋白共价偶联至纳米铝颗粒：复苏转化了His-Vx3表达质粒的大肠杆菌，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，14h后挑取单克隆至含有氨苄青霉素的LB培养液中37℃震荡培养-8h后，吸取1ml接种至100ml LB培养液中，待其生长至对数期加入终浓度100mM的IPTG低温诱导16h，所得菌液低温高速离心得到细菌，PBS洗三次，buffer重悬后加入100μg/ml的溶菌酶冰上作用40min后与超声波破碎仪上作用50min，高速低温离心得到上清，将上清加入镍离子亲和层析柱中4℃摇荡反应过夜，第二天用Washing buffer洗去杂蛋白，Elution buffer洗脱His-Vx3蛋白，将(a)所得的α-Al₂O₃和His-Vx3蛋白4℃搅拌反应过夜，第二天低温高速离心收集纳米铝与His-Vx3蛋白的共价偶联产物(α-Al₂O₃-His-Vx3)；

(3)用α-Al₂O₃-His-Vx3纳米颗粒募集泛素化蛋白，制备α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗：

将(1)中所收集到的4T1/WT和4T1/EPB细胞裂解液分别和(2)得到的α-Al₂O₃-His-Vx34℃共孵育过夜，第二天低温高速离心得到α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)，离心后上清未结合的细胞裂解液也收集。

(4)α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗的鉴定：

将(3)得到的α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)用适量PBS重悬，吸取100μl高速离心后弃去上清，和(1)得到的肿瘤细胞裂解液和(3)得到的未结合的肿瘤细胞裂解液，分别加入100μl SDS-PAGE loading buffer，沸水浴5min，离心取上清SDS-PAGE后，加抗Ub抗体检测所Ub蛋白；结果如图3A所示，条带2、5分别代表4T1/WT和4T1/EPB的总细胞裂解液，条带3、6分别代表4T1/WT和4T1/EPB的未结合细胞裂解液，条带4、7分别代表制备的α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)，12.5％SDS-PAGE电泳染色显示各组样本上样量一致。如图3B所示，条带1、4代表的4T1/WT和4T1/EPB的总细胞裂解液中有一定的Ub蛋白，条带2、5代表的4T1/WT和4T1/EPB的未结合细胞裂解液中Ub蛋白含量很少，条带3、6代表的制备的α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)中Ub蛋白含量最多，明显多于总细胞裂解液和未结合细胞裂解液，说明α-Al₂O₃-His-Vx3在4T1/WT和4T1/EPB中都能够募集到大量的泛素化蛋白，成功制备α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)。

实施例2：分别在4T1/WT和4T1/EPB荷瘤小鼠模型中观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)(图示中简写为UPs(4T1/WT))和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)(图示中简写为UPs(4T1/EPB))的治疗效果

1、在4T1/WT小鼠模型中观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗的治疗效果

第0天在6-8周的雌性BALB/c小鼠的右乳垫处接种1×10³个4T1/WT肿瘤细胞，第5天将小鼠随机分成生理盐水对照组(NS)、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)治疗组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)治疗组这三组，在第5、7、9天治疗三次，观察治疗效果和小鼠生存时间。如图4A所示，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)对4T1/WT肿瘤都有抑制作用，但α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)的抑制肿瘤生长作用更明显，图4B所示二者都显著延长了荷瘤小鼠的生存时间，图4C二者都抑制了肿瘤的转移，综上所述，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)在4T1/WT肿瘤模型中抗肿瘤效果更显著。

2、在4T1/EPB小鼠模型中观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗的治疗效果：

第0天在6-8周的雌性BALB/c小鼠的右乳垫处接种1×10³个4T1/WT肿瘤细胞，第5天将小鼠随机分成生理盐水对照组(NS)、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)治疗组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)治疗组这三组，在第5、7、9天治疗三次，观察治疗效果和小鼠生存时间。如图4D所示，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)对4T1/EPB肿瘤生长的抑制作用不明显，而α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)显著抑制了4T1/EPB肿瘤的生长，如图4E所示，二种疫苗都显著延长了4T1/EPB荷瘤小鼠的生存时间，但α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)的延长效果更好，如图4F所示，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)显著抑制了4T1/EPB荷瘤小鼠的肿瘤转移，而α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)抑制4T1/EPB肿瘤转移不明显，综上所述，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)在4T1/EPB肿瘤模型中抗肿瘤效果更显著。

