一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用
阅读说明：本技术 一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用 (Haematococcus pluvialis chloroplast expression system and application thereof ) 是由 崔玉琳 王寅初 任庆敏 王康 任家利 焦绪栋 秦松 于 2019-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物基因工程技术领域,是一种构建雨生红球藻叶绿体表达系统的方法。以雨生红球藻叶绿体基因组上SEQ ID NO:1所示序列和SEQ ID NO:2所示的序列为同源臂,以SEQ ID NO:3所示的序列、SEQ ID NO:4所示的序列为启动子,以SEQ ID NO:5所示的序列、SEQ ID NO:6所示的序列为终止子,以<I>bar</I>基因为筛选标记基因构建同源重组载体,并利用基因枪法将载体导入雨生红球藻细胞,经除草剂草丁膦筛选获得转基因藻株。采用本发明的雨生红球藻叶绿体稳定表达系统,可实现外源基因在叶绿体中稳定表达。(The invention relates to the technical field of biological genetic engineering, in particular to a method for constructing a haematococcus pluvialis chloroplast expression system. Taking the sequence shown in SEQ ID NO. 1 and the sequence shown in SEQ ID NO. 2 on the haematococcus pluvialis chloroplast genome as homologous arms, taking the sequence shown in SEQ ID NO. 3 and the sequence shown in SEQ ID NO. 4 as promoters, taking the sequence shown in SEQ ID NO. 5 and the sequence shown in SEQ ID NO. 6 as terminators, and taking the sequence shown in SEQ ID NO. 6 as terminators bar The gene is used as a screening marker gene to construct a homologous recombinant vector, the vector is introduced into haematococcus pluvialis cells by using a gene gun method, and a transgenic alga strain is obtained by screening a herbicide glufosinate. The stable expression system of haematococcus pluvialis chloroplast can realize the stable expression of exogenous genes in the chloroplast.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用。
背景技术
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，隶属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。虽然雨生红球藻是单细胞生物，其生活史却很复杂。通常其生长过程分为两个阶段，即游动细胞和不动细胞。游动细胞呈卵形或椭圆形，大小从5 μm左右到20-30 μm不等。原生质体和细胞壁之间存在较大的空间，二者通过很多分枝或不分枝的细胞质连丝相连，其间的空隙充满透明胶样物质。原生质体呈卵形，前端常呈***状突起。游动细胞具有两条顶生、等长鞭毛，鞭毛通过前端的叉状胶质管伸出细胞壁，在体外的长度约等于细胞体长。细胞核位于细胞中央，细胞核附近的一侧有一个眼点。叶绿体呈杯状、复杂的网状或颗粒状，具有典型的绿藻蛋白核。细胞壁由两层组成，内层主要是纤维素，外层为果胶质。游动细胞多呈绿色。不动细胞呈圆形，无鞭毛，不会游动，细胞大小变化幅度较大，平均直径为 20-30 μm。
雨生红球藻的营养繁殖为细胞***，产生 2、4、8，甚至更多个子细胞。无性生殖为环境不良时，发育成厚壁孢子。对有性繁殖的存在及类型则一直存在争议。雨生红球藻有三种营养生长类型：(1)光合自养型，即利用光能吸收二氧化碳进行光合自养生长；(2)异养生长型，利用有机碳源如醋酸盐在黑暗条件下进行异养生长，但在在完全异养条件下生长，其生长速率、最大生物量都要低于光合自养与兼养方式；(3)混合营养型，即在光照条件下同时利用有机碳源和二氧化碳进行混合营养生长。在光照条件下加入醋酸钠，能明显促进雨生红球藻的生长，其生长速率约为光自养生长与异养生长速率之和。
雨生红球藻在胁迫或诱导条件下能大量积累类胡萝卜素，含量可占其干重的2%-5%，其中 80%以上为经济价值很高的虾青素。雨生红球藻被认为是虾青素的最佳来源。尽管利用雨生红球藻生产虾青素具有广阔的发展前景，但在应用开发上还有许多关键技术和问题需要突破，如雨生红球藻对培养环境要求高、容易污染杂菌杂藻等；虾青素积累与生物量积累之间的矛盾等等。
利用遗传转化的方法来改良雨生红球藻的性状，是解决这些问题的一个重要途径。目前雨生红球藻的细胞核转化系统已经通过基因枪法、电击转化法以及农杆菌转染法构建完成，但是由于雨生红球藻基因组序列尚未完全测序，其结构复杂程度远大于大部分绿藻，使得细胞核转化系统的使用较困难，存在许多难题，如：难以定点突变，难以实现多个外源基因的表达，外源基因变异率高等。这种情况下，开发雨生红球藻叶绿体转化系统势在必行。
