阅读说明：本技术 丝状菌颗粒的制造方法 (Method for producing filamentous fungus granules ) 是由 坂本岳史 入江裕 于 2018-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种制造高密度的丝状菌颗粒的方法。一种丝状菌颗粒的制造方法,其包括使丝状菌的孢子在含有阳离子性聚合物的培养液中发芽的工序。(The present invention provides a method for producing filamentous fungus granules with high density. A method for producing filamentous fungus granules, which comprises a step of germinating spores of filamentous fungi in a culture solution containing a cationic polymer.)

丝状菌颗粒的制造方法

技术领域

本发明涉及一种丝状菌颗粒的制造方法。

背景技术

丝状菌是在有机酸或酶类等的有用物质的微生物学的生产中产业上不可缺少的有用微生物。将丝状菌进行液体培养时，根据孢子接种量、培养液的pH、流动条件等，其形态变化成纤维状、块状或颗粒状等。丝状菌颗粒具有来自发酵后的培养基的分离容易等优点(例如专利文献1)。

非专利文献1中报道有：在培养液中添加特定的非离子表面活性剂，使丝状菌颗粒形成。另外，非专利文献2中报道有使黑曲霉(Aspergillus niger)的菌丝凝集体形成。

(专利文献1)日本特开平6-253871号公报

(非专利文献1)Journal of Industrial Microbiology、4、1989年、p.155-161

(非专利文献2)第48次化学工学会海报、LQ268

发明内容

本发明提供一种丝状菌颗粒的制造方法及菌丝密度高的丝状菌颗粒，所述丝状菌颗粒的制造方法包括使丝状菌的孢子在含有阳离子性聚合物的培养液中发芽的工序。

具体实施方式

本发明涉及提供一种制造高密度的丝状菌颗粒的方法。

本发明人对丝状菌的颗粒化进行了研究的结果发现：在含有阳离子性聚合物的培养液中使丝状菌孢子发芽并使颗粒形成时，可得到菌丝密度高的丝状菌颗粒。

根据本发明，可得到高密度的丝状菌颗粒。

本发明的丝状菌颗粒的制造方法为包括使丝状菌的孢子在含有阳离子性聚合物的培养液中发芽并使颗粒形成的工序的制造方法。

(丝状菌)

作为本发明中所使用的丝状菌，可举出：属于根霉(Rhizopus)属、木霉(Trichoderma)属、曲霉(Aspergillus)属、毛霉(Mucor)属的微生物等。

作为根霉(Rhizopus)属菌，可举出例如：戴尔根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopustritici)等。

作为木霉(Trichoderma)属菌，可举出例如：深绿木霉(Trichodermaatroviride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、里氏木霉(Trichoderma ressei)、绿色木霉(Trichoderma viride)等。

作为曲霉(Aspergillus)属菌，可举出例如：米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)等。

作为毛霉(Mucor)属菌，可举出东北毛霉(Mucor mandshuricus)等。

这些丝状菌单独使用即可，但也可以2种以上组合而使用。

其中，从有用物质的生产率、适用性的观点考虑，优选根霉属菌或木霉属菌，更优选戴尔根霉、米根霉。关于本说明书中的有用物质，进行后述。

(丝状菌的孢子和孢子悬浮液的制备)

丝状菌的孢子可以将丝状菌的孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)等培养基而进行静置培养，作为将培养物悬浮于液体的孢子悬浮液制备。孢子悬浮液可以适当稀释而调节为所期望的孢子数。

作为用于制备孢子悬浮液的静置培养的条件，从孢子增殖的观点考虑，培养温度优选为10℃以上，更优选为25℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为30℃以下。培养天数优选为7天以上且10天以下。

孢子悬浮液中的孢子数可以用后述的细胞计数器测量。

(孢子的发芽和颗粒化的工序)

通过将孢子悬浮液接种于培养液而进行培养，孢子发芽，成长为菌丝体，形成颗粒。

这里，本说明书中“颗粒”是指：利用液体培养菌丝自发地形成的数百μm～数mm左右的大小的菌丝块。

从丝状菌颗粒的良好的生长的观点考虑，接种于培养液的丝状菌的孢子数优选为1×10¹个-孢子/mL-培养液以上，更优选为1×10²个-孢子/mL-培养液以上，另外，从与上述同样的观点考虑，优选为1×10⁸个-孢子/mL-培养液以下，更优选为1×10⁴个-孢子/mL-培养液以下。

培养液只要是可生长丝状菌的液体培养基，则可以为将合成培养基、天然培养基及天然成分添加于合成培养基的半合成培养基的任一种。例如，可以利用马铃薯葡萄糖培养基(PDB培养基)、Luria-Bertani培养基(LB培养基)、Nutrient Broth(NB培养基)、Sabouraud培养基(SB培)等。

