阅读说明：本技术 低分子量肝素金纳米材料及其在乙酰肝素酶检测中的应用 (Low molecular weight heparin gold nano material and application thereof in heparanase detection ) 是由 顾亚云 曾旭辉 丁伟华 孙斐 彭利忠 陈晨 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低分子量肝素金纳米材料及其在乙酰肝素酶检测中的应用,通过采用金纳米颗粒和金纳米棒对直径小于10 nm的低分子量肝素进行共价双标记,利用荧光能量共振转移(FRET)的方式检测肝素酶降解后底物的FRET值变化来反映乙酰肝素酶活性值,从而有效避免二次裂解对乙酰肝素酶活性测定带来的影响。(The invention discloses a low molecular weight heparin gold nano material and application thereof in heparanase detection, wherein gold nanoparticles and gold nanorods are adopted to carry out covalent double labeling on low molecular weight heparin with the diameter less than 10nm, and a fluorescence energy resonance transfer (FRET) mode is utilized to detect the change of FRET value of a substrate after heparanase degradation so as to reflect the activity value of the heparanase, so that the influence of secondary cracking on the activity determination of the heparanase is effectively avoided.)

低分子量肝素金纳米材料及其在乙酰肝素酶检测中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种金纳米材料双标记的低分子量肝素及其在乙酰肝素酶检测中的应用。

背景技术

硫酸乙酰肝素是一种由糖醛酸和葡萄糖胺交替组成的长链糖胺聚糖，广泛存在于肿瘤细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）和细胞表面，是基底膜的主要构成成分，在体内可为生长因子、血管内皮生长因子以及蛋白激酶等提供了附着点。迄今为止，乙酰肝素酶是人体内发现的唯一可以水解硫酸乙酰肝素的内源性水解酶，其活性与肿瘤关系密切。多项研究表明，肿瘤发展后期，乙酰肝素酶的表达量明显高于正常水平，过量表达的乙酰肝素酶可促进肿瘤细胞的生长、血管的生成以及浸润和迁移，导致肿瘤患者生存率大幅下降。因此，乙酰肝素酶的活性检测是判断肿瘤发生及发展的重要环节。

活性检测是乙酰肝素酶研究过程中的一项关键的检测指标，通过酶活性的测定可以计算酶催化反应的时间、酶与底物的反应用量等。乙酰肝素酶活性的测定常用的有两种方法：一种是通过 HPLC 等手段检测催化反应前后底物或产物的含量的变化；另一种是通过吸光度检测催化前后底物和产物的结构变化。由于底物肝素的结构复杂，缺乏特征性吸收基团，所以上述两种方法都无法用来建立乙酰肝素酶活性直接测定方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术对于乙酰肝素酶活性检测的不足，提供一种金纳米材料双标记的低分子量肝素及其在乙酰肝素酶检测中的应用。通过采用金纳米颗粒和金纳米棒对直径小于10 nm的低分子量肝素进行共价双标记，利用荧光能量共振转移（FRET）的方式检测肝素酶降解后底物的 FRET 值变化来反映乙酰肝素酶活性值，从而有效避免二次裂解对乙酰肝素酶活性测定带来的影响。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种低分子量肝素金纳米材料，是在低分子量肝素的非还原末端连有金纳米颗粒，在低分子量肝素的还原末端连有金纳米棒。

进一步地，所述低分子量肝素的直径小于10 nm。

进一步地，所述金纳米颗粒通过巯基以迈克尔加成的方式连接在低分子量肝素的非还原末端，所述金纳米棒通过氨基以还原胺化的手段结合在低分子量肝素的还原末端。

上述低分子量肝素金纳米材料在乙酰肝素酶活性检测中的应用。

上述低分子量肝素金纳米材料在乙酰肝素酶检测中的应用。

本发明采用金纳米材料与多糖相结合的特点，基于具有高量子效率的金纳米颗粒和金纳米棒的荧光猝灭效应特性，通过对直径小于10 nm的低分子量肝素进行共价双标记，得到了肝素酶活性测定的 FRET 探针底物，有效利用了金纳米材料的激发谱宽、发射谱窄、发射波长随尺寸可调、荧光寿命长和光化学稳定性高等优点。与荧光小分子相比，将该双标记低分子肝素用于乙酰肝素酶的活性检测，灵敏度较高且毒性低，降低了临床使用的风险。同时其荧光寿命长且不易光漂白，提高了酶活检测的灵敏度。