3、观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)诱导的免疫应答及其特异性的检测：

第0天将9只6-8周的雌性BALB/c小鼠随机分成NS组、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)组，分别在第1、3、5天免疫三次，第12天安乐死小鼠后取小鼠脾脏制备成细胞悬液,5×10³每孔/48孔，体外培养，分别与5×10³灭活的4T1/WT和4T1/EPB肿瘤细胞共培养48h，检测脾脏细胞分泌的IFN-γ水平。如图5A和5B所示，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗免疫后的小鼠脾细胞，在两种灭活的肿瘤细胞共培养下，CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺的T细胞的比例最高，且与其他组相比具有明显的统计差异，如图5C所示，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗免疫后的小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平最高，且与其他组相比具有明显的统计差异，说明α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗能诱导更强的肿瘤耐药细胞特异性免疫应答。

实施例3观察在4T1/EPB的荷瘤小鼠模型上α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合Sting激动剂DMXAA的治疗效果。

1、观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗混合Sting激动剂对BMDC的作用的检测：

按照培养小鼠BMDC的常规方法，取6-8周BALB/c小鼠的腿骨骨髓，用含GM-CSF20ng/ml、IL-4 20ng/ml、10％(V/V)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养，每2天换一次也，在第六天取1×10⁶每孔/48孔铺板，分别设置CM组、LPS阳性对照组、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)混合Sting激动剂2’3’-c-di-Amp(购买来自Invivogen)组或DMXAA(购买来自MCE)组，与BMDC共培养48h，用ELISA检测BMDC分泌的IFN-β水平，如图6Α和图6Β所示，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)混合Sting激动剂，不论是混合2’3’-c-di-Amp或是混合DMXAA组，BMDC分泌的IFN-β水平都显著高于单独使用α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)组和单独使用Sting激动剂组，说明α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合Sting激动剂显著提高BMDC分泌I型干扰素IFN-β的能力，IFN-β能够进一步活化局部的8α⁺DC，活化的CD8α⁺DC在***中向CD8⁺T细胞交叉提呈肿瘤抗原，活化特异性T细胞，进一步发挥抗肿瘤作用。

2、观察在4T1/EPB的荷瘤小鼠模型上α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合Sting激动剂DMXAA的治疗效果，并与α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)对比：

第0天在6-8周的雌性BALB/c小鼠的右乳垫处接种1×10³个4T1/EPB肿瘤细胞，第5天将小鼠随机分成NS组、DMXAA治疗组、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)治疗组、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)联合DMXAA治疗组、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)治疗组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA治疗组这六组，全部接受化疗药EPB500μg的治疗，在第8、10、12天分别治疗三次，观察治疗效果和小鼠生存时间，如图7A所示，单独使用DMXAA治疗组、α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/WT)联合DMXAA组队4T1/EPB肿瘤的生长都有一定的抑制作用，但是抑制作用不明显，单独使用α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)治疗组对4T1/EPB肿瘤的生长有显著的抑制作用，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA组的抗肿瘤效果最明显，这组6只荷瘤小鼠中有5只肿瘤发生消退。如图7B所示，单独使用α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)治疗组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA组较其他组相比显著延长了荷瘤小鼠生存时间。如图7C所示，单独使用α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)治疗组和α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA组显著抑制了荷瘤小鼠的转移，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA组抑制转移的效果最好，综上所述，α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA组进一步提高了α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)疫苗的治疗效果，使4T1/EPB荷瘤小鼠发生消退。

3、观察α-Al₂O₃-His-Vx3-Ub(4T1/EPB)联合DMXAA在小鼠体内诱导的免疫记忆：

选取上述步骤2肿瘤消退的小鼠，作为疫苗组，同等数量未处理的BALB/c雌性小鼠作为对照组，两组接种1×10⁴个4T1/EPB肿瘤细胞，观察肿瘤生长情况。如图7D所示，观察到对照组的小鼠4T1/EPB肿瘤生长，而疫苗组的小鼠抵抗了4T1/EPB肿瘤的再次攻击，未见肿瘤生长。