在培养液中，可以含有碳源、氮源、无机盐类、其它需要的营养源等。

作为碳源，可举出糖类。作为糖类，可举出：葡萄糖、果糖、木糖等单糖类、蔗糖、乳糖、麦芽糖等二糖类。糖类可以为酐或水合物。这些物质可以单独使用或2种以上组合而使用。其中，从生产率的观点考虑，优选葡萄糖。培养液中的最初的碳源浓度优选为0.1％(w/v)以上且30％(w/v)以下。

作为氮源，可举出例如：尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等含氮化合物。培养液中的最初的氮源浓度优选为0.1％(w/v)以上且1％(w/v)以下。

作为无机盐，可举出：硫酸盐、镁盐、锌盐等。

作为硫酸盐，可举出例如：硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠等。培养液中的最初的硫酸盐浓度优选为0.1％(w/v)以上且1％(w/v)以下。

作为镁盐，可举出例如：硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。培养液中的最初的镁盐浓度优选为0.0001％(w/v)以上且0.5％(w/v)以下。

作为锌盐，可举出例如：硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。培养液中的最初的锌盐浓度优选为0.0001％(w/v)以上且0.5％(w/v)以下。

(阳离子性聚合物)

在本发明中，孢子的发芽和颗粒化在含有阳离子性聚合物的培养液中进行。

本发明中所使用的“阳离子性聚合物”是指：与水混合的情况下，带正电的聚合物。阳离子性聚合物的具体的实例优选具有阳离子性基团的单体、或者具有在水中显示阳离子性的氨基的单体的聚合物、及这些单体和其它单体的共聚物或缩聚物。

作为阳离子性基团，可举出季氨基、肼基等，作为在水中显示阳离子性的氨基，可举出例如伯氨基、仲氨基、叔氨基。

从提高颗粒的密度的观点考虑，阳离子性聚合物的电荷密度优选为0.1meq/g以上，更优选为1meq/g以上，进一步优选为2meq/g以上，进一步优选为10meq/g以上。另外，从与上述同样的观点考虑，优选为100meq/g以下，更优选为50meq/g以下，更优选为30meq/g以下。

阳离子性聚合物的电荷密度优选为0.1meq/g～100meq/g，更优选为1meq/g～50meq/g，更优选为2meq/g～30meq/g，进一步优选为10meq/g～30meq/g。

这里，阳离子电荷密度是指：聚合物上的正电荷的数和该聚合物的分子量(阳离子基的反离子的重量除外)的比。阳离子电荷密度乘以聚合物分子量时，求出所给予的聚合物链中的正荷电的部位的数。阳离子电荷密度进一步作为每聚合物的克数的正电荷(具有阳离子性的氮原子)的毫当量的数(meq/g)被定义。

阳离子电荷密度的值例如可以按照以下的式(1)求出。

阳离子电荷密度(meq/g)＝1÷(含有1个具有阳离子聚合物中的阳离子性的氮原子的单位分子量)×1000···式(1)

从丝状菌颗粒的良好的生长的观点考虑，阳离子性聚合物的重均分子量(以下，也简称为分子量)优选为1,000以上，更优选为1,600以上，另外，优选为1,000,000以下，更优选为500,000以下，更优选为300,000以下，进一步优选为200,000以下。阳离子性聚合物的分子量优选为1,000～1,000,000，更优选为1,000～500,000，更优选为1,000～300,000，进一步优选为1,600～200,000。

另外，从培养时的操作性的观点考虑，阳离子性聚合物的重均分子量优选为1,000以上，更优选为2,000以上，更优选为5,000以上，更优选为100,000以上，另外，优选为500,000以下。

需要说明的是，平均分子量利用凝胶渗透色谱法(GPC)等公知的测定方法来测定，测定装置没有限制，作为实例，可举出东曹制HLC-8220系列等。

阳离子性聚合物优选为水溶性聚合物。这里，“水溶性聚合物”是指：使在105℃下干燥了2小时的聚合物溶解于25℃的水100g时，其溶解量超过10g的聚合物。阳离子性聚合物向水100g的溶解量优选为20g以上，更优选为100g以上。

作为阳离子性聚合物，例如可举出含有伯胺的聚合物、含有仲胺的聚合物、含有叔胺的聚合物、含有季胺的聚合物。作为含有伯胺的聚合物，可举出：聚烯丙基胺、烯丙基胺盐聚合物、烯丙基胺酰胺盐聚合物。作为含有仲胺的聚合物，可举出：聚二烯丙基胺、二烯丙基胺盐聚合物、二烯丙基胺盐/丙烯酰胺共聚物。作为含有叔胺的聚合物，可举出：烷基二烯丙基胺盐聚合物、烷基二烯丙基胺酰胺盐聚合物。作为含有季胺的聚合物，可举出：二烯丙基二烷基铵盐聚合物、二烯丙基二烷基铵乙基硫酸盐聚合物、二烯丙基二烷基铵盐/丙烯酰胺共聚物。另外，除上述的聚合物以外，可举出：聚乙烯亚胺、甲基乙二醇壳聚糖、胺-表氯醇共聚物、阳离子化聚乙烯醇、阳离子化纤维素、阳离子化淀粉、阳离子化瓜尔胶、二氰基二酰胺系高分子。作为上述的烷基，可举出：甲基、乙基、丙基。另外，作为上述的盐，可举出：硫酸盐、盐酸盐、醋酸盐。