雨生红球藻含一个杯型叶绿体，其叶绿体基因组非常大，约1.1G。与其他红球藻叶绿体基因组相似，雨生红球藻叶绿体中基因分布非常分散，并且含有内含子的结构，且目前尚未发现多顺反子的结构。以上现象表明雨生红球藻叶绿体具有一些真核性质，原核表达特征的叶绿体转化系统是否适用尚未可知。目前尚未有该藻叶绿体表达系统的研究报道，这严重阻碍了该藻的进一步研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种雨生红球藻叶绿体表达系统，表达系统包括同源臂，启动子和终止子，同源臂含SEQ ID NO:1 所示序列的上游同源臂和SEQ ID NO:2所示序列的下游同源臂。
所述同源臂间***选择标记基因。
所述上游同源臂与下游同源臂间***至少一个启动子和终止子
所述重组空载体依次含上游同源臂、至少一个启动子、选择标记基因、至少一个终止子和下游同源臂。
所述启动子为调控外源基因的启动子；或，调控外源基因的启动子和调控选择标记基因的启动子；其中，启动子为SEQ ID NO:3所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:4所示的碱基序列。
所述终止子为调控外源基因的终止子；或，调控外源基因的终止子和调控选择标记基因的终止子；其中，终止子为SEQ ID NO:5所示的碱基序列和/或SEQ ID NO:6所示的碱基序列。
所述选择标记基因为草丁膦抗性基因bar基因。
所述上游同源臂为SEQ ID NO:1所示碱基序列所示；或，SEQ ID NO:1所示的序列3’端开始，向5’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段；
所述下游同源臂为SEQ ID NO:2所示碱基序列所示；或，SEQ ID NO:2所示的序列5’端开始，向3’端延伸至不小于 500 bp 的连续片段。
一种雨生红球藻叶绿体表达系统在雨生红球藻叶绿体中转化的应用。
具体为：将外源基因导入至所述构建的空载体中，而后再将其利用基因枪转化法将所述载体导入雨生红球藻，基因枪轰击压力为650psi，轰击距离为9 cm；转化后的雨生红球藻用除草剂草丁膦进行筛选。
本发明方法成功构建了雨生红球藻的叶绿体稳定表达系统。通过本发明能够有效的将外源基因重组到雨生红球藻的叶绿体基因组中，并通过筛选获得转基因藻株。与现有技术相比，本发明实现了雨生红球藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果：
1、本发明提供利用基因枪法转化雨生红球藻叶绿体的技术参数。
2、本发明提供雨生红球藻叶绿体转化的筛选标记基因。利用此方法筛选的雨生红球藻突变株假阳性率比常规抗生素筛选标记要低很多。
3、本发明提供两段雨生红球藻叶绿体基因组片段，用于构建雨生红球藻叶绿体转化载体。在雨生红球藻叶绿体基因组中，这两个片段是直接相连的并且具有两个拷贝，分别位于叶绿体基因组的两个反向重复区内。在这两个片段间***外源基因，会增加同源重组的机率，同时外源基因的***不影响其他基因的表达和功能。
4、本发明提供雨生红球藻叶绿体基因组上高效表达基因的启动子和终止子，用于构建外源基因的叶绿体表达载体。启动子和终止子是外源基因能够表达的必备元件，内源性的调控序列尤其是内源高表达基因的启动子能够促进外源基因的表达。
5、雨生红球藻是能够天然虾青素的最优来源，利用本发明雨生红球藻叶绿体稳定表达系统可以促进并改良雨生红球藻的生长性能，提高生长速度，增强抗菌性，具备更加优越的规模化培养性状，从而在生产角度提高虾青素的产量和产率。
6、利用本发明雨生红球藻叶绿体稳定表达系统可将营养性蛋白或动物疫苗在该藻叶绿体表达并大量积累，从而提高该藻的饵料性能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的雨生红球藻空载体图谱。
图2为本发明实施例提供的雨生红球藻表达载体图谱。
图3为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL5000;泳道Wild为野生株；泳道Mutants为转基因藻株）。
图4为本发明实施例提供的PCR产物电泳图（其中M为分子标记DL8000;泳道Wild为野生株；泳道Mu为转基因藻株）。
图5为本发明实施例提供的转基因雨生红球藻Southern杂交图（其中泳道Wild为野生株；泳道Mutant为转基因藻株）。
图6为本发明实施例提供的转基因雨生红球藻Western杂交图（其中泳道Wild为野生株；泳道Mutant为阳性转基因藻株）。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步描述。
实施例1 雨生红球藻叶绿体内源性片段的克隆
根据本实验室测得的雨生红球藻叶绿体基因组，设计并合成如下引物：
SEQ1-for：5’-CGCGCAAGCGTTGAGGAAGGTG-3’
SEQ1-rev：5’-CAACCCTTAAAACTAAGTATAGAC-3’
SEQ2-for：5’- GGGGCCCCTAGACCGAAGGCG-3’
SEQ2-rev：5’-CCTCGCTGATTCACACGGGATTC-3’
SEQ3-for：5’-AAAGCGCAACCTTTAAAGTAGCTG-3’
SEQ3-rev：5’-ATGTTTGTTTATTTTTATTTTTTAAATCT-3’
SEQ4-for：5’-AGCCCCAAGTATGGGCTGGGGC-3’
SEQ4-rev：5’-TTATTGATTGTAACAAAGAATAGTGTC-3’
SEQ5-for：5’-TAGTATAGAATAGAAGTCTAACAGT-3’
SEQ5-rev：5’-GGGGGTGCCCCAGAACCACCTG-3’
SEQ6-for：5’-TTTTATTTTTTAAAATCATATAAACGTTA-3’
