阅读说明：本技术 一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根遗传转化体系的建立及优化方法 (Method for establishing and optimizing agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation system of middle caragana hairy roots ) 是由 万永青 柳金华 杨闯 李国婧 王瑞刚 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根遗传转化体系的建立及优化方法,选取生长良好的中间锦鸡儿幼苗,选取下胚轴较粗壮的植株进行注射农杆菌悬浮液进行侵染,侵染后选取中间锦鸡儿毛状根检测GUS基因表达情况。毛状根遗传转化体系使基因在中间锦鸡儿毛状根中过量表达,操作简单,表达水平高,可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持；而且待毛状根长到一定大小后切除主根,这时毛状根取代主根成为该中间锦鸡儿植株的一部分及形成转基因毛状根与原植株茎叶的嵌合体,在研究基因功能时,由于植物是个有机的整体,在处理植物根部时,植物整个植株都可能会发生相关形态及生理生化变化,有利于在整体条件下研究基因功能。(The invention belongs to the technical field of plant genetic engineering, and particularly relates to a method for establishing and optimizing an agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root genetic transformation system of caragana intermedia. The hairy root genetic transformation system enables the gene to be over-expressed in the hairy root of the caragana intermedia, has simple operation and high expression level, and can provide technical support for developing gene function verification and screening functional genes; and when the hairy root grows to a certain size, the main root is cut off, and the hairy root replaces the main root to become a part of the middle caragana plant and form a chimera of the transgenic hairy root and the stem and leaf of the original plant.)

一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根遗传转化体系的建 立及优化方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根遗传转化体系的建立及优化方法。

背景技术

相比户外田间种植的传统农作物或者转基因作物，毛状根组织始终处于人工可控的封闭环境中，产生基因漂移的风险大大降低；能快速生长，在培养过程中会高速增殖；发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。与根癌农杆菌相比，发根农杆菌产生的毛状根遗传性能稳定，许多双子叶植物通过发根体系而得到可遗传的转基因植株；此外，毛状根能在培养基中产生代谢产物，为提取和分离提供了便利的条件。发根农杆菌由于其侵染植物后会使多数种类植物生根，故在多种植物中已经应用，但由于其生根条件要求严格，故只在珍贵药材人参等中进行生产应用较多。

中间锦鸡儿(Caragana intermedia Kuang.)属于豆科灌木，主要分布于我国内蒙古、宁夏及陕西北部的干旱半干旱的荒漠地区。锦鸡儿属植物具有抗寒、抗旱、耐盐碱、耐瘠薄等特点，对沙漠地区有很强的适应能力，既保持水土、防风固沙，还有较高的饲用价值。因而迫切需要对其基因功能进行研究从而发掘其抗逆机制。但是，不像一些模式植物如拟南芥，烟草，水稻等已经具有成熟的遗传转化体系，在中间锦鸡儿中由于缺乏再生体系和转基因技术，急切需要在中间锦鸡儿中建立一种基于转基因毛状根的基因功能验证方法。

目前，豆科植物的毛状根遗传转化体系的研究还比较少，构建成功的例子也不是很多，研究较多的豆科植物有大豆及木豆等，而中间锦鸡儿毛状根遗传转化体系现今还没有人进行系统的研究。目前，植物毛状根遗传转化方法主要结合组培技术进行，遗传转化效率相对较高，但操作过程中注意事项多，操作相对繁琐，还具有污染的可能性，故实践应用具有一定的难度；而本发明创建的一种在植株上直接进行发根农杆菌侵染的方法，简单易行，不用担心染菌的问题，提高了转基因毛状根应用的可能性。另外，这种植株直接被发根农杆菌侵染所产生的毛状根已经经过验证为转基因阳性根，可用于基因功能及代谢物等的相关研究。

发明内容

本发明的目的是建立一种在中间锦鸡儿毛状根中实现基因表达的方法，用于基因的功能验证研究。通过以下技术方案来实现：

(1)将含有GUS报告基因的表达载体电转化入农杆菌K599感受态细胞中；

(2)将(1)中得到的农杆菌以及不含有任何外源载体的农杆菌K599在LB液体培养基培养至所需浓度(OD值表示)。

(3)选取生长6～9d左右的生长良好的中间锦鸡儿幼苗，将(2)制备所得的农杆菌液缓慢的注射入中间锦鸡儿子叶节及其营养土之上的下胚轴部位。

(4)转化后21～28d时间内观察中间锦鸡儿毛状根生长状况及检测GUS报告基因表达情况。

所述步骤(1)具体为：所用到的含有GUS报告基因表达载体为pCambia1305.2(实验室保存)，农杆菌K599(上海唯地生物技术有限公司)。K599发根农杆菌含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围，同时具有链霉素抗性。