烯丙基胺盐聚合物可举出烯丙基胺盐酸盐聚合物。烯丙基胺酰胺盐聚合物可举出烯丙基胺酰胺硫酸盐聚合物。二烯丙基胺盐聚合物可举出二烯丙基胺盐酸盐聚合物。烷基二烯丙基胺盐聚合物可举出：甲基二烯丙基胺盐酸盐聚合物、甲基二烯丙基胺醋酸盐聚合物。作为烷基二烯丙基胺酰胺盐聚合物，可举出：甲基二烯丙基胺酰胺硫酸盐聚合物。作为二烯丙基二烷基铵盐聚合物，可举出：聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚二烯丙基甲基乙基氯化铵、聚丙烯酸-co-二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯酰胺-co-二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯酰胺-co-丙烯酸-co-二烯丙基二甲基氯化铵、聚二烯丙基二甲基铵乙基硫酸盐、聚二烯丙基甲基乙基铵乙基硫酸盐。

作为二烯丙基二烷基铵乙基硫酸盐聚合物，可举出二烯丙基甲基乙基铵乙基硫酸盐。另外，可举出聚2-(甲基丙烯酰氧基)乙基三甲基氯化铵。

阳离子性聚合物也可以单独使用或组合2种以上而使用。

其中，从提高颗粒的密度的观点考虑，优选为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、烯丙基胺盐聚合物、二烯丙基二烷基铵盐聚合物、二烯丙基二烷基铵乙基硫酸盐聚合物、甲基乙二醇壳聚糖、阳离子化聚乙烯醇，更优选为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、烯丙基胺盐聚合物、二烯丙基二烷基铵盐聚合物，更优选为聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、二烯丙基二烷基铵盐聚合物。

从提高颗粒的密度的观点考虑，培养液中的阳离子性聚合物的含量优选为0.0001％(w/v)以上，更优选为0.001％(w/v)以上，进一步优选为0.0015％(w/v)以上。另外，从与上述同样的观点考虑，优选为2％(w/v)以下，更优选为1％(w/v)以下，进一步优选为0.5％(w/v)以下。培养液中的阳离子性聚合物的含量优选为0.0001～2％(w/v)，更优选为0.001～1％(w/v)，进一步优选为0.0015～0.5％(w/v)。

(孢子的发芽和颗粒化时的培养方法)

培养按照通常的步骤进行即可。培养通常在好气的条件下进行。

培养温度优选为20℃以上，更优选为25℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为30℃以下。

从菌体的良好的生长的观点考虑，培养基的初始pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为5以下。

就培养期间而言，将丝状菌的孢子植菌于培养液之后，优选为30分钟以上，更优选为0.5天以上，另外，优选为7天以内，更优选为6天以内，进一步优选为5天以内。

用于培养的培养槽可以适当采用以往公知的物质。可举出例如：烧瓶、通气搅拌型培养槽、鼓泡塔型培养槽等、及流化床培养槽。搅拌条件优选为80r/min以上，更优选为100r/min以上，另外，优选为250r/min以下，更优选为200r/min以下。

通过变更培养温度、培养期间、搅拌条件等，可以形成所期望的大小或外观的颗粒。

从有用物质的高的生产率和催化剂重复利用时的分离性的观点考虑，丝状菌颗粒的体积平均粒径优选为150μm以上，更优选为250μm以上，另外，优选为3000μm以下，更优选为1500μm以下。

需要说明的是，体积平均粒径通过由后述的显微镜观察形成的图像分析来测定。

(颗粒的增殖工序)

在本发明中，从提高有用物质的生产率的观点考虑，可以进行将丝状菌颗粒进一步培养而使其增殖的工序。

丝状菌颗粒的增殖中所使用的培养液没有特别限定，优选使用与使丝状菌的孢子发芽的工序的培养液不同的培养液。可举出例如含有通常所使用的葡萄糖的无机培养液。具体而言，可举出含有葡萄糖7.5以上30％以下(w/v)、硫酸铵0.05以上2％以下(w/v)、磷酸二氢钾0.03以上0.6％以下(w/v)、硫酸镁0.01以上0.1％以下(w/v)、及硫酸锌0.005以上0.05％以下(w/v)的培养基等。上述的盐可以为水合物。