SEQ6-rev：5’-CGGAGCTCGGGGGCCCCCAG-3’
其中引物SEQ1-for和SEQ1-rev的扩增产物是SEQ ID NO:1；引物SEQ2-for和SEQ2-rev的扩增产物是SEQ ID NO:2；引物SEQ3-for和SEQ3-rev的扩增产物是SEQ ID NO:3；引物SEQ4-for和SEQ4-rev的扩增产物是SEQ ID NO:4；引物SEQ5-for和SEQ5-rev的扩增产物是SEQ ID NO:5；引物SEQ6-for和SEQ6-rev的扩增产物是SEQ ID NO:6。
以雨生红球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ1-for和SEQ1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，55℃ 30sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是雨生红球藻叶绿体基因组16S rDNA-trnI，为1040bp，即为片段SEQ ID NO: 1。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。
以雨生红球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ2-for和SEQ2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，55℃ 30 sec，72℃ 1 min，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是雨生红球藻叶绿体基因组trnA-23S rDNA，为1060 bp，即为片段SEQ ID NO: 2。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:2的重组质粒pMD- SEQ2。
以雨生红球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ3-for和SEQ3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，50℃ 30 sec，72℃ 30 sec，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是雨生红球藻叶绿体基因组psbA启动子，为507bp，即为片段SEQ IDNO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO: 3的重组质粒pMD-SEQ3。
以雨生红球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ4-for和SEQ4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，45℃ 20 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是雨生红球藻叶绿体基因组rbcL启动子为256 bp，即为片段SEQ IDNO: 4。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。
以雨生红球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ5-for和SEQ5-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，45℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃5min延伸。PCR扩增产物是雨生红球藻叶绿体基因组rbcL终止子，为195 bp，即为片段SEQID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ5。
以雨生红球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ6-for和SEQ6-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min， 45℃ 30 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物是雨生红球藻叶绿体基因组psbA终止子，为175 bp，即为片段SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，与pMD-18T载体(Sigma公司)连接，获得含有片段SEQ ID NO:5的重组质粒pMD-SEQ6。
实施例2：雨生红球藻叶绿体转化空载体的构建
设计并合成如下引物:
bar-for: 5’-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3’
bar-rev: 5’-TCATCAAATCTCGGTGACGGG-3’
以商用载体pSVB为模版，经引物bar-for和bar-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min， 54℃ 30 sec，72℃ 40 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为555 bp，即为除草剂抗性基因bar。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化备用。
以上述产物为基础，pMD18T为出发载体通过同源重组方法构建雨生红球藻叶绿体同源重组载体。其中pMD-SEQ2、pMD-SEQ3、pMD-SEQ5、pMD-SEQ6需要先利用PCR在序列5’端或3’端添加接头和酶切位点，SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、bar无须添加接头或酶切位点。
