具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

一、试验材料

1、供试菌株

多孢木霉(Trichoderma polysporum)HZ-31菌株由青海省农业有害生物综合治理重点实验室分离保存，并于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12867。

2、供试植物

藜C.album叶片、野燕麦A.fatua叶片、密花香薷E.densa叶片、萹蓄P.aviculare叶片、薄蒴草L.holosteoides叶片、酸模叶蓼P.lapathifolium叶片、野燕麦A.fatua种子、油菜B.napus种子。

二、试验方法

1、多孢木霉HZ-31菌株发酵培养及活性物质生测

(1)多孢木霉HZ-31菌株发酵液和发酵滤液的制备

将多孢木霉菌株的斜面菌种制备成菌悬液，振荡混匀，以体积分数为2％接种量接种于PDB培养液，在25℃、150r/min条件下振荡培养120h，获得发酵液。摇瓶发酵完成后，发酵液用4层纱布过滤，去除菌丝体及杂质。于4000r/min离心30min，获得上清液。放于4℃冰箱中静置24h后离心，去除沉淀物，获得发酵滤液。

(2)多孢木霉HZ-31菌株发酵液及发酵滤液对野燕麦和油菜种子萌发的影响

采用培养皿滤纸发芽法进行试验。选取饱满完整的野燕麦和油菜种子，用无菌水冲洗消毒。在直径为9cm的培养皿中铺上滤纸，分别加入待测生防菌发酵液及发酵滤液5mL，每皿置20粒种子进行种子萌发试验，每处理重复3次，以无菌水发芽处理作为对照。25℃条件下黑暗培养，每天打开盖子通气1h，隔天每个培养皿补充相应处理液5mL，采用ISTA规定的方法于第3d进行首次计数，之后每天一次，第7d进行末次计数。

以种子发芽长度超过种子本身长度作为种子萌发的标准，种子萌发抑制率计算公式为。

发芽率(PG)(％)＝第7d正常发芽种子总数/测试种子总数×100％。

种子萌发抑制率(RI)(％)＝[对照种子萌发率(％)-处理种子萌发率(％)]/对照种子萌发率(％)×100％。

2、不同有机溶剂萃取物活性测定

(1)不同有机溶剂萃取

对多孢木霉发酵滤液采用正丁醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯4种不同极性有机溶剂进行等体积萃取，萃取3次，合并相同有机相。正丁醇相45℃下旋转蒸发，石油醚相和氯仿相37℃下减压旋转蒸发，乙酸乙酯相34℃下旋转蒸发，各萃取相旋蒸至有机溶剂全部挥发，粗提物浓缩获得浸膏。各有机相浸膏用甲醇预溶后，再加入蒸馏水进行溶解，配制成5mg/mL和3mg/mL粗提物溶液备用。采用离体叶片接法和种子萌发法测定除草活性，判断其活性物质的极性。采用离体叶片接种法和种子萌发法进行活性追踪，根据叶片受侵染状况及种子萌发抑制率确定除草活性物质极性组分。

(2)离体叶片处理法

田间采集新鲜的野燕麦、冬葵、密花香薷、萹蓄、酸模叶蓼、薄朔草、藜杂草叶片，带回室内用流动水冲洗后盛放在已灭菌并铺有滤纸的大培养皿(Φ＝15cm)中，采用针刺法将不同有机溶剂粗提物5mg/mL溶液定量滴加在叶片上，甲醇作为对照。对7种供试杂草叶片受侵染状况进行不定期观测，通过叶片发黄、失绿、枯萎等病害症状确定侵染程度。比较4种极性有机溶剂粗提物对不同杂草叶片的离体致病性。

(3)种子萌发处理法

将种子整齐摆放于铺有滤纸的种子培养皿中，每皿野燕麦种子4粒、油菜种子8粒，加入浓度为5mg/mL的各有机相粗提物溶液各100uL，为减少溶剂对种子萌发的影响，粗提物溶液滴加到滤纸上，待滤纸完全干后再均匀滴加0.5ml灭菌水，每个处理5次重复，甲醇作为空白对照。5d后统计发芽率和抑制率。

将滤纸平铺在经灭菌处理的玻璃培养皿中，野燕麦种子20粒，油菜种子20粒，分别加入各有机相浓度3mg/mL粗提物溶液各100uL，待滤纸完全干后再均匀滴加3mL灭菌水，每个处理3次重复，甲醇作为空白对照。5d后统计发芽率和抑制率。