作为培养条件，培养温度优选为20℃以上，更优选为25℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为30℃以下。

另外，从菌体的生长、或有用物质的生产率的观点考虑，培养基的pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为5以下。培养液的pH控制可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱、硫酸、盐酸等酸而进行。

培养期间优选为30分钟以上，更优选为6小时以上，更优选为0.5天以上，另外，优选为3天以下，更优选为2天以下，更优选为1天以下。

另外，用于培养的培养槽可以适当采用以往公知的物质。具体而言，可举出：烧瓶、通气搅拌型培养槽、鼓泡塔型培养槽、及流化床培养槽等。

培养后，丝状菌颗粒可以与培养液一起从培养槽中抽出，通过过滤、离心分离等简便的操作进行分离回收。在培养槽中仍旧残留丝状菌颗粒，也可以在相同培养槽中将丝状菌颗粒利用于物质生产。

这样得到的丝状菌颗粒的菌丝密度高。因此，该丝状菌颗粒对有用物质的发酵生产率提高是有用的。

从有用物质的生产率的观点考虑，丝状菌颗粒的密度为0.04g-干燥菌体/cm³以上，更优选为0.1g-干燥菌体/cm³以上，另外，为0.5g-干燥菌体/cm³以下，更优选为0.3g-干燥菌体/cm³以下，更优选为0.25g-干燥菌体/cm³以下。该密度用后述的实施例中记载的方法求出。

本说明书中的有用物质为通过丝状菌的培养的过程而由碳源生产的化合物。作为这样的化合物，可举出例如选自有机酸、酶、油脂及醇中的至少1种。可以使用本发明的丝状菌颗粒生产的优选的有用物质为有机酸、乙醇或酶。作为有机酸，可举出例如：富马酸、乳酸、衣康酸、苹果酸、丙酮酸等。其中，优选为选自富马酸、丙酮酸、乳酸及苹果酸中的至少1种，进一步优选为富马酸、乳酸，进一步优选为富马酸。作为酶，可举出例如：蛋白酶、氧化酶、淀粉酶、纤维素酶、异构酶。

(使用了丝状菌颗粒的有用物质的生产)

在有用物质的生产时所使用的培养液通常含有碳源。在培养液中，除碳源之外，可以含有氮源、无机盐类、其它磷源、维生素等需要的营养源等。在使用的碳源中含有适于培养的浓度的上述营养源的情况下，也可以仅使用碳源。作为碳源、氮源、无机盐类，可举出上述[0014]段落记载的化合物。

在有用物质的生产时所使用的培养液中，作为碳源，也可以使用含有糖类的糖液。可举出例如由淀粉得到的糖液、由糖蜜、废糖蜜、木质纤维素系生物质得到的糖液。可以使用这些物质1种或2种以上组合而使用。这里，本说明书中“木质纤维素系生物质”意指以纤维素、半纤维素、及木质素为主成分的生物质。作为木质纤维素系生物质，在具体例中可举出：稻秆、稻壳、麦杆、甘蔗渣、椰子壳、玉米芯、杂草、木材、及由这些物质制造的纸浆及纸等。另外，作为淀粉，可举出例如：玉米等杂壳类、大豆等豆类的提取物，作为糖蜜，可举出例如源自甘蔗、甜菜等的物质。

从生产率的观点考虑，培养液中的最初的碳源浓度优选为1％(w/v)以上，更优选为2％(w/v)以上，进一步优选为3％(w/v)以上，另外，优选为40％(w/v)以下，更优选为30％(w/v)以下，进一步优选为20％(w/v)以下。另外，培养液中的最初的碳源浓度优选为1～40(w/v)％，更优选为2～30(w/v)％，进一步优选为3～20(w/v)％。

另外，从生产率的观点考虑，培养液中的最初的氮源浓度优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.002％(w/v)以上，更优选为0.004％(w/v)以上，另外，优选为0.5％(w/v)以下，更优选为0.3％(w/v)以下，更优选为0.1％(w/v)以下。

从生产率的观点考虑，培养液中的最初的硫酸盐浓度优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.005％(w/v)以上，更优选为0.01％(w/v)以上，另外，优选为0.1％(w/v)以下，更优选为0.08％(w/v)以下，进一步优选为0.04％(w/v)以下。

从生产率的观点考虑，培养液中的最初的镁盐浓度优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.002％(w/v)以上，进一步优选为0.003％(w/v)以上，另外，优选为0.5％(w/v)以下，更优选为0.2％(w/v)以下，进一步优选为0.1％(w/v)以下。

从生产率的观点考虑，培养液中的最初的锌盐浓度优选为0.00001％(w/v)以上，更优选为0.00003％(w/v)以上，进一步优选为0.00005％(w/v)以上，而且，优选为0.1％(w/v)以下，更优选为0.05％(w/v)以下，进一步优选为0.01％(w/v)以下。

