阅读说明：本技术 一种橡胶草遗传转化方法 (Genetic transformation method for kokstroemia indica ) 是由 彭存智 常丽丽 仝征 王丹 徐兵强 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种橡胶草遗传转化方法,包括:(1)取新疆橡胶草种质的幼嫩叶片,切割处理,放于:MS+1.5～1.6mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖,pH5.8芽诱导培养基中培养；50天后,挑选出适宜组培的橡胶草优异种质；转至:1/2MS+20g/L蔗糖,pH5.8的生根培养基,成为再生橡胶草组培幼苗；(2)取幼苗叶片切割处理,在芽诱导培养基上预培养2天；(3)加入农杆菌侵染液浸染后,转至芽诱导培养基中,黑暗共培养3天；转至含400mg/L Car的芽诱导培养基培养一周；转至MS+1.5～1.6mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+20g/L蔗糖+400mg/L Car和8～10mg/L Hyg,pH5.8筛选培养基上,诱导抗性芽的再生；转至1/2MS+20g/L蔗糖+400mg/L Car和8～10mg/L Hyg,pH5.8新的生根培养基上,得到橡胶草抗性再生植株；本发明的橡胶草遗传转化方法,抗性再生芽诱导率>30％,转基因再生苗植株畸形率低,对转基因橡胶草阳性检出率>90％。(The invention provides a method for genetic transformation of hevea brasiliensis, which comprises (1) cutting young leaves of the germplasm of the hevea brasiliensis, and culturing in an inducing culture medium containing MS + 1.5-1.6 mg/L6-BA +0.1mg/LNAA +20g/L sucrose and pH5.8 bud; after 50 days, selecting excellent germplasm of the rubber grass suitable for tissue culture; transferring to 1/2MS +20g/L sucrose and a rooting culture medium with pH of 5.8 to obtain regenerated hevea brasiliensis tissue culture seedlings; (2) cutting seedling leaves, and pre-culturing on a bud induction culture medium for 2 days; (3) adding agrobacterium infection solution for dip dyeing, transferring to a bud induction culture medium, and culturing in the dark for 3 days; transferring to a bud induction culture medium containing 400mg/L Car for culturing for one week; transferring to a screening culture medium of MS + 1.5-1.6 mg/L6-BA +0.1mg/L NAA +20g/L sucrose +400mg/L Car and 8-10mg/L Hyg at pH5.8 to induce the regeneration of resistant buds; transferring to a new rooting culture medium of 1/2MS +20g/L sucrose +400mg/L Car and 8-10mg/L Hyg, and pH5.8 to obtain a hevea brasiliensis resistance regeneration plant; the genetic transformation method of the hevea brasiliensis has the advantages that the inductivity of the resistant regeneration buds is more than 30%, the plant aberration rate of the transgenic regeneration seedlings is low, and the positive detection rate of the transgenic hevea brasiliensis is more than 90%.)

一种橡胶草遗传转化方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及一种橡胶草遗传转化方法。

背景技术

橡胶草又名俄罗斯蒲公英(Taraxacum kok saghyz Rodin)，为菊科菊苣族蒲公英属植物，原产于哈萨克斯坦、欧洲及我国新疆等地。因橡胶草根部含有高品质的橡胶，含量可达20％以上，而逐渐作为第二天然橡胶资源。

近年来，国内外学者对橡胶草组织培养技术开展了一些研究。例如，以橡胶草叶作为外植体，诱导不定芽或愈伤组织，但由于橡胶草具有自交不亲和的繁殖特点，造成其品系混杂严重的现象。因不同品系之间的组织培养条件和方法存在差异，容易导致其芽诱导率低、再生苗再生能力低等问题，难以用于进行橡胶草的遗传转化，而且在遗传转化的过程中，抗性再生芽诱导率极低，遗传转化周期长，畸形率高，难以有效获得橡胶草转基因株系。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种转化效率高的橡胶草遗传转化方法，抗性再生芽诱导率在30％以上，转基因再生苗植株畸形率低，生长速度快，并且对转基因橡胶草阳性检出率在90％以上。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种橡胶草遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)橡胶草遗传转化的植物材料的筛选和获取

a.收集并挑选新疆橡胶草种质，剪取完整幼嫩叶片，经过灭菌和切割处理后，放置于配方包括：MS+1.5～1.6mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖，pH 5.8的芽诱导培养基中培养；培养28～32天后转移至新的相同培养基中，继续生长20-30天；根据在芽诱导培养基上培养48～52天后再生芽的再生率和生长状态，挑选出适宜组培的新疆橡胶草优异种质；

b.将挑选出的新疆橡胶草优异种质，当株高达到4～6cm时切下，转移至配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖，pH 5.8的生根培养基中培养生根，成为完整的再生橡胶草组培幼苗；