3、薄层层析(TLC)检测及生物活性测定

将正丁醇相粗体物和乙酸乙酯相粗提物用甲醇预溶，在薄层层析硅胶板(5×20cm)上用毛细管对粗提物溶液进行点样，点样样品线距离短边1cm，点样直径不超过5mm，保持每次点的样品量基本一致，完成点样后电吹风吹干备用；层析液中展开剂选用甲醇和二氯甲烷的不同比例，分别是1:5、1:10、1:15配比。展开剂倒入层析缸中，再将点好样品的硅胶板放入层析缸中展开。待条带在薄层板上展开后，将层析板取出，自然风干。以带条带的薄层层析硅胶板作为载体，将1.5％的水琼脂培养基轻轻倒在薄层板上，使培养基平铺整个板，厚度保持约0.3-0.5cm。将野燕麦种子与油菜种子分行整齐摆放于铺有培养基的层析板上，再将层析板放在保湿环境下，例如架在盛有水的塑料盒中，置于25℃温箱中培养，25℃黑暗保湿培养，3d后观察种子萌发情况，根据条带抑制种子萌发的部位，确定该菌株产生的活性物质的RF值和层析液中最佳展开剂比例。

4、活性物质柱层析及生物活性测定

(1)活性物质柱层析

由薄层层析结果确定层析液的最佳比例，故柱层析采用梯度法淋洗。

样品采用不同有机溶剂梯度法淋洗，首先选用的比例是薄层层析比例的2倍开始淋洗，如果直接用薄层层析得到的展开剂作为淋洗液会使极性偏大，之后逐渐提高有机溶剂比例，本实验以甲醇与二氯甲烷比例1:20开始淋洗，然后依次是1:15，1:10，1:5梯度淋洗，最后用纯甲醇把剩余样品全部淋洗出来。收集时控制流速在每秒1-2滴左右，整个过程保证溶剂覆盖吸附剂。将各瓶薄层层析分析：(1)硅胶板准备。在1/5处用铅笔划线。(2)点样。柱层析分离得到的各馏分，使用毛细管间隔均匀点至硅胶板上，防治样品扩散。(3)展开。展开剂是甲醇：二氯甲烷＝1:10的比例。(4)紫外显色：在254nm、263nm紫外灯下显色。将结果相近的样品合并并蒸干，将合并后的馏分浓缩干燥，进行种子萌发活性测试。

(2)各馏分活性测试

将种子整齐摆放于铺有滤纸的种子培养皿中，野燕麦种子每皿5粒、油菜种子8粒，皿中加入100uL柱层析浓缩合并后的馏分溶液，待滤纸上的有机溶剂全部蒸发后，再滴加0.5mL无菌水。每处理重复4次，以只加灭菌水的处理作为对照。25℃培养箱中黑暗培养，不定期观察种子萌发情况，5d后统计实验结果。

其中，种子萌发抑制等级及分级标准见表1所示。

表1种子萌发抑制作用分级标准

5、高效液相色谱分析(HPLC)及活性追踪

取各馏分溶液，于超声波清洗仪中超声溶解，摇匀，精密吸取1mL，用有机滤膜过滤至棕色进样瓶中，作为待分离样品。设置流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱(95％B；90％B；80％B；70％B；60％B；50％B；45％B；40％B；35％B；30％B；25％B；15％B；10％B；5％B)；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：220nm；柱温：30℃。根据样品的检测峰及其保留时间，分别对所需部分进行收集。对各吸收峰对应的有效成分进行手动收集，检测器后的管路为0.18mmPEEK管，滞后体积可忽略不计。从出峰开始收集完整峰，重复多次收集。用甲醇润洗旋蒸瓶，活性成分在38℃条件下旋蒸蒸干。后在旋蒸瓶中加入1mL蒸馏水，于超声波清洗仪中将有效成分超声溶解，备用。

对各个收集到的组分进行种子萌发实验，受体材料为野燕麦种子和油菜种子，挑选健康饱满外皮完好的野燕麦种子和油菜种子，置于垫有一层滤纸的种子萌发皿中，野燕麦8粒/皿，油菜10粒/皿，在种子萌发皿中分别加入收集到的各组分，每皿200uL，对照每皿加入蒸馏水200uL，在25℃黑暗条件下恒温培养，每隔24h补水并观察发芽情况，5d后统计发芽率及抑制率。对具有除草活性的组分分别进行制备，得到纯品。