另外，通过本发明采用金纳米颗粒及金纳米棒能量转移分子进行共价双标记这一技术手段，可以对其他体内蛋白进行特异性的共价修饰，以实现对多糖的定位示踪及蛋白质的定量分析。

有益效果：

1. 利用低分子量肝素替代价格昂贵的硫酸乙酰肝素来检测乙酰肝素酶的活性，降低了实验的成本；

2. 相对于HPLC检测乙酰肝素酶的活性而言，该法简便，快捷，节省了大量的时间；相对于利用吸光度检测而言，该法提高了检测的灵敏度，能够高效快速监测乙酰肝素酶活性，同时还可以用于高通量筛选其他酶类蛋白。

附图说明

图1为本发明中双标记的低分子量肝素发生荧光能量共振转移的示意图。

图2为实施例1中金纳米颗粒（[email protected]）的激发/发射光谱图及金纳米棒（AuNRs/side-SiO₂/end-NH₂）的吸收光谱图。

图3为实施例2中不同细胞表面乙酰肝素酶的活性情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

如图1所示，基于具有高量子效率的金纳米颗粒（A）和金纳米棒（B）的荧光猝灭效应特性，本发明通过对直径小于10 nm的低分子量肝素进行共价双标记，利用荧光能量共振转移（FRET）的方式检测肝素酶降解后底物的 FRET 值变化来反映乙酰肝素酶活性值，从而有效避免二次裂解对乙酰肝素酶活性测定带来的影响。

本发明的金纳米颗粒及金纳米棒能特异性地分别共价结合于低分子量肝素的非还原末端与还原末端，制备金纳米材料修饰的低分子量肝素，为研究肿瘤细胞表面乙酰肝素酶的表达及活性检测提供了良好的支撑。同时本发明中金纳米颗粒或金纳米棒也可对其他体内蛋白进行特异性的共价修饰，为蛋白之间相互作用和其构象变化的研究提供了新颖的监测策略。

荧光能量共振转移（FRET）是指当两个荧光分子距离靠近时（小于10 nm）发生的能量转移的现象，常用于检测不同两种不同小分子的位置关系。本发明中选择的低分子量肝素（LWMH）的长度小于 10 nm，因此标记在 LWMH 两端的金纳米颗粒与金纳米棒会发生能量共振转移。

实施例1

制备双标记的低分子量肝素

1. 金纳米颗粒（[email protected]）的制备

取78.7 mg HAuCl₄·4H₂O 溶解于20 mL的双蒸水中，搅拌充分溶解， 配置浓度为10mM四氯金酸水溶液。取3.0 mL上述溶液，加入4.15 mL 双蒸水、2.85 mL 10 mM 还原型谷胱甘肽（GSH）溶液，充分搅拌，设定温度为90 ℃，反应50 min，即获得[email protected]溶液，荧光分光光度计测定最佳激发波长及发射波长。为获得最佳荧光强度，通过摸索谷胱甘肽与四氯金酸的摩尔比例以提高金纳米团簇的荧光性质。实验设定两者摩尔比，[GSH]/[HAuCl₄]摩尔比为 0.8:1-1.1:1。反应结束后，以每分钟 12000 转的速度离心去除大颗粒，利用分子量为500 Da 的透析膜进行过夜透析后，双蒸水重悬金纳米颗粒，4 ℃ 避光保存备用。