(2)橡胶草外植的体预培养

取橡胶草组培幼苗的叶片经切割处理后，在芽诱导培养基上预培养3天；

(3)抗性的再生橡胶草植株的获取

a.收集预培养的橡胶草外植体，放入无菌的培养瓶中，加入预先制备的农杆菌侵染液，至完全浸没，浸染；

b.将外植体吸干菌液后，转移至芽诱导培养基中，pH 5.2～5.3，在22～23℃，黑暗中共培养3天；取出用无菌水清洗后，用附加395～405mg/L Car的MS液体培养基清洗；再转移至加有395～405mg/L Car的芽诱导培养基中培养一周；

c.将外植体转至配方包括：MS+1.5～1.6mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+20g/L蔗糖+400mg/L Car和8～10mg/L Hyg，pH 5.8筛选培养基上，诱导抗性芽的再生，每2周继代一次；

d.当抗性再生芽生长到3-5cm时，转移至配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖+400mg/LCar和8～10mg/L Hyg，pH 5.8新的生根培养基上培养生根，直至成为完整的抗性的再生橡胶草植株。

进一步说明，步骤(1)和步骤(2)中对叶片的切割处理方法为：将叶片切断为2-3cm长度，每隔0.8～1.2cm横跨叶脉划伤叶片1/2～3/4宽度，叶柄切断为1-1.5cm长度。

进一步说明，步骤(1)中，从30天后橡胶草幼苗中，挑选直径≥1mm的组培苗根系，截取2.8～3.2cm长度，转移至配方为：1/2MS的芽生长培养基中，在根系上萌发不定芽，直至生根形成完整组培幼苗，用于进行二次取嫩叶，作为橡胶草遗传转化的植物材料。有利于长时间保持橡胶草的幼态，保持橡胶草的再生能力，降低畸变率。

进一步说明，步骤(3)中，所述农杆菌侵染液的制备方法，包括如下步骤：

(1)挑取目的基因的农杆菌单菌落到10mL加有相应抗性的YEP培养基中，28℃，200rpm培养过夜；

(2)取1mL过夜培养菌液加到100mL加有同样抗性的YEP培养基中，28℃，200rpm培养10-12h；

(3)用50mL无菌离心管，4℃，6000rpm离心10min收集菌体；用MS液体培养基重悬农杆菌沉淀，4℃，6000rpm离心10min，收集菌体；再用MS液体培养基重悬农杆菌沉淀，并调节OD600为0.6，配制成农杆菌侵染液；所述MS液体培养基配方为：MS+20g/L蔗糖，pH 5.8。

进一步说明，步骤(3)中，所述农杆菌浸染液在浸染前加入终浓度为100mg/L的乙酰丁香酮。

进一步说明，步骤(1)中，芽诱导和生根培养的培养条件为：22℃，光照周期为16小时/天，光照强度1800-2000lux。

进一步说明，步骤(2)和(3)中，所述预培养、诱导抗性芽和生根培养的条件为：22℃，光照周期为16小时/天，光照强度1800-2000lux。

进一步说明，步骤(1)中，所述芽诱导培养基的配方包括：MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖，pH 5.8；所述生根培养基的配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖，pH 5.8。

进一步说明，步骤(3)中，所述筛选培养基的配方包括：MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+400mg/L Car和10mg/L Hyg，pH 5.8。

进一步说明，步骤(3)中，所述新的生根培养基的配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖+400mg/L Car和10mg/L Hyg，pH 5.8。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过新疆橡胶草优异种质的筛选，得到再生能力强的橡胶草再生苗，用于进行遗传转化，并进行橡胶草不同浓度潮霉素抗性筛选，提高抗性再生芽诱导率，实现了转化率高、畸形率低的橡胶草遗传转化。具有以下特点：

1.筛选出的新疆橡胶草优异种质，具有种子发芽率高，同批种子中发芽率达到100％；生长速度快，持续生长活性强，叶片不易衰老；芽诱导率高、再生能力强，再生苗形成效率高的特点，有利于遗传转化。

2.在遗传转化的过程中，转化效率高，抗性再生芽诱导率在30％以上；遗传转化周期短，从农杆菌侵染到获得完整转基因再生苗只需约3个月；转基因再生苗植株形态完整，畸形率低；转基因再生苗活力旺盛，生长速度快；转基因再生苗扩繁效率高，容易获得转基因株系。

