阅读说明：本技术 一种在鱼类胚胎中实现精确定点rna剪切的技术 (Technology for realizing precise fixed-point RNA shearing in fish embryo ) 是由 何小镇 钟丽丽 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种在鱼类胚胎中实现精确定点RNA剪切的技术,利用CasRx介导的RNA编辑技术,只需要提供CasRx的mRNA,以及一条特异靶向导向RNA,能够在鱼胚胎中实现精确定点RNA敲降,具有高效、特异性高和方便且费用低等诸多优点。克服了目前已有的siRNA技术面临的效率偏低、Morpholino技术介导的基因敲降技术的代价高昂易脱靶等问题。(The invention provides a technology for realizing precise fixed-point RNA shearing in fish embryos, which can realize precise fixed-point RNA knock-down in fish embryos by using a CasRx-mediated RNA editing technology and only needing to provide mRNA of CasRx and a specific targeting guide RNA. The problems that the efficiency of the prior siRNA technology is low, the Morpholino technology mediated gene knock-down technology is high in cost and easy to miss, and the like are solved.)

一种在鱼类胚胎中实现精确定点RNA剪切的技术

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在鱼类胚胎中实现精确定点RNA剪切的技术。

背景技术

随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科学的研究进入后基因组时代。在后基因组时代，基因组研究的重心将转向基因功能，即由测定基因的DNA 序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘(Peltonen and McKusick, 2001)。科研人员们已经开始通过各种尝试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗（personalized medicine）工作当中(Chan and Ginsburg, 2011)。不过面对海量枯燥的基因组信息，科研人员们该如何将这些数据转换成有意义的基因组功能，解决这个问题的一个关键在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型（genotype）对表型(phenotype）的影响作用。

通过技术进步，细胞功能和疾病转录组变化的绘图已经从微阵列（Schena et al，1995）转化为下一代测序和单细胞研究（Shendure et al ，2017）。然而，询问个体转录动力学的功能，并在观察到的转录变化和细胞表型之间建立因果关系，需要有能力主动控制或调节所需的转录。CRISPR-Cas9等DNA工程技术（Doudna Charpentier，2014；Hsu，2014）使研究人员能够解剖特定遗传元素的功能或纠正致病突变。然而，用于研究和操纵RNA的简单和可扩展的工具明显落后于它们的DNA对应物。现有的RNA干扰技术能够分解或抑制所需的转录物，由于其在内源性过程中的关键作用，因此具有显著的脱靶效应（off-targeteffect），并仍然是具有挑战性的目标（Birming-Ham等人，2006年；Jackson等人，2003年）。因此，直接研究RNA功能作用的方法仍然有限。

RNA工程中的一个关键限制是缺乏RNA结合域，这种结合域很容易被重定位并引入靶细胞。例如，ms2-RNA结合域识别一个不变的21核苷酸（nt）RNA序列（peabody，1993），因此需要基因组修饰来标记所需的转录物。Pumilio同源域具有模块化重复，每个蛋白质模块识别一个单独的RNA碱基，但它们只能针对短的8nt RNA序列（Cheong，Hall，2006）。虽然以前的特征化II型（Batra et al.，2017；O'Connell et al.，2014）和VI型（Abudayyeh et al.，2016；East Seletsky et al.，2016）CRISPR-Cas 系统可以重新编程以识别20-30 nt RNA，但它们的大尺寸（约1200aa）使得很难包装成腺相关病毒（AAV），用于初级细胞和体内传递。作为最紧凑的单细胞效应器Cas酶之一，CasRx也可以被灵活地包装成腺相关病毒。

基因功能筛选的时候需要用到基因敲降技术（gene knockdown），由于siRNA技术在斑马鱼中效果不好，斑马鱼胚胎上进行基因knockdown操作时主要采用反义寡核苷酸（Morpholino, MO）技术(Nasevicius and Ekker, 2000)。MO技术虽然效果不错，但是因为容易脱靶，导致针对每个基因进行knockdown的时候一般都需要设计两条特异的MO序列，另外目前合成MO的公司并不在国内，导致订货周期偏长。而且，MO技术除了脱靶外还有毒性大等缺陷(Stainier et al., 2017; Van Gils and Vanakker, 2019)。因此，在斑马鱼中建立新的RNA干扰技术对于斑马鱼基因功能研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在鱼类胚胎中实现精确定点RNA剪切的技术，CasRx介导的敲除具有较高的效率和特异性，CasRx可以被灵活地包装成腺相关病毒，CasRx是一种可编程的RNA结合模块，可以有效地定位细胞RNA，可利用CasRx高效剪切掉外源荧光蛋白相应的RNA，使其可视化的遗传标记减弱；也可利用CasRx高效敲降一些具有表型明显或关键基因所对应的RNA，使其出现不一样的表型或者死亡。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种在鱼类胚胎中实现精确定点RNA剪切的技术，包括以下方法：