设计并合成如下引物:
L1-for：5’- GTCTATACTTAGTTTTAAGGGTTGAAAGCGCAACCTTTAAAGTAGCTG -3’
L1-rev：5’-GGCGTCGTTCTGGGCTCATATGTTTGTTTATTTTTATTTTTTAAA-3’
L2-for：5’- CCCGTCACCGAGATTTGATGATAGTATAGAATAGAAGTCTAAC-3’
L2-rev：5’- GCCCCAGCCCATACTTGGGGCTGGGGGTGCCCCAGAACCACC-3’
L3-for：5’- CGAGCTCTTTTATTTTTTAAAATCATATAAACGTTA-3’
L3-rev：5’- CGCCTTCGGTCTAGGGGCCCCCGGAGCTCGGGGGCCCCCAG-3’
L4-for：5’- GGGGCCCCTAGACCGAAGGCG -3’
L4-rev：5’-GGAATCCCCTCGCTGATTCACACGGGATTC-3’
以pMD-SEQ3为模版，经引物L1-for及L1-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5 min预变性；94℃ 1 min，50℃ 30 sec， 72℃ 30 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为540 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 3。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 3-1备用。
以pMD-SEQ5为模版，经引物L2-for及L2-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min， 45℃ 30 sec， 72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为280 bp，即为两端含接头的SEQ ID NO: 6。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 6-1备用。
以pMD-SEQ6为模版，经引物L3-for及L3-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min， 45℃ 30 sec，72℃ 20 sec，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为200 bp，即为5’端含SacI酶切位点，3’端含接头的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 5-1备用。
以pMD-SEQ2为模板，经引物L4-for及L4-rev进行PCR扩增，反应程序为：94℃ 5min预变性；94℃ 1 min， 55℃ 30 sec， 72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为1080 bp，即为3’端含EcoRI酶切位点的SEQ ID NO: 5。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为SEQ ID NO: 2-1备用。
将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3-1、bar基因片段、SEQID NO: 6-1和SEQ ID NO: 4混合为模板，利用融合PCR试剂盒依次连接并通过TA克隆方法***pMD18T载体上，命名为pMD18T-1。
将相同浓度（20-100ng/mL）的SEQ ID NO: 2-1、SEQ ID NO: 5-1混合为模板，利用融合PCR试剂盒连接，命名为fragment-2. fragment-2和pMD18T-1经过SacI和EcoRI两个酶酶切后，利用T4连接酶连接，构成雨生红球藻叶绿体同源重组空载体，命名为pHp/ch/bar。载体结构见附图1。
外源基因通过酶切连接的方式***pHp/ch/bar载体，从而构建雨生红球藻叶绿体表达载体，导入雨生红球藻后可实现外源基因在叶绿体中的表达。外源基因可以是功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。
下面将一个具有抗菌活性的抗菌肽基因（GenBank No. AKA60777.2）***该载体而后导入雨生红球藻中, 通过检测这个外源基因的表达来检测该载体的性能。
实施例3 按照上述实施例获得的载体在雨生红球藻叶绿体转化中的应用
1．雨生红球藻叶绿体表达载体的构建
设计并合成如下引物：
F1-for: 5’-CCTCTAGAATGCATCATCACCATCACCATGGTTTCGGTTGCAACGGTCCCTGG-3’
F1-rev: 5’-GGGATCCGAAATGGTGATGGTGATGGTGCAT-3’
其中，F1-for携带XbaI酶切位点及6×His标签，F1-rev含BamHI酶切位点。以人工合成的抗菌肽基因1为模板，经引物F1-for及F1-rev进行PCR扩增，反应程序为:94℃ 5 min预变性;94℃ 1 min, 55℃ 30 sec, 72℃ 20 sec，共35个循环;72℃ 5min延伸。PCR扩增产物约为220 bp，即为5’端含XbaI酶切位点的抗菌肽序列。片段经琼脂糖凝胶电泳后，胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产物，命名为F1。
将F1片段和pHp/ch/bar载体通过XbaI和BamHI酶切连接的方式，将F1片段连接到空载体pHp/ch/bar上。获得的载体经测序验证序列准确，命名为pHp/ch/bar-anti2其载体结构如附图2所示。
2. 雨生红球藻的转化