3.在筛选抗性再生芽的芽诱导培养基中，未能成功遗传转化的外植体诱导再生的愈伤组织和幼芽具有多个表现症状：(1)生长严重受到抑制；(2)易玻璃化；(3)幼苗叶片尖部易褐化坏死。根据这些特征，便可以很容易将未能成功遗传转化的再生芽直接剔除，最终转基因橡胶草阳性检出率在90％以上。

附图说明

图1为本发明实施例筛除的适宜组培的新疆橡胶草优异种质；

图2为本发明实施例橡胶草遗传转化的外植体；

图3为本发明实施例橡胶草外植体在筛选培养基上生长第一周；

图4为本发明实施例橡胶草外植体在筛选培养基上生长第三周；

图5为本发明实施例橡胶草外植体在筛选培养基上生长50天；

图6为本发明实施例橡胶草外植体在筛选培养基上生长75天；

图7为本发明实施例转基因橡胶草株系扩繁；

图8为本发明实施例转基因橡胶草外源DNA的PCR检测电泳图；

图9为本发明实施例不同浓度潮霉素处理橡胶草30天后丛生芽的再生情况。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1-一种橡胶草遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)橡胶草遗传转化的植物材料的筛选和获取

a.收集并挑选新疆橡胶草种质，剪取完整幼嫩叶片，经过灭菌后，将叶片切断为2-3cm长度，每隔0.8～1.2cm横跨叶脉划伤叶片1/2～3/4宽度，叶柄切断为1-1.5cm长度，放置于配方包括：MS+1.6mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖，pH 5.8的芽诱导培养基中培养；培养30天后转移至新的相同培养基中，继续生长20-30天；根据在芽诱导培养基上培养50天后再生芽的再生率和生长状态，挑选出适宜组培的新疆橡胶草优异种质；

b.将挑选出的新疆橡胶草优异种质，当株高达到4～6cm时切下，转移至配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖，pH 5.8的生根培养基中培养生根，成为完整的再生橡胶草组培幼苗；

c.从30天后橡胶草幼苗中，挑选直径≥1mm的组培苗根系，截取2.8～3.2cm长度，转移至配方为：1/2MS的芽生长培养基中，在根系上萌发不定芽，直至生根形成完整组培幼苗，用于进行二次取嫩叶，作为橡胶草遗传转化的植物材料。

(2)橡胶草外植的体预培养

取橡胶草组培幼苗的叶片切断为2-3cm长度，每隔0.8～1.2cm横跨叶脉划伤叶片1/2～3/4宽度，叶柄切断为1-1.5cm长度，在芽诱导培养基上预培养2天；

(3)抗性的再生橡胶草植株的获取

a.收集预培养的橡胶草外植体，放入无菌的培养瓶中，加入预先制备的农杆菌侵染液，至完全浸没，浸染30分钟；

b.将外植体吸干菌液后，转移至芽诱导培养基中，pH5.2，在22～23℃，黑暗中共培养3天；取出用无菌水清洗后，用附加400mg/L Car的MS液体培养基清洗；再转移至加有400mg/L Car的芽诱导培养基中培养一周；

c.将外植体转至配方包括：MS+1.6mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+400mg/LCar和8mg/L Hyg，pH 5.8筛选培养基上，诱导抗性芽的再生，每2周继代一次；

d.当抗性再生芽生长到3-5cm时，转移至配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖+400mg/LCar和8mg/L Hyg，pH5.9新的生根培养基上培养生根，直至成为完整的抗性的再生橡胶草植株。

根据上述的遗传转化方法，筛选出的橡胶草种质的发芽率为100％，在遗传转化的过程中，抗性再生芽诱导率为32.6％，并且最终转基因橡胶草阳性检出率在92.3％，转基因再生苗植株形态完整，畸形率低，生长速度快，转基因再生苗扩繁效率高，可快速获得转基因株系。

实施例2-一种橡胶草遗传转化方法，根据实施例1的转化方法，区别在于，步骤(1)中，芽诱导和生根培养的培养条件为：22℃，光照周期为16小时/天，光照强度1800-2000lux；步骤(2)和(3)中，所述预培养、诱导抗性芽和生根培养的条件为：22℃，光照周期为16小时/天，光照强度1800-2000lux。