所述步骤(2)具体为：将携带有pCambia1305.2载体和无任何外源载体的农杆菌K599接种到4mL LB 液体培养基(Tryptone 1g，Yeast extract 0.5g，NaCl 1g，NaOH或HCl调pH值至7.0，去离子水定容到100 mL，121℃高压灭菌20min)；其中，LB液体培养基含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL链霉素。28℃， 200rpm振荡过夜培养至OD₆₀₀值为1.2左右，取1mL菌液再次转接到20mL新鲜的LB液体培养基中(体积比为1:20)，28℃，200rpm振荡培养至OD600值为1.2，随后加入终浓度为100μmol/mL的乙酰丁香酮。

所述步骤(3)具体为：在正常生长条件下，选取生长6～9d的生长良好的中间锦鸡儿幼苗，选取下胚轴较粗壮的植株进行注射。使用1mL针管吸取加入乙酰丁香酮后静置24h的农杆菌悬浮液，吸满后适当力度按压针管，在下胚轴部位扎孔注射菌液，确保菌液注射到所扎孔中且所扎孔与下胚轴尽量垂直。每隔 24h进行1次注射，共进行3次注射，每次注射完都暗处理24h，共暗处理3d。

所述步骤(4)具体为：侵染后，保持培养湿度为75％左右，温度为25℃左右，在21～28d天时间内选取中间锦鸡儿毛状根检测GUS基因表达情况。随后将叶片放入GUS染色液中染色。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过注射K599农杆菌侵染方式使基因在中间锦鸡儿毛状根中过量表达，这种方法操作简单，表达水平高而且结果可靠，可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持；而且待毛状根长到一定大小后切除主根，这时毛状根取代主根成为该中间锦鸡儿植株的一部分及形成转基因毛状根与原植株茎叶的嵌合体，在研究基因功能时，由于植物是个有机的整体，在处理植物根部时，植物整个植株都可能会发生相关形态及生理生化变化，与瞬时表达相比，有利于在整体条件下研究基因功能。

2、本发明是以不同浓度菌液为探索初始条件，同时从不同浓度的乙酰丁香酮中，选择效果最好的浓度为100μmol/mL的乙酰丁香酮辅助农杆菌的侵染，增加了农杆菌侵染效率，另外，通过增加注射次数进一步提高毛状根的生根效率。综上，通过不同条件摸索最终确定了毛状根最佳遗传转化效率。

附图说明

图1：植物表达载体pCambia1305.2的结构示意图。

图2：pCambia1305.2载体的PCR验证结果，其中1～10为引物①扩增结果，11～20为引物②扩增结果。

图3：生长7天大小的中间锦鸡儿幼苗以及注射法侵染中间锦鸡儿下胚轴，其中，a为生长7天大小的中间锦鸡儿幼苗，b为注射法侵染中间锦鸡儿下胚轴过程。

图4：注射后下胚轴与未注射前下胚轴之间的差别。

图5：注射侵染后生长不同时间的中间锦鸡儿。

图6：注射侵染后中间锦鸡儿GUS染色情况。

具体实施方式

实施例1将pCambia1305.2表达载体电转化入农杆菌K599感受态

(一)实验方法

(1)取出pCambia1305.2质粒并化冻，置于冰上。清洗电极杯(电极杯需要用75％乙醇浸泡10min，再用100％乙醇浸泡10min，清水洗净，通风橱吹干)。

(2)从-80℃冰箱中取出农杆菌K599感受态细胞，置于冰上，化冻。

(3)将1μL质粒加入到感受态细胞中，轻弹混匀，然后用剪过并灭菌的枪头将全部农杆菌吸出加入到预冷的电极杯中(U＝1400V，T＝5.4～5.8ms)。

(4)将所有转化液吸出，加入到含有800μL LB液体培养基的1.5mL EP管中，28℃，160rpm振荡培养2h。

(5)吸取50μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素的双抗性平板中，28℃倒置培养36～48h。

(6)挑取平板上单菌落，菌落PCR鉴定表达载体是否成功的转入农杆菌K599中。PCR引物设计根据pCambia1305.2载体上35S启动子以及GRP-GusPlus编码基因等2条序列设计，共设计2对引物，其中，引物①设计位置为35S启动子处，扩增目的片段长度为884bp；引物②设计位置为GRP-GusPlus 编码基因处，扩增目的片段长度为1023bp。

(2)实验结果

如图2所示，共挑取20个农杆菌K599单克隆，检测发现，2对不同的引物均能扩增出片段大小符合目的片段大小的条带，说明pCambia1305.2载体已经转入农杆菌GV3101中。将鉴定正确的农杆菌加入4mL LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养16～24h，保种，贮存于-80℃备用。