按照流动相的最佳配比，进行制备液相色谱富集样品，大量制备收取纯品，高效液相制备条件为：COSMOSIL5 C18-MS-Ⅱ，30mm I.D.×250mm制备色谱柱，UV检测器(220nm)，流速15mL/min。收集完目标峰后，对收集的样品进行旋蒸浓缩。

6、HZ-31纯品结构鉴定

核磁共振分析：单体化合物用合适的氘代溶剂进行溶解，转移至核磁管中进行核磁共振检测。获得¹H NMR、¹³C NMR核磁共振谱，通过¹³C核和氢核的化学位移值，查询微谱数据，经过比对初步判断化合物的结构。

质谱分析化合物的分子量：用色谱甲醇溶解待测样品，注入到质谱仪中，选用电喷雾电离子源(ESI)进行质谱的检测，计算化合物的分子量。

核磁(NMR)分析条件：布鲁克ADVANCE III 400MHz，溶剂使用氘代甲醇，氢谱共振频率400MHz，分辨率0.244532Hz，碳谱共振频率100MHz，碳谱分辨率0.733596Hz。

利用化合物氢谱、碳谱、质谱等谱图的解析，结合文献调研，确定化合物的结构。利用Chemdraw 12.0进行结构绘制。

7、单体化合物活性验证

参照上述“高效液相色谱分析(HPLC)及活性追踪”中的种子萌发方法，对分离获得的单体化合物除草活性进行再次验证。每处理3次重复。

三、结果与分析

1、多孢木霉HZ-31发酵培养及活性物质生测

由表2可以看出，HZ-31菌株发酵液对野燕麦和油菜的种子萌发抑制率分别为70.00％和86.67％，HZ-31菌株发酵滤液对野燕麦和油菜的种子萌发抑制率分别为80.00％和91.67％。对胚根、胚芽生长抑制作用显著(图1至图4)。说明活性物质存在于发酵滤液和发酵液中，且发酵滤液中活性高于发酵液。

表2 HZ-31菌株发酵液及发酵滤液对野燕麦和油菜种子萌发的影响

2、不同有机溶剂萃取物活性测定

(1)离体叶片处理法

用5mg/mL的乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚、氯仿相处理7种杂草叶片，粗提物溶液处理后，杂草叶片出现黄化，部分叶面变褐(图5)。正丁醇粗提物对密花香薷、酸模叶蓼、冬葵离体叶片具有强烈的致病性，侵染后的病斑面积占整个叶面积的60％以上。对野燕麦、萹蓄、薄蒴草有中度侵染，病斑面积占整个叶面积的16％-59％。对藜有轻度侵染。乙酸乙酯相粗提物对藜和萹蓄叶片有轻微的致病性，对其余5种杂草叶片表现出中度侵染。石油醚相粗提物对藜、萹蓄和酸模叶蓼叶片有轻微的致病性，对其余4种杂草叶片表现出中度侵染。氯仿相粗提物对密花香薷和薄蒴草叶片有轻度侵染，对野燕麦和冬葵叶片有中度侵染(表3)。

结果表明：不同有机相致病效果由强到弱表现为：正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。确定最佳活性组分在正丁醇相中。

表3 4种极性有机溶剂粗提物对不同杂草离体叶片的致病性比较

注：“-”代表没有症状，“+”代表轻微症状，病斑面积占整个叶面积的15％左右；“++”代表中度症状，病斑面积占整个叶面积的16％-59％；“+++”代表重度症状，病斑面积占整个叶面积的60％-80％；“++++”代表严重症状，病斑面积占整个叶面积的80％-100％。

(2)种子萌发处理法

4种有机溶剂萃取相粗提物5mg/mL溶液对野燕麦和油菜种子萌发均有强烈的抑制作用(图7)，除乙酸乙酯外，其余处理完全抑制胚芽、胚根生长，发芽抑制率为100％，无显著性差异(表4)。

乙酸乙酯萃取相粗提物和正丁醇相粗提物溶液对种子萌发的抑制作用表明，3mg/mL浓度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麦和油菜种子的萌发，而该浓度下乙酸乙酯萃取相粗提物对野燕麦和油菜种子萌发抑制效果不及正丁醇相粗提物(图8，图9)。乙酸乙酯相粗提物对野燕麦种子发芽抑制率为16.67％，对油菜种子发芽抑制率为53.70％(表4)。因此，粗提物活性测定以离体叶片生测法和种子萌发结果为依据，确定最佳活性组分在正丁醇相中。