为获得表面含有巯基的金纳米颗粒，对上述的[email protected]进行半胱氨酸酰胺缩合反应。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，羧基活化试剂），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，偶联剂），实验设定 [EDC] / [NHS]摩尔比为1: 2.5，保证加入EDC的浓度约为金纳米颗粒浓度的10倍，且加入等摩尔量的半胱氨酸，室温下缓慢混合2 h，利用分子量为500Da 的透析膜进行过夜透析后，双蒸水重悬金纳米颗粒，4 ℃ 避光保存备用，即获得金纳米颗粒[email protected]。

2. 金纳米棒（AuNRs/side-SiO₂/end-NH₂）的制备

金纳米棒根据种子生长法进行制备。具体步骤如下：向0.25 mL 10 mM HAuCl₄·4H₂O水溶液中缓慢滴加9.5 mL 10 mM 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液，充分搅拌后，缓慢滴加预冷的0.6 mL 10 mM NaBH₄溶液，混匀后，快速剧烈搅拌2 min，室温静置2 h，即获得金种溶液。另取9.5 mL 10 mM CTAB溶液，依次加入0.5 mL 10 mM HAuCl₄溶液、140 μL 10 mMAgNO₃溶液、0.055 mL 0.1 M抗坏血酸溶液，搅拌均匀。取12 μL金种溶液缓慢滴加至上述溶液中，搅拌10 s后静置24 h，即获得金纳米棒（AuNRs）溶液。可根据调整AgNO₃加入的量调节金纳米棒的最大吸收度。设置AgNO₃加入的量为80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、180 μL、210μL、240 μL。反应结束后，10000 rpm离心15 min，去除上清中未反应和过量的试剂，重复两次，重悬至双蒸水中，备用。

为获得表面含有氨基的金纳米棒，取上述AuNRs溶液，加入100 μL 10 mM 半胱胺溶液，室温下搅拌3 h，反应结束后，10000 rpm离心15 min，去除上清中未反应和过量的试剂，重复两次，重悬至双蒸水中，备用，即获得表面氨基化的AuNRs-NH₂溶液。

由于低分子量肝素（LWMH）表面带有负电荷，而AuNRs-NH₂溶液带有正电荷，为避免发生电荷相互作用，本发明采用硅化处理AuNRs-NH₂溶液，使其表面带有负电荷。具体步骤如下：向3 mL AuNRs-NH₂溶液中顺序添加80 μL TEOs溶液（1.75 wt% 溶解于乙醇）、30 μL0.1 M NaOH溶液，室温下轻轻搅拌10 h，即获得AuNRs/side-SiO₂/end-NH₂ 溶液。通过改变TEOs溶液的加入量来调节金纳米棒硅化的表面积，最终包硅同时使得金纳米棒的两端暴露。实验设置TEOs溶液的加入量为60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL。反应结束后，10000 rpm离心15 min，去除上清中未反应和过量的试剂，重复两次，重悬至双蒸水中，备用。

3. 双标记低分子量肝素（LWMH）的制备

通过对 LWMH 上的羧基进行酯化以增大末端双键反应活性，然后利用硼酸催化剂催化的迈克尔加成反应将表面含有巯基的金纳米颗粒（A）定点的键合至 LWMH 非还原末端，最后在碱性条件下脱去保护酯，从而形成非还原性末端标记的 A-LWMH。在此基础上，利用催化剂硼氢***将表面含有氨基的金纳米棒（B）标记于 LWMH-M 的还原末端获得肝素酶活性测定的 FRET 探针底物A-LWMH-B。