A、野生型CasRx序列及外源荧光蛋白（GFP、BFP）mRNA及相应的导向RNA（sgRNA）和内源基因的导向RNA（sgRNA）的设计和制备；

B、显微注射时RNA各组分的剂量确定；

C、外源mRNA在斑马鱼胚胎中的切割效率检测方法；

D、内源mRNA在斑马鱼胚胎中的切割效率检测方法；

E、内源多个基因同时进行敲降的方法。

具体包括以下方法：

（1）野生型CasRx序列及外源荧光蛋白（GFP、BFP）mRNA及相应的导向RNA（sgRNA）和内源基因的导向RNA（sgRNA）的设计和制备；

CasRx序列分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用；设计外源荧光蛋白（GFP、BFP）DNA的引物合成DNA,再经过体外转录合成mRNA，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用 ；不同的sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子的固定序列及与上游存在部分互补的不同的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用。

（2）显微注射时混合液中RNA各组分的剂量确定；

a、外源基因时显微注射时RNA各组分的剂量：混合液中各荧光蛋白终mRNA浓度为600ng/ul；sgRNA终浓度为100ng/ul；CasRx mRNA 终浓度为200 ng/ul。每个胚胎注射大约~1nl;

b、内源基因时显微注射时RNA各组分的剂量：混合液中sgRNA终浓度为100ng/ul；CasRxmRNA终浓度为200 ng/ul。每个胚胎注射大约~1nl。

（3）外源mRNA在斑马鱼胚胎中的切割效率检测方法；

斑马鱼胚胎单胞期注射相应实验组和对照组组分后，约12 h时运用共聚焦拍摄显微注射的对照组及各实验组胚胎的多张荧光图，之后分别取对照组及各实验组30颗胚胎分装2管EP管（各15颗），并往EP管中加200ul Trizol后冻于-80 ℃，之后提RNA。用所提的RNA利用逆转录试剂盒进行逆转录，得到的DNA进行实时荧光定量PCR。利用相应的软件LAS AFLite、GraphPad Prism 5、ImageJ对共聚焦拍摄的荧光图和LightCycler® 96 SW 1.1、GraphPad Prism 5对定量PCR的图进行相应的分析。

( 4 )内源mRNA在斑马鱼胚胎中的切割效率检测方法；

斑马鱼胚胎单胞期注射相应实验组和对照组组分后，在24h时利用荧光倒置显微镜对显微注射及未处理的WT分别进行表型拍照并在24 h时进行畸形统计，24 h之后取对照组及各实验组的畸形胚胎30颗胚胎分装3管EP管（各10颗），并往EP管中加200ul Trizol后冻于-80 ℃，之后提RNA。用所提的RNA利用逆转录试剂盒进行逆转录，得到的DNA进行实时荧光定量PCR。利用相应的软件LightCycler® 96 SW 1.1、GraphPad Prism 5对定量PCR的图进行相应的分析。

( 5 )内源多个基因同时进行敲降的方法。

配置CasRx mRNA 终浓度为200 ng/ul，A 基因导向sgRNA终浓度为100ng/ul，B 基因导向sgRNA终浓度为100ng/ul, C 基因导向sgRNA终浓度为100ng/ul的混合液，将该组分同时注射到斑马鱼胚胎中，观察斑马鱼胚胎的发育情况。

本发明利用可以RNA靶向编辑的CRISPR/CasRx介导的RNA编辑技术作用于斑马鱼胚胎，CasRx介导的敲除具有较高的效率和特异性，CasRx可以被灵活地包装成腺相关病毒，CasRx是一种可编程的RNA结合模块，可以有效地定位细胞RNA，可利用CasRx高效剪切掉外源荧光蛋白相应的RNA，使其可视化的遗传标记减弱；也可利用CasRx敲降一些具有表型明显或关键基因所对应的RNA，使其出现不一样的表型或者死亡。