有用物质的生产时的培养温度优选为20℃以上，更优选为30℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为37℃以下。

从菌体的生长、或有用物质的生产率的观点考虑，培养液的pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为5以下。pH控制可以使用氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸钙、氨等碱、硫酸、盐酸等酸而进行。

用于培养的气体可以选择空气或氧富化过的气体。通气条件优选为0.1vvm以上，更优选为0.2vvm以上，另外，优选为2vvm以下，更优选为1vvm以下。

另外，用于培养的培养槽可以适当采用以往公知的物质，但从富马酸高的生产率的观点考虑，优选使用通气搅拌型培养槽、鼓泡塔型培养槽、及流化床培养槽。

培养可以以间歇式、半间歇式及连续式的任一种进行。例如，以半间歇式进行的情况下，可以将菌体和发酵液进行分离，在进行了分离回收的菌体中加入培养基而进一步进行发酵。另外，以连续式进行的情况下，可以采用在发酵槽内以一定速度供给一定量的培养基，同时抽出等量的发酵液的方法。该情况下，可以以将发酵槽内的液面高度保持在一定的方式利用液面传感器等控制液面高度。另外，也可以在发酵时仅供给碳源，碳源的供给可以以流速控制，也可以以葡萄糖浓度控制。

培养后的菌体和发酵液的分离既可以在发酵槽内利用过滤器进行固液分离，也可以一次抽出至槽外而供于液体旋风分离器或过滤等固液分离之后仅将菌体返回到发酵槽内。

(有用物资的回收)

分离后得到的发酵液可以直接或者将发酵液浓缩之后，通过晶析法、离子交换法、溶剂提取法、或者将作为碱土金属盐析出的后析出物进行酸分解的方法等，由发酵液将生成物进行分离并回收。

关于上述的实施方式，本发明进一步公开以下的制造方法。

＜1＞一种丝状菌颗粒的制造方法，其中，包括使丝状菌的孢子在含有阳离子性聚合物的培养液中发芽的工序。

＜2＞根据＜1＞所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，丝状菌优选为选自属于根霉(Rhizopus)属、木霉(Trichoderma)属、曲霉(Aspergillus)属及毛霉(Mucor)属的微生物中的1种或2种以上，更优选为选自戴尔根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopusoryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopustritici)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、里氏木霉(Trichoderma ressei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)及东北毛霉(Mucor mandshuricus)中的1种或2种以上。

＜3＞根据＜1＞所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，丝状菌优选为根霉(Rhizopus)属菌或木霉(Trichoderma)属菌，更优选为戴尔根霉(Rhizopus delemar)、米根霉(Rhizopus oryzae)或里氏木霉(Trichoderma ressei)。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，使丝状菌的孢子以优选为1×10¹个-孢子/mL-培养液以上、更优选为1×10²个-孢子/mL-培养液以上、另外优选为1×10⁸个-孢子/mL-培养液以下、更优选为1×10⁴个-孢子/mL-培养液以下的孢子数接种于含有阳离子性聚合物的培养液而使孢子发芽。

＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，培养液优选含有碳源、氮源及无机盐类。

＜6＞根据＜5＞所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，培养液中的最初的氮源浓度优选为0.1％(w/v)以上且1％(w/v)以下，最初的硫酸盐浓度优选为0.1％(w/v)以上且1％(w/v)以下，最初的镁盐浓度优选为0.0001％(w/v)以上且0.5％(w/v)以下，最初的锌盐浓度优选为0.0001％(w/v)以上且0.5％(w/v)以下。

＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，培养液中的阳离子性聚合物的含量优选为0.0001％(w/v)以上，更优选为0.001％(w/v)以上，进一步优选为0.0015％(w/v)以上，另外，优选为2％(w/v)以下，更优选为1％(w/v)以下，进一步优选为0.5％(w/v)以下，另外，优选为0.0001～2％(w/v)，更优选为0.001～1％(w/v)，进一步优选为0.0015～0.5％(w/v)。

＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，阳离子性聚合物的电荷密度优选为0.1meq/g以上，更优选为1meq/g以上，进一步优选为2meq/g以上，进一步优选为10meq/g以上，另外，优选为100meq/g以下，更优选为50meq/g以下，进一步优选为30meq/g以下，另外，优选为0.1meq/g～100meq/g，更优选为1meq/g～50meq/g，更优选为2meq/g～30meq/g，进一步优选为10meq/g～30meq/g。

＜9＞根据＜1＞～＜8＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，阳离子性聚合物的重均分子量优选为1,000以上，更优选为1,600以上，另外，优选为1,000,000以下，更优选为500,000以下，更优选为300,000以下，进一步优选为200,000以下，另外，优选为1,000～1,000,000，更优选为1,000～500,000，更优选为1,000～300,000，进一步优选为1,600～200,000。