在转化前1h，取对数生长期的雨生红球藻液，离心力8000 g离心5min，弃上清，用培养液调整浓度到1×108cell ml-1。然后取0. 2m1藻液涂在固体培养平板的中央，呈直径约2cm的圆形。涂好的平板置于超净工作台中备用。
微粒子弹的制备:取50 ul金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加入5uL质粒pTl/ch/bar-anti2 (质粒浓度>=1ug ul-1) , 50ul 2.5M CaCl2, 20ul 0.1M亚精胺。然后继续涡旋3min。离心5~6 sec，弃上清。然后用250 μL无水乙醇洗两次，最后用60 μL无水乙醇重悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹可用于5~6次轰击。
在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。轰击参数压力为650psi，轰击距离为9 cm。
轰击后，藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到培养液中继续培养40 h，使细胞生长状态得以恢复。
3. 转化后雨生红球藻的筛选和鉴定
经过恢复培养的雨生红球藻细胞，转到选择性培养液中，以杀死未转化的藻细胞。选择性培养液即为含有15ug ml-1草丁膦的MCM培养液。15d后将培养液以7000g离心5min，弃上清。收集到的藻体涂布到含有10 ug ml-1草丁膦固体培养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养20d后，平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有5ug ml-1草丁嶙的固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d后，挑取单藻落至培养液中继续培养约20d，6000g离心5min，收集藻体，每个藻体湿重>= 100mg，然后置于液氮中冷冻备用。
提取转基因雨生红球藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为bar for，下游引物为bar rev，产物为bar基因，反应程序如前所述。在一部分抗性雨生红球藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的雨生红球藻中均未发现该片段，参见附图3。
然后在SEQ ID NO:1 5’端上游和SEQ ID NO:2 3’端下游分别设计并合成引物，引物序列如下:
con-F for: 5’- GTACGGTTAAGTCCTGCAACGA -3’
con-F rev: 5’- TCCCACTGCTAGTAAGCATACG-3’
这对引物con-F for和con-F rev在野生型雨生红球藻基因组总DNA中扩增到包括同源臂的片段，长度约为2100 bp；在实现同质化的转基因雨生红球藻基因组总DNA中，扩增到同源臂及全部基因表达框的片段，长度约为4000bp.
以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-F for和con-F rev进行PCR扩增。PCR反应程序为: 94℃ 1min, 59℃ 30 sec, 72℃ 50 sec，共30个循环;72℃ 5min延伸。PCR产物经电泳分离有两个条带 (参见附图4)。经测序，序列与载体序列一致，说明外源基因已***雨生红球藻叶绿体基因组中，但并未实现全质化。
PCR有阳性结果的转基因雨生红球藻样品，要继续进行Southern杂交鉴定。以bar、和抗菌肽基因PCR产物为模板制备地高辛标记的探针，每个样品的基因组总DNA不少于4ug。利用罗氏的地高辛标记Southern杂交试剂盒进行杂交等过程，结果如附图5所示。这表明在阳性突变株中，外源片段已经稳定***叶绿体基因组。
Southern杂交有阳性结果的转基因雨生红球藻样品进行western杂交鉴定。Western杂交使用小鼠抗His IgG和羊抗鼠IgG与辣根过氧化物酶(HRP)结合的方法对表达蛋白进行鉴定。杂交结果显示，杂交后出现了一条约28 kDa的条带，与外源基因蛋白大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见图6)，这表明在阳性藻株中，外源蛋白已经表达。
上述实施例表明利用本发明的载体成功实验了抗菌肽基因在雨生红球藻叶绿体中实现了表达，证明了本发明载体调控外源基因在雨生红球藻叶绿体中表达外源基因的能力，可以实现各种蛋白基因的表达，包含功能蛋白基因如催化各种酶促反应的蛋白基因、光合作用相关蛋白基因，结构性蛋白如细胞膜蛋白基因、金属离子结合蛋白基因等等，以及营养型蛋白如神经肽、抗菌肽基因等。
序列表
SEQ ID NO:1
5’-CGCGCAAGCGTTGAGGAAGGTGAGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCATACACCCTGGGCGACACACGTAATACAATGGTTGGGACAATCAGTAGCTAACTCGCGAGAGCTTGCCAATCTGTTAAACTCAACCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCCAGTCAGCCAAATGGCGGTGAATACGTTCTCTAGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCGCGAAAGTAGATTGTAGTTGAAGTCATTAGTTCTAAAGACGGTGCCCACACTCCAATTTATAATCATGGTGAAGTCGTAACAAGGTAAGGCTACTGGAAGGTGGCCTTGGATCACCTCCTTCTCTTAATACAATACAACTAGAACTTAAAAGAATTACTTAAGACCGTAGGGTACTGGCTTACCGAAGGGTACTGGCTTACTTACTTACTTACTTATAAGTACGTTCTTATTAATTTCTATAAATTTAGCACTTTAAAGTAAATAAGTATTTCTGACTTATCTTAGATAAGTCAGAAATACTTATTTACTTTAAAGTGCTTTCTGTTTCTTTAAAGAAAGAATTTCTATAAGGGCTATTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGTAGTTCAAATCTCCCATAGCCCATCCTCAACATAACCTCCACTTCTTATAAGTAAGTAAGTAAGCCGGTTTCGCTACCCTTCGTACCCTTCGTACCCTTCTTCTGCGAAGAAGTAAGCCAGCTTCTATAACGCAGAAGCCCTTCTTCCTTAAAGCCCTTCCTTTTCCTCGGGGGTTGGGGGTCGGGGGCCCCTAGACCGAAGGCGGCCCCGCCCAGACTTGGGGCAGGGGCTCGTTGGCCGCCCCCGGCCAACGAGGGGGCGCCCGTCCTTGGTTTTTCGGCCCCTAGCCCCAAGTCTGGGCGGGGCCGCCTTCGGTCTAGGGGCCCCCAACCCTTAAACCTAAGTATAGCTAGACCCCTTCGGTCTATACTTAGTTTTAAGGGTTG-3‘
（a）序列特征：16S rDNA-trnI
●长度：1040 bp
●类型： 碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：雨生红球藻叶绿体基因组
SEQ ID NO:2
5’-GGGGCCCCTAGACCGAAGGCGGCCCCGCCCAGACTTGGGGCTAGGGGCCGAAAAACCAAGGACGGGCCCCCGACCCAACTTGGGGCTGGGGGCCCCCGAGCCCCCAGCCGTAGGCATCGGAAAGAAGAGAAGCCCATTACCGAGGATTCTAGGGAATGTAGCTCAGTTGGTAGAGCACCGCCTTTGCAAGGCGGGGGTCGCAGGTTCGAGACCTGTCGTTTCCACTTCTATTTTATTTAGGTCGGGGGTTGGGGGTCGGGGGCCCCTAGCCCCAACTTGGGGCAGGGGCCCGTCCTTGGTTTTTCCCATTAAAATGAACTATAACCTGGTTATAGTTCATTTTAATGGGAAAAACCAAGGAAAAGCCCGTTCTTGGTTTTTCCCCTTAAACCTAAGTATAGTCAGACTATACTTAGGTTTAAGGGGAAAAACCAAGGAAAGCCCCAACTTGGGGCTGGGGGCCCCCGAGTAGGGGGTTGGGGCAGGGGCCCCAACCCCTGCCCCAACCCCCAAACCCCGAGCAAAGGCAAAGAAAGGGTTAAAGGACCTAAACTGTTCAAACAAAGGAAAGGGTCAAATGAAAAAAGGCTTACGGTGGAATCCTAGGCACCCAGAGACGATGAAGGGCGCAGATACCGGCGAAACGCTTCGGGGAGCTGGCAACAAGCATAGATCCGAAGATCCCCGAATAGGGCAACCTGCAAAACTACCAACAAAATTCATAAGTTGGAAAGAGAGAACCCAGTGAATTGAAACATCTTAGTAGCTGGTGGAAAAGAAAGCAAACGCGATTCCCGTAGTAGCGGCGAGCGAACCGGGAACAGCCTAAACCTTGTATGTGCGTTTACGTACATAAGGGGGTAGTGGGAAGACTAATAAATTAAATAAGTGGCTTATCTTACTTACTTATAAGTAAGTAAGTAAGTAAGAATAAAAAACGAAGCAGCTGAAACCTGCACCATAGATGGTGAAAGTCCAGTAGTTGCAATGTAAAATAGAATAAGTAAAGTCTAATCCCGAGTAGCATGGGACACGTGGAATCCCGTGTGAATCAGCGAGG-3‘
（a）序列特征：trnA-23S rDNA
●长度：1060 bp
●类型： 碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：雨生红球藻叶绿体基因组
SEQ ID NO:3
5’-AAAGCGCAACCTTTAAAGTAGCTGTTCTTACTTATAAGTTCAGCCAAAAGAGTATAGAACGTTCGATCTAGTTCTACGGTTAGACTTTCTTAGATAAACGTCGCCTTTTTTTTAAATTTACCCTATTTGTTTGTTGAGAATCTTAAAATTTTAACATATATAGTTTTTATGGTAAAATAAATGTACCAGGTATCAATTATGAAGCTTGAAAACAAAACAATATTCAATAAAGTAATAAAATATAATAGATTTGTAATATTAACATTTTTTATGATAAAAAAGAGAAAAACCGCATTCCAAAAACTGAAAACTCTTTTTAATAACACCTGGCTGGCATAAGACCTTCAGATAATTACTTATAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTCTAGGGGAAGAATCGGTAGGCGTAAAGGCCCCAAGCACGTAGGGCGACCCAACCGTTCTTGTTTTAGACTTTTGAGAATAAAACCCGGAGAGATTTAAAAAATAAAAATAAACAAACAT-3‘
（a）序列特征：psbA启动子
●长度：507 bp
●类型： 碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：雨生红球藻叶绿体基因组
SEQ ID NO:4