根据上述的遗传转化方法，筛选出的橡胶草种质的发芽率为100％，在遗传转化的过程中，抗性再生芽诱导率为33.8％，并且最终转基因橡胶草阳性检出率在93.4％，转基因再生苗植株形态完整，畸形率低，生长速度快，转基因再生苗扩繁效率高，可快速获得转基因株系。

实施例3-一种橡胶草遗传转化方法，根据实施例1的转化方法，区别在于，步骤(1)中，所述芽诱导培养基的配方包括：MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖，pH 5.8；所述生根培养基的配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖，pH 5.8；

步骤(3)中，所述筛选培养基的配方包括：MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+400mg/L Car和10mg/L Hyg，pH5.8；所述新的生根培养基的配方包括：1/2MS+20g/L蔗糖+400mg/L Car和10mg/L Hyg，pH5.8。

根据上述的遗传转化方法，筛选出的橡胶草种质的发芽率为100％，在遗传转化的过程中，抗性再生芽诱导率为35.1％，并且最终转基因橡胶草阳性检出率在96％，转基因再生苗植株形态完整，畸形率低，生长速度快，转基因再生苗扩繁效率高，可快速获得转基因株系。

实施例4-一种橡胶草遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)橡胶草遗传转化的植物材料的筛选和获取

a.收集并挑选生长状态茂盛的新疆橡胶草种质，剪取橡胶草完整幼嫩叶片置于烧杯中，用流水冲洗干净，75％乙醇处理30秒，无菌水洗涤1次；再采用1％次氯酸钠溶液，在摇床上以60rpm处理20分钟，无菌水洗涤5次，每次5min；

b.在无菌滤纸上将叶片用刀片切断为2-3cm长度，每隔1cm横跨叶脉划伤叶片2/3宽度，叶柄则切断为1-1.5cm长度；

c.将植物材料放置在芽诱导培养基(MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+20g/L蔗糖，pH 5.8)上生长；培养条件为22℃，光照周期为16小时/天，光照强度为1800-2000lux；培养30天后转移至新的相同培养基中，继续生长20-30天；

d.根据在芽诱导培养基上培养50天后，再生芽的再生率和生长状态，包括植株长度、叶片绿色程度、玻璃化程度及再生芽的诱导率，挑选出了适宜组培的新疆橡胶草优异种质12-16；

橡胶草组培优异种质的筛选标准为：

I级再生芽：优，颜色为淡绿-绿色，叶长>3cm，无玻璃化；

II级再生芽：良，颜色为淡绿-绿色，3cm>叶长>1.5cm，无玻璃化；

III级再生芽：中，颜色为淡绿-绿色，1.5cm>叶长>0.5cm，无玻璃化；

IV级再生芽：差，颜色为黄色或褐色，叶长<0.5cm，或玻璃化；

观察时间为第二次继代培养后20-25天，其中，新疆橡胶草种质12-16的外植体总数为54，I级再生芽占比为80％，IV级再生芽为0；再生芽诱导率为89.36％；

e.当株高达到5cm时切下，转移到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖，pH5.8)中培养生根(一般10天左右萌发出根)，成为完整的再生幼苗，作为橡胶草遗传转化的植物材料，如图1所示。

f.从30天后橡胶草幼苗中，挑选直径≥1mm的生长旺盛的组培苗根系，用刀片截取2.8～3.2cm长度，转移至配方为：1/2MS的芽生长培养基中，10天后，在根系上萌发不定芽，直至生根形成完整组培幼苗；这样长出的芽不易畸变，可长时间保持橡胶草的幼态，保持橡胶草的再生能力，用于进行二次取嫩叶，作为橡胶草遗传转化的植物材料。

(2)橡胶草外植体的预培养

如图2所示，取橡胶草组培幼苗的叶片，在无菌滤纸上用刀片切断为2-3cm长度，每隔1cm横跨叶脉划伤叶片2/3宽度，叶柄则切断为1-1.5cm长度；放置在芽诱导培养基上预培养2天，培养条件为22℃，光照周期为16小时/天，光照强度为1800-2000lux。

(3)农杆菌侵染液的制备

挑取目的基因的农杆菌单菌落到10mL加有相应抗性的YEP培养基中，28℃，200rpm培养过夜；

取1mL上述菌液加到100mL加有相应抗性的YEP培养基中，28℃，200rpm培养10-12h；

用50mL无菌离心管，4℃，6000rpm离心10分钟收集菌体。用MS液体培养基(MS+20g/L蔗糖，pH 5.8)重悬农杆菌沉淀，4℃，6000rpm离心10min，收集菌体；用MS液体培养基重悬农杆菌沉淀并调节OD600为0.6，配制成为农杆菌侵染液。