CasRx是Cas13d 的一种。Cas13 RNA编辑系统由Cas13蛋白以及一条64到66 nt长度的CRISPR RNA（crRNA）组成，crRNA能够通过间隔区识别22到30 nt特异RNA序列。Cas13系统作为RNA编辑工具具有以下几大优势：1、Cas13能够通过改变crRNA间隔区的序列从而识别所有的目标RNA；2、Cas13不同于Cas9以及Cpf1,对于目标序列并不需要特异的序列元件（如PAM位点）；3、Cas13的有效复合体是CRISPR–Cas系统中最简单的一种，Cas13–crRNA组成的系统比三聚获多聚的系统更容易操作和传递；4、多个针对不同靶序列的crRNAs可以同时进行传递。高效、易于操作且特异性高等特点，注定Cas13介导的RNA编辑技术能够在基因功能研究中大放异彩 (Kim, 2018)。

本发明在具体的实施中，野生型CasRx序列分别加入核定位序列 (nucleuslocalization sequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用；设计外源荧光蛋白（GFP、BFP）DNA的引物合成DNA,再经过体外转录合成mRNA，纯化提取的RNA于-80度冻存备用 ；不同的sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子的固定序列及与上游存在部分互补的不同的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用。

CRISPR/CasRx是一类新型的RNA编辑工具，CasRx是目前报道的效率最高的一个版本。虽然CRISPR/CasRx在细胞中的效率很好，但是目前还没有针对斑马鱼胚胎基因敲降的报道。

本发明的优点在于：

（1）、价格低廉，只需要更换一条短引物序列（＜50 bp）就能靶向一个目的基因的RNA；

相较与传统的斑马鱼胚胎Morpholino敲降技术，本发明设计方便，成本更低，在导向RNA的设计上采用引物配对扩增的方法，采用固定的正向引物，匹配特异靶向的反向序列，就能够扩增出导向RNA的模板DNA，提供纯化、转录能够快捷获得靶向特异的导向RNA。

（2）、组分简单且全部为RNA，毒性小，操作简单；

本组分只需要固定的CasRx mRNA，以及特异靶向的导向RNA，组分简单，剂量合适，毒性较小，可以减少样品毒性干扰。

（3）、通过多条gRNA可以实现多基因同时敲降；

导向RNA序列短，成本低，合成方便，毒性小，可以同时添加多条gRNA，实现多基因同时敲降。

（4）、效率高，时效长；

CasRx介导的RNA靶向切割具有非常高的序列特异性，因为CasRx mRNA采用了WPRE以及poly A加尾的双稳定措施，其在胚胎存在的时间长且稳定，足够保证胚胎发育过程中目标RNA的持续切割效果。

（5）、效率分析方法简单易行。

本研究提供了简便的靶向RNA切割效率的分析方法，采用real-timePCR的方法，通过提供合适的内参，能够快速分析出目的RNA序列的切割效率。

附图说明

图1 CasRx介导的RNA编辑系统在斑马鱼胚胎中的运用简图。

图2 CasRx介导的RNA编辑在斑马鱼胚胎中切割外源mRNA的效率验证；其中A、B：CasRx在斑马鱼胚胎中切割EGFP mRNA的代表图和效率统计；C、D：CasRx在斑马鱼胚胎中切割BFP mRNA的代表图和效率统计。

图3 CasRx介导的RNA编辑在斑马鱼胚胎中切割内源mRNA的效率验证；其中A：24 h的表型图； B：qPCR分析图。

具体实施方式

“靶位点”在本申请中是指，在目标核苷酸中任何一段欲加以敲降的RNA序列。靶位点附近的RNA序列，能够容纳外源序列在靶位点处的识别。在具体实施方式中，目标RNA序列是单链的RNA 序列，包括，但不限于，细胞的中的RNA序列、病毒等的RNA序列。

“外源RNA序列”在本申请中是指外源荧光蛋白加帽加尾RNA。

实施例1野生型CasRx序列、外源荧光蛋白（EGFP、BFP）的mRNA以及sgRNA的制备

野生型CasRx序列分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)（序列为CCGCCACC），然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列（序列为CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA），利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用；设计外源荧光蛋白（GFP、BFP）DNA的引物合成DNA,再经过体外转录合成mRNA，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用 ；不同的sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子的固定序列及与上游存在部分互补的不同的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到，纯化提取的RNA于-80 度冻存备用。