5’-AGCCCCAAGTATGGGCTGGGGCCCCCGACCGCCTTTCTTCCGGCCTACGAGGGGGAAGCGGAGGAAGGGAAAAAACAAGGACAGAACCGCTGCTTCTGCAATTTAAAAAGGAAAAGCCGTTAGATGCTGCTACTCCCGAAAATTTCCTTATTCGTAAATCGCTGCAGAAAGTATTTTTTCTATAAAATTAAATAGAACGTGTAATAAGCGGATAGATTATTTTAGGATCGACACTATTCTTTGTTACAATCAATAA-3‘
（a）序列特征：rbcL启动子
●长度：256 bp
●类型： 碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：雨生红球藻叶绿体基因组
SEQ ID NO:5
5’-TAGTATAGAATAGAAGTCTAACAGTGCTTATTATTACTAAATATTGTTACTTCTTTTTCCAGTTCTGTAAATTTTTACTTGTTAGATTGGTTGAACATTAAACACCTCTTTCGAAGCTGGTCCTCTATCCCCGCTGCAAGAACTCCTTTTTAAGGCTTAAACTAAAAGGACTCCAGGTGGTTCTGGGGCACCCCC-3‘
（a）序列特征：rbcL 终止子
●长度：195 bp
●类型： 碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：雨生红球藻叶绿体基因组
SEQ ID NO:6
5’-TTTTATTTTTTAAAATCATATAAACGTTAAATTCGTTTTATGATTAAACCGTAGGTTTTATATATAATAGAAAGAGCAGTTCTTTCCCCCTCTTCCTATGTTTTCTCCCTCCTTCCCTAAGGCTCCGGTCGGGGGCCCCCAGCCCATACTTGGGGCTGGGGGCCCCCGAGCTCCG-3‘
（a）序列特征：psbA 终止子
●长度：175 bp
●类型： 碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：雨生红球藻叶绿体基因组。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 一种雨生红球藻叶绿体表达系统及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1040
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcgcaagcg ttgaggaagg tgaggatgac gtcaagtcag catgccccat acaccctggg 60
cgacacacgt aatacaatgg ttgggacaat cagtagctaa ctcgcgagag cttgccaatc 120
tgttaaactc aacctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agccggaatc 180
gctagtaatc gccagtcagc caaatggcgg tgaatacgtt ctctagtctt gtacacaccg 240
cccgtcacac cgcgaaagta gattgtagtt gaagtcatta gttctaaaga cggtgcccac 300
actccaattt ataatcatgg tgaagtcgta acaaggtaag gctactggaa ggtggccttg 360
gatcacctcc ttctcttaat acaatacaac tagaacttaa aagaattact taagaccgta 420
gggtactggc ttaccgaagg gtactggctt acttacttac ttacttataa gtacgttctt 480
attaatttct ataaatttag cactttaaag taaataagta tttctgactt atcttagata 540
agtcagaaat acttatttac tttaaagtgc tttctgtttc tttaaagaaa gaatttctat 600
aagggctatt agctcagttg gttagagcgc acccctgata agggtgaggt cggtagttca 660
aatctcccat agcccatcct caacataacc tccacttctt ataagtaagt aagtaagccg 720
gtttcgctac ccttcgtacc cttcgtaccc ttcttctgcg aagaagtaag ccagcttcta 780
taacgcagaa gcccttcttc cttaaagccc ttccttttcc tcgggggttg ggggtcgggg 840
gcccctagac cgaaggcggc cccgcccaga cttggggcag gggctcgttg gccgcccccg 900
gccaacgagg gggcgcccgt ccttggtttt tcggccccta gccccaagtc tgggcggggc 960
cgccttcggt ctaggggccc ccaaccctta aacctaagta tagctagacc ccttcggtct 1020
atacttagtt ttaagggttg 1040
<210> 2
<211> 1060
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggggccccta gaccgaaggc ggccccgccc agacttgggg ctaggggccg aaaaaccaag 60
gacgggcccc cgacccaact tggggctggg ggcccccgag cccccagccg taggcatcgg 120
aaagaagaga agcccattac cgaggattct agggaatgta gctcagttgg tagagcaccg 180