＜10＞根据＜1＞～＜8＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，阳离子性聚合物的重均分子量优选为1,000以上，更优选为2,000以上，更优选为5,000以上，更优选为100,000以上，另外，优选为500,000以下，另外，优选为1,000～500,000，更优选为2,000～500,000，进一步优选为5,000～500,000，进一步优选为100,000～500,000。

＜11＞根据＜1＞～＜10＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，阳离子性聚合物优选为水溶性阳离子性聚合物。

＜12＞根据＜1＞～＜11＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，阳离子性聚合物优选为选自聚二烯丙基二烷基铵盐或其共聚物、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺或其盐、甲基乙二醇壳聚糖、胺-表氯醇共聚物、阳离子化聚乙烯醇、阳离子化纤维素、阳离子化淀粉、阳离子化瓜尔胶、二氰基二酰胺系高分子、及聚2-(甲基丙烯酰氧基)乙基三甲基氯化铵中的1种或2种以上，更优选为选自聚烯丙基胺或其盐、甲基乙二醇壳聚糖、聚二烯丙基二烷基铵盐或其共聚物、聚乙烯亚胺及阳离子化聚乙烯醇中的1种或2种以上。

＜13＞根据＜12＞所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，聚二烯丙基二烷基铵盐或其共聚物优选为选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚二烯丙基甲基乙基氯化铵、聚丙烯酸-co-二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯酰胺-co-二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯酰胺-co-丙烯酸-co-二烯丙基二甲基氯化铵、聚二烯丙基二甲基铵乙基硫酸盐、及聚二烯丙基甲基乙基铵乙基硫酸盐中的1种或2种以上。

＜14＞根据＜1＞～＜13＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，培养温度优选为20℃以上，更优选为25℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为30℃以下。

＜15＞根据＜1＞～＜14＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，含有阳离子性聚合物的培养液的初始pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为5以下。

＜16＞根据＜1＞～＜15＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，培养期间优选为30分钟以上，更优选为0.5天以上，另外，优选为7天以内，更优选为6天以内，进一步优选为5天以内。

＜17＞根据＜1＞～＜16＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，丝状菌颗粒的体积平均粒径优选为150μm以上，更优选为250μm以上，另外，优选为3000μm以下，更优选为1500μm以下。

＜18＞根据＜1＞～＜17＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，还包括在与使丝状菌的孢子发芽的工序的培养液不同的培养液中使丝状菌颗粒增殖的工序。

＜19＞根据＜18＞所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，丝状菌颗粒的增殖中所使用的培养液优选为含有葡萄糖7.5～30％(w/v)、硫酸铵0.05～2％(w/v)、磷酸二氢钾0.03～0.6％(w/v)、硫酸镁七水合物0.01～0.1％(w/v)、及硫酸锌七水合物0.005～0.05％(w/v)的培养液。

＜20＞根据＜18＞或＜19＞所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，使丝状菌颗粒增殖的工序中的培养温度优选为20℃以上，更优选为25℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为30℃以下。

＜21＞根据＜18＞～＜20＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，使丝状菌颗粒增殖的工序中的培养液的pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为5以下。

＜22＞根据＜18＞～＜21＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，使丝状菌颗粒增殖的工序中的培养期间优选为30分钟以上，更优选为6小时以上，更优选为0.5天以上，另外，优选为3天以下，更优选为2天以下，更优选为1天以下。

＜23＞根据＜1＞～＜22＞中任一项所述的丝状菌颗粒的制造方法，其中，丝状菌颗粒的密度优选为0.04g-干燥菌体/cm³以上，更优选为0.1g-干燥菌体/cm³以上，另外，优选为0.5g-干燥菌体/cm³以下，更优选为0.3g-干燥菌体/cm³以下，更优选为0.25g-干燥菌体/cm³以下。

＜24＞一种制造方法，其中，在含有碳源的培养液中使用通过＜1＞～＜23＞中任一项所述的制造方法得到的丝状菌颗粒制造选自有机酸及乙醇中的至少1种。

＜25＞根据＜24＞所述的方法，其中，有机酸优选为选自富马酸、乳酸、衣康酸、苹果酸、及丙酮酸中的至少1种，更优选为选自富马酸、丙酮酸、乳酸及苹果酸中的至少1种，进一步优选为富马酸、乳酸，进一步优选为富马酸。

＜26＞根据＜24＞或＜25＞所述的方法，其中，培养液中的最初的碳源浓度优选为1％(w/v)以上，更优选为2％(w/v)以上，进一步优选为3％(w/v)以上，另外，优选为40％(w/v)以下，更优选为30％(w/v)以下，进一步优选为20％(w/v)以下，另外，优选为1～40(w/v)％，更优选为2～30(w/v)％，进一步优选为3～20(w/v)％。