表4 4种有机相粗提物对野燕麦、油菜种子的抑制作用

3、薄层层析TLC检测除草活性

经TLC检测确定层析展开剂比例，将菌株HZ-31萃取样品进行薄层层析分析，最终确定粗提物在甲醇：二氯甲烷＝1：10展开体系中展开，条带清晰，且条带间距较大。经过生测跟踪，确定了样品中除草活性物质的Rf＝0.5，此条带位置的除草活性物质对野燕麦和油菜种子萌发抑制作用显著，胚根伸长被显著抑制。TLC薄层板上Rf<0.5的物质条带，对野燕麦和油菜种子萌发抑制作用次之，TLC薄层板上Rf>0.5的物质条带，对野燕麦和油菜种子萌发抑制作用最弱(图10)。

4、活性物质柱层析及生物活性测定

(1)活性物质柱层析

根据薄层层析分离实验结果，确定柱层析有机溶剂配比采用甲醇与二氯甲烷1:20，1:15；1:10；1:5依次进行梯度淋洗，最后纯甲醇冲洗，每100mL收集为一个馏分，共收集到了160瓶样品。每瓶洗脱液进行TLC板检测，对TLC板上条带数目和位置相同的洗脱液进行合并、浓缩，得到12个馏分。合并后的12个馏分分别浓缩干燥成固体浸膏状。用少量甲醇溶解，进行种子萌发活性测试。

(2)各馏分活性测试

将柱层析得到的活性物质粗品进行大量薄层层析分离，合并相同组分，合并后得到12个馏分。

表5薄层层析所得馏分的种子萌发活性测试

表5结果表明：柱层析后所得到的馏分都对野燕麦表现出不同程度的活性，其中馏分2对野燕麦和油菜种子萌发的抑制作用最强，达到了5级，馏分1、馏分3、馏分10和馏分12抑制等级为4级，馏分11抑制等级为3级，馏分6抑制等级为2级，馏分4、馏分5、馏分8抑制等级为1级，馏分7、馏分9表现无活性(表5，图11)。确定馏分1、馏分2、馏分3、馏分6、馏分10、馏分11、馏分12具有较好的除草活性，除草活性由强到弱依次是：馏分2>馏分1、馏分3、馏分10、馏分12>馏分11>馏分6。

5、高效液相色谱分析(HPLC)及活性追踪

(1)1号馏分液相色谱分离

经过梯度洗脱，流动相20％B时，峰高峰宽适中，可获得较好的分离。UV检测器(220nm)，流动相为甲醇：水＝20：80，流速1mL/min。1号馏分色谱分离图见图12。

由图12可见，相邻主峰分离度大于1，各色谱峰均无拖尾，重复进样20次，表明液相色谱分离结果稳定，1号馏分各吸收峰均得到良好的分离。

将1号馏分分离到的5个吸收峰分别进行种子萌发抑制作用测定。吸收峰1和吸收峰3对野燕麦、油菜种子萌发具有显著的抑制作用(表6，表7)。吸收峰3对对野燕麦种子和油菜种子的萌发抑制率最高，分别是87.5％和70％；吸收峰1对野燕麦种子和油菜种子的萌发抑制率分别是62.5％和60％。吸收峰1和吸收峰3其出峰保留时间为8.126min和22.722min，分别将其标记为组分1和组分2，进行收集。

表6 HZ-31菌株1号馏分各组分对燕麦种子萌发的影响

表7 HZ-31菌株1号馏分各组分对油菜种子萌发的影响

(2)2号馏分液相色谱分离

经过梯度洗脱，流动相20％B时，峰高峰宽适中，可获得较好的分离度。UV检测器(220nm)，流动相为甲醇：水＝20：80，流速1mL/min。2号馏分在220nm波长下的色谱图见图13。各色谱峰均无拖尾，重复进样20次，表明液相色谱分离结果稳定，2号馏分各吸收峰均得到良好的分离。

将2号馏分分离到的7个吸收峰分别进行种子萌发抑制作用测定。吸收峰6对野燕麦、油菜种子萌发具有显著的抑制作用(表8，表9)。对野燕麦和油菜种子萌发抑制率分别是87.5％和70.0％。吸收峰6出峰保留时间为22.918min，将其标记为组分3，进行收集。