序列1： CasRx模板序列>PSKII-SP6-kozak-NLS-CasRx-NLS-HA-WPRE-PSKII

GTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCATACGATTTAGGTGACACTATAGAA（SP6启动子序列）CCGCCACC（核定位序列）atgagccccaagaagaagagaaaggtggaggccagc atcgaaaaaaaaaagtccttcgccaagggcatgggcgtgaagtccacactcgtgtccggctccaaagtgtacatga caaccttcgccgaaggcagcgacgccaggctggaaaagatcgtggagggcgacagcatcaggagcgtgaatgaggg cgaggccttcagcgctgaaatggccgataaaaacgccggctataagatcggcaacgccaaattcagccatcctaag ggctacgccgtggtggctaacaaccctctgtatacaggacccgtccagcaggatatgctcggcctgaaggaaactc tggaaaagaggtacttcggcgagagcgctgatggcaatgacaatatttgtatccaggtgatccataacatcctgga cattgaaaaaatcctcgccgaatacattaccaacgccgcctacgccgtcaacaatatctccggcctggataaggac attattggattcggcaagttctccacagtgtatacctacgacgaattcaaagaccccgagcaccatagggccgctt tcaacaataacgataagctcatcaacgccatcaaggcccagtatgacgagttcgacaacttcctcgataaccccag actcggctatttcggccaggcctttttcagcaaggagggcagaaattacatcatcaattacggcaacgaatgctat gacattctggccctcctgagcggactgaggcactgggtggtccataacaacgaagaagagtccaggatctccagga cctggctctacaacctcgataagaacctcgacaacgaatacatctccaccctcaactacctctacgacaggatcac caatgagctgaccaactccttctccaagaactccgccgccaacgtgaactatattgccgaaactctgggaatcaac cctgccgaattcgccgaacaatatttcagattcagcattatgaaagagcagaaaaacctcggattcaatatcacca agctcagggaagtgatgctggacaggaaggatatgtccgagatcaggaaaaatcataaggtgttcgactccatcag gaccaaggtctacaccatgatggactttgtgatttataggtattacatcgaagaggatgccaaggtggctgccgcc aataagtccctccccgataatgagaagtccctgagcgagaaggatatctttgtgattaacctgaggggctccttca acgacgaccagaaggatgccctctactacgatgaagctaatagaatttggagaaagctcgaaaatatcatgcacaa catcaaggaatttaggggaaacaagacaagagagtataagaagaaggacgcccctagactgcccagaatcctgccc gctggccgtgatgtttccgccttcagcaaactcatgtatgccctgaccatgttcctggatggcaaggagatcaacg acctcctgaccaccctgattaataaattcgataacatccagagcttcctgaaggtgatgcctctcatcggagtcaa cgctaagttcgtggaggaatacgcctttttcaaagactccgccaagatcgccgatgagctgaggctgatcaagtcc ttcgctagaatgggagaacctattgccgatgccaggagggccatgtatatcgacgccatccgtattttaggaacca acctgtcctatgatgagctcaaggccctcgccgacaccttttccctggacgagaacggaaacaagctcaagaaagg caagcacggcatgagaaatttcattattaataacgtgatcagcaataaaaggttccactacctgatcagatacggt gatcctgcccacctccatgagatcgccaaaaacgaggccgtggtgaagttcgtgctcggcaggatcgctgacatcc agaaaaaacagggccagaacggcaagaaccagatcgacaggtactacgaaacttgtatcggaaaggataagggcaa gagcgtgagcgaaaaggtggacgctctcacaaagatcatcaccggaatgaactacgaccaattcgacaagaaaagg agcgtcattgaggacaccggcagggaaaacgccgagagggagaagtttaaaaagatcatcagcctgtacctcaccg tgatctaccacatcctcaagaatattgtcaatatcaacgccaggtacgtcatcggattccattgcgtcgagcgtga tgctcaactgtacaaggagaaaggctacgacatcaatctcaagaaactggaagagaagggattcagctccgtcacc aagctctgcgctggcattgatgaaactgcccccgataagagaaaggacgtggaaaaggagatggctgaaagagcca aggagagcattgacagcctcgagagcgccaaccccaagctgtatgccaattacatcaaatacagcgacgagaagaa agccgaggagttcaccaggcagattaacagggagaaggccaaaaccgccctgaacgcctacctgaggaacaccaag tggaatgtgatcatcagggaggacctcctgagaattgacaacaagacatgtaccctgttcagaaacaaggccgtcc acctggaagtggccaggtatgtccacgcctatatcaacgacattgccgaggtcaattcctacttccaactgtacca ttacatcatgcagagaattatcatgaatgagaggtacgagaaaagcagcggaaaggtgtccgagtacttcgacgct gtgaatgacgagaagaagtacaacgataggctcctgaaactgctgtgtgtgcctttcggctactgtatccccaggt ttaagaacctgagcatcgaggccctgttcgataggaacgaggccgccaagttcgacaaggagaaaaagaaggtgtc cggcaattccggatccggacctaagaaaaagaggaaggtggcggccgcttacccatacgatgttccagattacgctaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAAT

序列2： EGFP模板序列> SP6-kozak-EGFP

CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA（SP6启动子序列）CCGCCACC（核定位序列）GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

序列3： BFP模板序列> SP6-kozak-EGFP> SP6-vertebrate kozak-TagBFP -stop

CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA（SP6启动子序列）CCGCCACC（核定位序列）atgagcgagctgattaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtggacaaccatcacttcaagtgcacatccgagggcgaaggcaagccctacgagggcacccagaccatgagaatcaaggtggtcgagggcggccctctccccttcgccttcgacatcctggctactagcttcctctacggcagcaagaccttcatcaaccacacccagggcatccccgacttcttcaagcagtccttccctgagggcttcacatgggagagagtcaccacatacgaagacgggggcgtgctgaccgctacccaggacaccagcctccaggacggctgcctcatctacaacgtcaagatcagaggggtgaacttcacatccaacggccctgtgatgcagaagaaaacactcggctgggaggccttcaccgagacgctgtaccccgctgacggcggcctggaaggcagaaacgacatggccctgaagctcgtgggcgggagccatctgatcgcaaacatcaagaccacatatagatccaagaaacccgctaagaacctcaagatgcctggcgtctactatgtggactacagactggaaagaatcaaggaggccaacaacgagacctacgtcgagcagcacgaggtggcagtggccagatactgcgacctccctagcaaactggggcacaagcttaatTAA

序列4：sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列

sg-scaffold-F	GAAATTAATACGACTCACTATAGGcactagtgcgaatttgcactagtctaaaac
		sg-R	(22-26bp特异靶向序列***处) gttttagactagtgcaaa

实施例2. 斑马鱼胚胎体内切割外源EGFP mRNA序列

野生型CasRx序列分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，以外源EGFP DNA序列利用体外转录的试剂盒得到外源EGFP mRNA序列,sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；之后于-80℃冻存备用。显微注射时拿出以确定的比例混合注入单细胞胚胎，12 h用共聚焦显微镜拍摄荧光图及冻存胚胎待进行qPCR分析。

EGFP sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列

实施例3. 斑马鱼胚胎体内切割外源BFP mRNA序列

野生型CasRx序列分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，以外源BFP DNA序列利用体外转录的试剂盒得到外源BFP mRNA序列，sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；之后于-80℃冻存备用。显微注射时拿出以确定的比例混合注入单细胞胚胎，12 h用共聚焦显微镜拍摄荧光图及冻存胚胎待进行qPCR分析。

BFP sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列

实施例4. 斑马鱼胚胎体内切割内源Actb mRNA序列

野生型CasRx序列分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；之后于-80℃冻存备用。显微注射时拿出以确定的比例混合注入单细胞胚胎，24 h倒置显微镜拍摄表型图及冻存胚胎待进行qPCR分析。

Actb sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列

sg-scaffold-F	GAAATTAATACGACTCACTATAGGcactagtgcgaatttgcactagtctaaaac
		Actb-sg-R	ccagacatcagggagtgatggtgttttagactagtgcaaa

实施例5. 斑马鱼胚胎体内切割内源Neurog1 mRNA序列

野生型CasRx分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA尾的mRNA，sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；之后于-80℃冻存备用。显微注射时拿出以确定的比例混合注入单细胞胚胎，24 h倒置显微镜拍摄表型图及冻存胚胎待进行qPCR分析。

Neurog1 sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列

sg-scaffold-F	GAAATTAATACGACTCACTATAGGcactagtgcgaatttgcactagtctaaaac
		Neurog1-sg-R	AACCTCAAGCTGTGACTACTCCgttttagactagtgcaaa

为方便起见，本实施例采用显微注射将本发明的mRNA组合物导入斑马鱼受精卵中。组合物中各荧光蛋白终mRNA浓度为600 ng/ul；sgRNA终浓度为100ng/ul；CasRx mRNA200 ng/ul。注射时每个胚胎注射大约~1nl。