cctttgcaag gcgggggtcg caggttcgag acctgtcgtt tccacttcta ttttatttag 240
gtcgggggtt gggggtcggg ggcccctagc cccaacttgg ggcaggggcc cgtccttggt 300
ttttcccatt aaaatgaact ataacctggt tatagttcat tttaatggga aaaaccaagg 360
aaaagcccgt tcttggtttt tccccttaaa cctaagtata gtcagactat acttaggttt 420
aaggggaaaa accaaggaaa gccccaactt ggggctgggg gcccccgagt agggggttgg 480
ggcaggggcc ccaacccctg ccccaacccc caaaccccga gcaaaggcaa agaaagggtt 540
aaaggaccta aactgttcaa acaaaggaaa gggtcaaatg aaaaaaggct tacggtggaa 600
tcctaggcac ccagagacga tgaagggcgc agataccggc gaaacgcttc ggggagctgg 660
caacaagcat agatccgaag atccccgaat agggcaacct gcaaaactac caacaaaatt 720
cataagttgg aaagagagaa cccagtgaat tgaaacatct tagtagctgg tggaaaagaa 780
agcaaacgcg attcccgtag tagcggcgag cgaaccggga acagcctaaa ccttgtatgt 840
gcgtttacgt acataagggg gtagtgggaa gactaataaa ttaaataagt ggcttatctt 900
acttacttat aagtaagtaa gtaagtaaga ataaaaaacg aagcagctga aacctgcacc 960
atagatggtg aaagtccagt agttgcaatg taaaatagaa taagtaaagt ctaatcccga 1020
gtagcatggg acacgtggaa tcccgtgtga atcagcgagg 1060
<210> 3
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaagcgcaac ctttaaagta gctgttctta cttataagtt cagccaaaag agtatagaac 60
gttcgatcta gttctacggt tagactttct tagataaacg tcgccttttt tttaaattta 120
ccctatttgt ttgttgagaa tcttaaaatt ttaacatata tagtttttat ggtaaaataa 180
atgtaccagg tatcaattat gaagcttgaa aacaaaacaa tattcaataa agtaataaaa 240
tataatagat ttgtaatatt aacatttttt atgataaaaa agagaaaaac cgcattccaa 300
aaactgaaaa ctctttttaa taacacctgg ctggcataag accttcagat aattacttat 360
aagtaagtaa gtaagtaagt aagtaagtct aggggaagaa tcggtaggcg taaaggcccc 420
aagcacgtag ggcgacccaa ccgttcttgt tttagacttt tgagaataaa acccggagag 480
atttaaaaaa taaaaataaa caaacat 507
<210> 4
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agccccaagt atgggctggg gcccccgacc gcctttcttc cggcctacga gggggaagcg 60
gaggaaggga aaaaacaagg acagaaccgc tgcttctgca atttaaaaag gaaaagccgt 120
tagatgctgc tactcccgaa aatttcctta ttcgtaaatc gctgcagaaa gtattttttc 180
tataaaatta aatagaacgt gtaataagcg gatagattat tttaggatcg acactattct 240
ttgttacaat caataa 256
<210> 5
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagtatagaa tagaagtcta acagtgctta ttattactaa atattgttac ttctttttcc 60
agttctgtaa atttttactt gttagattgg ttgaacatta aacacctctt tcgaagctgg 120
tcctctatcc ccgctgcaag aactcctttt taaggcttaa actaaaagga ctccaggtgg 180
ttctggggca ccccc 195
<210> 6
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttttattttt taaaatcata taaacgttaa attcgtttta tgattaaacc gtaggtttta 60
tatataatag aaagagcagt tctttccccc tcttcctatg ttttctccct ccttccctaa 120
ggctccggtc gggggccccc agcccatact tggggctggg ggcccccgag ctccg 175