(4)抗性的再生橡胶草植株的获取

a.收集预培养的橡胶草外植体，放入无菌的培养瓶中，加入农杆菌侵染液(已添加终浓度为100mg/L的乙酰丁香酮)至完全浸没，在室温下浸染30min，期间轻微震荡，保证外植体和侵染液充分接触；

b.将外植体放在无菌滤纸上尽量吸干菌液后，转移到装有芽诱导培养基的培养皿中，pH5.2，在22℃，黑暗中共培养3天；取出外植体用无菌水快速清洗3-5遍，再用附加400mg/L羧苄青霉素(Car)的MS液体培养基充分清洗5min，放在无菌滤纸上吸干水份；再转移到添加400mg/L Car的芽诱导培养基上培养一周，培养条件为22℃，光照周期为16小时/天，光照强度为1800-2000lux；

c.将外植体转移到筛选培养基上(MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+20g/L蔗糖+400mg/L Car和10mg/L Hyg，pH 5.8)，诱导抗性芽的再生，每2周继代一次，培养条件为22℃，光照周期为16小时/天，光照强度为1800-2000lux；如图3～6所示；橡胶草外植体在筛选培养基上生长第一周，部分外植体开始褐化坏死；在筛选培养基上生长第三周，外植体大部分面积褐化坏死，诱导芽长约1-3mm；在筛选培养基上生长50天，诱导芽长约5-10mm；在筛选培养基上生长75天，诱导芽长约3-5cm；

d.当抗性再生芽生长到3-5cm时；转移到新的生根培养基上(1/2MS+20g/L蔗糖+400mg/L Car和10mg/L Hyg，pH 5.8)培养生根；培养条件为22℃，光照周期为16小时/天，光照强度为1800-2000lux；直至成为完整的抗性的再生橡胶草植株，如图7所示。

如图8所示，转基因橡胶草外源DNA的PCR检测电泳图；M：Marker；1-34：转基因橡胶草；+：阳性质粒对照；-：野生型橡胶草；

根据上述的遗传转化方法，筛选出的橡胶草种质的发芽率为100％，在遗传转化的过程中，抗性再生芽诱导率为37.2％，并且最终转基因橡胶草阳性检出率在98％，转基因再生苗植株形态完整，畸形率低，生长速度快，转基因再生苗扩繁效率高，可快速获得转基因株系。

对比实验组1-根据实施例4的转化方法，在橡胶草遗传转化的植物材料的筛选的过程中，进行不同橡胶草芽诱导培养基的配方的筛选，并统计不同外植体出芽率，结果如下：

橡胶草芽诱导培养基的配方为：

配方一：MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，蔗糖20g/L；Agar 7-8g/L；PH5.8；

配方二：MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，蔗糖20g/L；Agar 7-8g/L；PH5.8；

配方三：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA，蔗糖20g/L；Agar 7-8g/L；PH5.8；每组设3个重复；

由上表可知，采用橡胶草芽诱导培养基的配方为：MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA进行芽诱导培养，其平均出芽率明显提高，有利于进行种质的筛选，即，根据再生芽的生长状态，包括植株长度、叶片绿色程度、玻璃化程度及再生芽的诱导率，挑选出了适宜组培的新疆橡胶草优异种质。

对比实验组2-根据实施例4的转化方法，在遗传转化的过程中，进行橡胶草不同浓度潮霉素抗性筛选，在筛选培养基中的浓度分别为：8mg/L、10mg/L、12mg/L、14mg/L、16mg/L、18mg/L，并统计采用潮霉素处理橡胶草外植体30天后，外植体的生长状况，结果如下：

由上表可知，由16-18mg/L潮霉素处理组中外植体全部褐化死亡；由8-10mg/L潮霉素处理组中有少量丛生芽再生，但丛生芽的生长受到明显抑制，丛生芽平均长度<5mm。12-14mg/L潮霉素处理组中丛生芽的再生明显下降，丛生芽的生长受到更严重的抑制，在12mg/L潮霉素处理组中丛生芽已基本无法正常再生，如图9所示，不同浓度潮霉素处理橡胶草30天后丛生芽的再生情况，潮霉素浓度A:8mg/L；B:10mg/L；C:12mg/L；D:14mg/L；E:16mg/L；F:18mg/L，当潮霉素浓度低于8mg/L时，则无法有效区分成功遗传转化和未成功遗传转化的再生苗，最终转基因橡胶苗的阳性检出率低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。