实施例6. 制备转基因斑马鱼品系

收集单细胞期斑马鱼胚胎，按上述方案进行注射，将其从胚胎养成成鱼。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种在鱼类胚胎中实现精确定点RNA剪切的技术

<130> 13

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgccacc 8

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catacgattt aggtgacact atagaa 26

<210> 3

<211> 3767

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcgaattg gcatacgatt 60

taggtgacac tatagaaccg ccaccatgag ccccaagaag aagagaaagg tggaggccag 120

catcgaaaaa aaaaagtcct tcgccaaggg catgggcgtg aagtccacac tcgtgtccgg 180

ctccaaagtg tacatgacaa ccttcgccga aggcagcgac gccaggctgg aaaagatcgt 240

ggagggcgac agcatcagga gcgtgaatga gggcgaggcc ttcagcgctg aaatggccga 300

taaaaacgcc ggctataaga tcggcaacgc caaattcagc catcctaagg gctacgccgt 360

ggtggctaac aaccctctgt atacaggacc cgtccagcag gatatgctcg gcctgaagga 420

aactctggaa aagaggtact tcggcgagag cgctgatggc aatgacaata tttgtatcca 480

ggtgatccat aacatcctgg acattgaaaa aatcctcgcc gaatacatta ccaacgccgc 540

ctacgccgtc aacaatatct ccggcctgga taaggacatt attggattcg gcaagttctc 600

cacagtgtat acctacgacg aattcaaaga ccccgagcac catagggccg ctttcaacaa 660

taacgataag ctcatcaacg ccatcaaggc ccagtatgac gagttcgaca acttcctcga 720

taaccccaga ctcggctatt tcggccaggc ctttttcagc aaggagggca gaaattacat 780

catcaattac ggcaacgaat gctatgacat tctggccctc ctgagcggac tgaggcactg 840

ggtggtccat aacaacgaag aagagtccag gatctccagg acctggctct acaacctcga 900

taagaacctc gacaacgaat acatctccac cctcaactac ctctacgaca ggatcaccaa 960

tgagctgacc aactccttct ccaagaactc cgccgccaac gtgaactata ttgccgaaac 1020

tctgggaatc aaccctgccg aattcgccga acaatatttc agattcagca ttatgaaaga 1080

gcagaaaaac ctcggattca atatcaccaa gctcagggaa gtgatgctgg acaggaagga 1140

tatgtccgag atcaggaaaa atcataaggt gttcgactcc atcaggacca aggtctacac 1200

catgatggac tttgtgattt ataggtatta catcgaagag gatgccaagg tggctgccgc 1260

caataagtcc ctccccgata atgagaagtc cctgagcgag aaggatatct ttgtgattaa 1320

cctgaggggc tccttcaacg acgaccagaa ggatgccctc tactacgatg aagctaatag 1380

aatttggaga aagctcgaaa atatcatgca caacatcaag gaatttaggg gaaacaagac 1440

aagagagtat aagaagaagg acgcccctag actgcccaga atcctgcccg ctggccgtga 1500

tgtttccgcc ttcagcaaac tcatgtatgc cctgaccatg ttcctggatg gcaaggagat 1560

caacgacctc ctgaccaccc tgattaataa attcgataac atccagagct tcctgaaggt 1620

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ctatgatgag ctcaaggccc tcgccgacac cttttccctg gacgagaacg gaaacaagct 1860

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catacgattt aggtgacact atagaaccgc caccgtgagc aagggcgagg agctgttcac 60

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caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg 600

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<213> 人工序列

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catacgattt aggtgacact atagaaccgc cacatgagcg agctgattaa ggagaacatg 60

cacatgaagc tgtacatgga gggcaccgtg gacaaccatc acttcaagtg cacatccgag 120

ggcgaaggca agccctacga gggcacccag accatgagaa tcaaggtggt cgagggcggc 180

cctctcccct tcgccttcga catcctggct actagcttcc tctacggcag caagaccttc 240

atcaaccaca cccagggcat ccccgacttc ttcaagcagt ccttccctga gggcttcaca 300

tgggagagag tcaccacata cgaagacggg ggcgtgctga ccgctaccca ggacaccagc 360

ctccaggacg gctgcctcat ctacaacgtc aagatcagag gggtgaactt cacatccaac 420

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<212> DNA

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