表8 HZ-31菌株2号馏分各组分对燕麦种子萌发的影响

表9 HZ-31菌株2号馏分各组分对油菜种子萌发的影响

(3)3号馏分液相色谱分离

经过梯度洗脱，流动相10％B时，峰高峰宽适中，可获得较好的分离。UV检测器(220nm)，流动相为甲醇：水＝10：90，流速1mL/min。3号馏分待测菌液在220nm波长下的色谱图见图14。

由图14可见，相邻主峰分离度大于1，重复进样20次，表明液相色谱分离结果稳定，3号馏分吸收峰3得到了良好的分离。

将3号馏分分离到的3个吸收峰分别进行种子萌发抑制作用测定。吸收峰3对野燕麦、油菜种子萌发具有显著的抑制作用(表10，表11)。对野燕麦和油菜种子萌发抑制率分别是75.0％和80.0％。吸收峰3出峰保留时间为65.308min，将其标记为组分4，进行收集。

表10 HZ-31菌株3号馏分各组分对燕麦种子萌发的影响

表11 HZ-31菌株3号馏分各组分对油菜种子萌发的影响

6、单体化合物结构鉴定

化合物1：结合碳氢谱数据可以确定其分子式为C₉H₁₂O₄，分子量为184.07。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ：7.04(2H，d,J＝8Hz)，6.73(2H，d,J＝8Hz)，3.70(3H,d,J＝8Hz),3.52(3H,d,J＝8Hz)。¹³C-NMR(400MHz，MeOD)δ：156.2,131.2,130.9,116.1,115.7,73.7,64.4,64.1。通过对¹H-NMR、¹³C-MNR、ESMS、FABMS等波谱数据的分析对比，确定化合物名称为对-羟基苯基-2，3-二羟基丙基醚P-hydroxyphenyl-2,3-dihydroxypropylether。

化合物2：结合碳氢谱数据可以确定其分子式为C₉H₁₀O₃，分子量为166.06。1H-NMR(400MHz，MeOD)δ：9.52(H，s,OH)，7.78(H，d,J＝8Hz)，7.06(H,d,J＝8Hz),6.93(H,d,J＝8Hz),6.75(H,d,J＝8Hz),3.58(2H,m),3.52(2H,m)。13C-NMR(400MHz，MeOD)δ：181.0,162.1,133.2,130.9,117.1,116.7,64.3,58.1。通过对1H-NMR、13C-MNR、ESMS、FABMS等波谱数据的分析对比，确定化合物名称邻-羟基-3-羰基-1-苯丙醇O-hydroxy-3-carbonyl-1-phenylpropanol。

化合物3：结合碳氢谱数据可以确定其分子式为C₁₄H₂₂O₄，分子量为254.32。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ：7.08(2H，d，J＝8Hz)，6.72(2H，d，J＝8Hz)，4.89(4H，s)，3.60(4H，m)，3.52(4H，m)，3.32(2H，brs，OH)，2.71(4H，m)。¹³C-NMR(400MHz，MeOD)δ：131.3，130.9,116.1,73.8,64.6,64.4,39.3。通过对¹H-NMR、¹³C-MNR、ESMS、FABMS等波谱数据的分析对比，确定化合物名称为1，8-丙二醇基邻二甲苯1,8-propanediol-o-xylene。

化合物4：结合碳氢谱数据可以确定其分子式为C₆H₁₂O₄，分子量为148.07。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ：3.57(6H，m)，2.57(2H，brs)，1.15(3H,s)。¹³C-NMR(400MHz，MeOD)δ：176.4,72.5,64.3,29.9,18.5。通过对¹H-NMR、¹³C-MNR、ESMS、FABMS等波谱数据的分析对比，确定化合物名称为2,3-二羟基丙酸丙酯2,3-dihydroxypropyl propionate。

7、单体物质活性验证

通过4种单体化合物对野燕麦、油菜种子萌发作用测定，结果表明化合物1、3、4具有较高的活性。化合物3对2种种子萌发表现出最高的抑制作用，对野燕麦种子萌发抑制率为83.33％，对油菜种子萌发抑制率为86.67％。化合物1和化合物4次之(表12，表13)。

表12单体化合物对野燕麦种子萌发的影响

表13单体化合物对油菜种子萌发的影响

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。