（1）制备LWMH苄索氯胺酯：500 mg LWMH溶解于5 mL水中（溶液A），1.25 g苄基氯胺溶解于15 mL水中（溶液B），将溶液B缓慢滴入溶液A中，产生白色固体，1000 rpm搅拌1 h，静置1 h，去上清，加入等体积的水搅拌15 min，静置30 min，重复一次，抽滤，30 ℃ 减压干燥20 h。取上述LWMH苄索氯铵盐0.59 g加入23.15 mL 二氯甲烷完全溶解后，缓慢滴加4.915mL苄基氯，30 ℃，400 rpm搅拌24 h，获得52 mg LWMH苄索氯胺酯。

（2）A-LWMH的制备：取 45 mg LWMH 苄索氯铵酯加至 10 mL甲酰胺溶液中，50 ℃加热至完全溶解，另取表面含有巯基的金纳米颗粒固体（58.8 mg，0.3 mmol）和硼酸（18.6mg，0.3 mmol）加入甲酰胺溶液，50 ℃ 避光反应 24 h。 反应结束后，使用截留分子量为500 的透析袋于50% 乙醇中透析 48 h，除去未反应的金纳米颗粒分子，冷冻干燥得到金纳米颗粒标记的A-LWMH。

（3）A-LWMH-B的制备：取 15 mg金纳米颗粒标记的A- LWMH 溶解于560 μL蒸馏水中，4 mg 表面含有氨基的金纳米棒溶解于 158 μL醋酸/DMSO（3：17）溶液，两者混合匀后，加入 25 mg 硼氢***溶液， 37 ℃ 反应 16 h。反应结束后，加入 500 μL DMSO 溶解析出的沉淀，使用截留分子量为 500 的透析袋透析 24 h 除去未反应的物质，冷冻干燥后获得 FRET 底物A-LWMH-B。

如图2所示，通过荧光分光光度计扫描金纳米颗粒（[email protected]）激发波长和发射波长发现，其最佳激发波长（λex）为560 nm，最佳发射波长（λem）为 824 nm，同时利用紫外分光光度计测得金纳米棒（AuNRs/side-SiO₂/end-NH₂）的最佳吸收峰为825 nm，结果表明金纳米颗粒（[email protected]）的发射波长与金纳米棒（AuNRs/side-SiO₂/end-NH₂）的纵向表面等离子体共振吸收峰（LSPR峰）重叠率达到 95%以上，因此选择金纳米棒（AuNRs/side-SiO₂/end-NH₂）作为金纳米颗粒（[email protected]）的受体基团，组成能量共振转移分子对。

实施例2

将A-LWMH-B用于检测肿瘤细胞表面乙酰肝素酶

利用DMEM配置1 mg/mL 的 A-LWMH-B 双标记荧光底物，取100 uL上述底物溶液，分别加入已培养24h的100 uL，细胞密度为1*10⁵个不同的肿瘤细胞（***细胞Hela/乳腺癌细胞MCF-7/乳腺癌细胞MAB-MD-231/ 肺癌细胞A549）和正常细胞293t细胞中，37 ℃，5% CO₂，分别培养12 h并记录 560 nm激发下荧光值的变化情况。

由于乙酰肝素酶在多种恶性肿瘤中有高表达，并与恶性肿瘤细胞侵袭及转移密切相关，因此可利用本发明中制备的金纳米颗粒和金纳米棒双修饰的低分子量肝素监测肿瘤细胞表面乙酰肝素酶表达及活性情况，即通过监测金纳米颗粒激发波长560 nm处荧光值的变化情况来判断肿瘤细胞的转移情况结果。双修饰的低分子量肝素与肿瘤细胞混合后，其表面的乙酰肝素酶发生特异性降解双修饰的低分子量肝素，如图3所示，相对于正常细胞组人肾上皮细胞系（293t）而言，癌细胞组的 FRET 荧光值均发生了不同程度的升高，如乳腺癌细胞（MAB-MD-231）体系中荧光值（RFU）相比于正常细胞而言提高至7824，进一步说明乳腺癌细胞（MAB-MD-231）表面的乙酰肝素酶的表达量最高，其转移的能力更强，其次为***细胞（Hela）。