＜27＞根据＜24＞～＜26＞中任一项所述的方法，其中，培养液优选含有氮源及无机盐类。

＜28＞根据＜27＞所述的方法，其中，培养液中的最初的氮源浓度优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.002％(w/v)以上，更优选为0.004％(w/v)以上，另外，优选为0.5％(w/v)以下，更优选为0.3％(w/v)以下，更优选为0.1％(w/v)以下，最初的硫酸盐浓度优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.005％(w/v)以上，更优选为0.01％(w/v)以上，另外，优选为0.1％(w/v)以下，更优选为0.08％(w/v)以下，进一步优选为0.04％(w/v)以下，最初的镁盐浓度优选为0.001％(w/v)以上，更优选为0.002％(w/v)以上，进一步优选为0.003％(w/v)以上，另外，优选为0.5％(w/v)以下，更优选为0.2％(w/v)以下，进一步优选为0.1％(w/v)以下，最初的锌盐浓度优选为0.00001％(w/v)以上，更优选为0.00003％(w/v)以上，进一步优选为0.00005％(w/v)以上，另外，优选为0.1％(w/v)以下，更优选为0.05％(w/v)以下，进一步优选为0.01％(w/v)以下。

＜29＞根据＜24＞～＜28＞中任一项所述的方法，其中，制造选自有机酸及乙醇中的至少1种时的培养温度优选为20℃以上，更优选为30℃以上，另外，优选为40℃以下，更优选为37℃以下。

＜30＞根据＜24＞～＜29＞中任一项所述的方法，其中，培养液的pH优选为2以上，更优选为3以上，另外，优选为7以下，更优选为5以下。

＜31＞一种丝状菌颗粒，其中，密度优选为0.04g-干燥菌体/cm³以上，更优选为0.1g-干燥菌体/cm³以上，另外，优选为0.5g-干燥菌体/cm³以下，更优选为0.3g-干燥菌体/cm³以下，更优选为0.25g-干燥菌体/cm³以下。

＜32＞根据＜31＞记载的丝状菌颗粒，其中，体积平均粒径优选为150μm以上，更优选为250μm以上，另外，优选为3000μm以下，更优选为1500μm以下。

实施例

[阳离子性聚合物]

在实施例1～16中使用以下的高分子。

·聚乙烯亚胺(PEI、分子量10,000、电荷密度23.2meq/g、Alfa Asesar制)

·聚烯丙基胺(PAA-01、分子量1,600、电荷密度17.5meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·聚烯丙基胺(PAA-05、分子量5,000、电荷密度17.5meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·聚烯丙基胺(PAA-15c、分子量15,000、电荷密度17.5meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·聚烯丙基胺(PAA-25、分子量25,000、电荷密度17.5meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·聚烯丙基胺盐酸盐(PAA-HCl-01、分子量1,600、电荷密度10.7meq/g、NITTOBOMEDICAL制)

·聚烯丙基胺盐酸盐(PAA-HCl-05、分子量5,000、电荷密度10.7meq/g、NITTOBOMEDICAL制)

·聚烯丙基胺盐酸盐(PAA-HCl-3L、分子量30,000、电荷密度10.7meq/g、NITTOBOMEDICAL制)

·聚烯丙基胺盐酸盐(PAA-HCl-10L、分子量150,000、电荷密度10.7meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·聚二烯丙基二甲基氯化铵(PAS-H、分子量200,000、电荷密度6.19meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·聚二烯丙基甲基乙基铵乙基硫酸盐(PAS-24、分子量37,000、电荷密度3.32meq/g、NITTOBO MEDICAL制)

·甲基乙二醇壳聚糖(MGch、分子量150,080、电荷密度2.67meq/g、和光纯药制)

·聚烯丙基胺盐酸盐(PAH、分子量120,000～200,000、电荷密度10.7meq/g、AlfaAsesar制)

·聚烯丙基胺(PAAm、分子量15,000、电荷密度17.5meq/g、Polysciences,Inc.制)

·阳离子化聚乙烯醇(GOHSENX K-434、C-PVA、分子量78,000～86,000、电荷密度8.23meq/g、日本合成化学工业制)

[表面活性剂]

在比较例1及6中使用以下的表面活性剂。

(非离子表面活性剂)

·山梨糖醇酐单月桂酸酯：RHEODOL SP-L10、分子量346.46、花王(株)制

[聚合物]

在比较例3～4中使用以下的聚合物。

(非离子性聚合物)

·聚乙烯醇(PVA、分子量100,000、Polysciences,Inc.制)

(阴离子性聚合物)

·聚丙烯酸钠(SPA、分子量2,821,200～3,761,600、和光纯药制)