实施例2农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根遗传转化体系的优化

(一)实验方法

(1)中间锦鸡儿的种植与选取

中间锦鸡儿种子采自内蒙古呼和浩特市和林县以及四子王旗。挑选籽粒饱满、无虫眼儿的种子播种于营养土与蛭石(V:V＝1:3)的钵子中，培养于25℃、16h光照/8h黑暗的温室中。选取生长7d左右并且长势健康的中间锦鸡儿幼苗进行注射(图3)。

(2)含有表达载体的农杆菌菌悬液的制备

以pCambia1305.2载体(图1)上携带的GUS基因为报告基因，优化转化体系。将该载体电转化入农杆菌K599感受态细胞中，将鉴定为阳性克隆的农杆菌接种到4mL LB液体培养基中(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素)，28℃，200rpm过夜摇菌。次日，一部分菌液保种，保种的步骤为：取1mL 菌液于1.5mL EP管中，4000rpm离心2min，弃上清，加入800μL新鲜LB液体培养基以及200μL 75％甘油，混匀，液氮速冻并放于-80℃冰箱中长期保存。另一部分菌液扩大培养，将0.5～1mL菌液再次转接到20mL LB液体培养基中(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL链霉素)，28℃，200rpm摇菌，检测 OD₆₀₀＝0.6～1.8。，此外，还加入终浓度为100μmol/mL的乙酰丁香酮作为诱导剂，充分混匀)，室温黑暗静置24h后进行注射。其中，100mmol/L乙酰丁香酮配制：称取0.3924g乙酰丁香酮，溶解10mL DMSO 内，待其完全溶解后用超纯水定容至20mL，分装至1mL离心管内，-20℃保存备用。

(3)注射法侵染中间锦鸡儿下胚轴

注射时，尽量在光线较暗的位置进行，目的是为了农杆菌中Vir基因能更好地受到乙酰丁香酮的诱导，此外，黑暗的环境更有利于农杆菌菌体细胞与植物细胞相互作用。使用1mL一次性无针头注射器，吸满农杆菌悬浮液后，按压注射器，在下胚轴部位将农杆菌悬浮液注入(图3)。侵染完后，将植物置于黑暗保湿条件下培养3天。从侵染后第14天开始观察及剪取毛状根进行GUS染色，染色14～16h后进行拍照。

其中，GUS染色液配方如下：

(1)0.2M NaH₂PO₄·2H₂O：称取1.56g，用无菌水定容至50mL；

(2)0.2M Na₂HPO₄：称取1.42g，用无菌水定容至50mL；

(3)0.1M K₃Fe(CN)₆：称取0.82g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；

(4)0.1M K₄Fe(CN)₆·3H₂O：称取1.05g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；

(5)100mg/ml X-GLUC：称取5mg X-GLUC，用50μL二甲基甲酰胺溶解，4℃避光保存；100mg/ml X-GLUC现用现配。

配制100mL GUS缓冲液：

配制好后可4℃避光保存2个月，保存时间不宜过长。

GUS染色液：

100mL GUS缓冲液中加入500μL 100mg/mL X-GLUC，现用现配。

GUS组织化学染色方法：

GUS染色在37℃培养箱中进行，时间为14～16h。肉眼观察GUS染色情况并拍照。

(二)实验结果

结果显示：侵染14天后(图5)，在中间锦鸡儿下胚轴上能够清晰的观察到注射的痕迹，注射部位彭大或形成愈合的伤口。侵染21天后(图5)，在中间锦鸡儿注射部位产生了0.5cm左右的毛状根，侵染28 天后(图5)，在中间锦鸡儿注射部位产生了更长的且具有分支的毛状根。为了提高转化效率，本发明首先设置不同菌液浓度(OD₆₀₀值分别为0.3，0.6，1.2)，对生长7天左右的中间锦鸡儿幼苗下胚轴进行注射，并对结果进行了观察统计，结果表明，OD₆₀₀值分别为0.6是可以诱导产生较多的毛状根，百分比为16.7％。此外，在不同菌液浓度(OD₆₀₀值分别为0.6，1.2)中分别加入不同浓度乙酰丁香酮(0，100，200μmol/mL) 对结果进行了观察统计，结果表明，菌液浓度OD值为1.2且乙酰丁香酮浓度100μmol/mL可以诱导产生较多毛状根，百分比为52.8％。如图6所示，在侵染后14～28天，各种侵染条件下均检测到明显的GUS 报告基因的表达的毛状根。这些结果说明，当前条件下，加入100μmol/mL乙酰丁香酮的OD₆₀₀值为1.2 的菌液注射侵染中间锦鸡儿下胚轴的效果是最好的。以上实验均进行3次生物学重复。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。