[实施例1]

＜丝状菌颗粒的制备＞

[孢子悬浮液的制备]

菌株使用由独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)获得的丝状菌戴尔根霉(R.delemar)JCM5557。就丝状菌而言，在于浅底盘内制备的PDA培养基(Difco马铃薯葡萄糖琼脂(Difco Potato Dextrose Agar)、Becton，Dickinson and Company制)上画线/涂布菌体，在30℃下静置培养，定期地进行继代。在菌体使用时从浅底盘回收孢子，使孢子悬浮于40mL的孢子回收液(NaCl 0.85％、Tween80 0.05％)。其后，将通过用无菌的孢子回收液(NaCl 0.85％、Tween80 0.05％)稀释而调节为1×10⁷个-孢子/mL的液体设为孢子悬浮液。孢子的浓度用全自动细胞计数器(TC20^TM、Bio-Rad Laboratories(株)制)进行测定。

[丝状菌的发芽及颗粒化]

在装入有已热灭菌的PDB培养基(Difco马铃薯葡萄糖肉汤(Difco PotatoDextrose Broth)、Becton，Dickinson and Company)200mL的带500mL容积挡板的三角烧瓶中以成为0.0015％(w/v)的方式含有已热灭菌的聚乙烯亚胺。将孢子悬浮液以成为2×10³个-孢子/mL的方式植菌于PDB培养基，用振荡机(PRECI社、PRXYg-98R)在27℃、170r/min的振荡条件下进行3天培养，使丝状菌发芽，得到丝状菌颗粒。

＜每丝状菌颗粒1个的密度的测定＞

培养结束后，以重量测定用取样含有菌体的培养液100mL，使用尼龙薄膜过滤器(网眼180μm、Millipore制)将丝状菌颗粒进行过滤分离。接着，将分离的丝状菌颗粒浸渍于蒸馏水200mL，使用振荡机(PRXYg-98R、Preci社制)在170r/min-27℃的条件下搅拌15分钟，进一步用上述尼龙薄膜过滤器进行过滤分离。将该清洗操作进行3次。

将清洗后的丝状菌颗粒再次用尼龙薄膜过滤器过滤，在105℃的干燥器中静置1天，得到干燥菌体。测定干燥菌体的重量，求出菌体干燥重量浓度[g-干燥菌体/L]。

就颗粒粒子数浓度[个/L]而言，清洗后，通过目视计数存在于每1mL的颗粒的个数而求出。

就每1个的颗粒体积[cm³/个]而言，清洗后，通过图像分析(KEYENCE VHX-1000)观察丝状菌颗粒，求出颗粒100个的体积平均粒径。算出每1个的颗粒体积[cm³/个]。

由以下的式(1)算出每丝状菌颗粒1个的密度。

丝状菌颗粒密度[g-干燥菌体/cm³]

＝菌体干燥重量浓度[g-干燥菌体/L]/颗粒粒子数浓度[个/L]/每丝状菌颗粒1个的体积[cm³/个](1)

[实施例2]～[实施例12]

除使用表1所示的阳离子聚合物之外，用与实施例1同样的方法得到丝状菌颗粒。

[实施例13]

使用聚烯丙基胺盐酸盐(分子量120,000～200,000、电荷密度10.7、Alfa Asesar制)作为阳离子聚合物，将添加浓度设为0.5％(w/v)，除此之外，用与实施例1同样的方法得到丝状菌颗粒。

[实施例14]～[实施例15]

将聚烯丙基胺盐酸盐的添加浓度设为0.1％(w/v)或0.01％(w/v)，除此之外，用与实施例13同样的方法得到丝状菌颗粒。

[实施例16]

＜丝状菌颗粒的制备＞

[孢子回收及冷冻贮存的制作]

菌株使用丝状菌里氏木霉(Trichoderma ressei)。就丝状菌而言，在浅底盘内制备的PDA培养基(Difco马铃薯葡萄糖琼脂(Difco Potato Dextrose Agar)、Becton，Dickinson and Company制)上画线/涂布菌体，在30℃下静置培养7天，使孢子充分地形成。静置培养之后，从浅底盘回收孢子，使孢子悬浮于孢子回收液(NaCl 0.9％、Tween800.03％)。孢子的浓度用全自动细胞计数器(TC20^TM、Bio-Rad Laboratories(株)制)进行测定。制备孢子悬浮液之后，将悬浮液和甘油水溶液(40vol％)以体积比3:1进行混合，将其混合液在超低温制冷器(三洋电机制(株))中在-80℃下保存，设为冷冻贮存。

[丝状菌的发芽及颗粒化]

将PDB培养基50mL及0.0045％(w/v)的阳离子化聚乙烯醇放入于500mL容积三角烧瓶。将三角烧瓶进行热灭菌之后，将冷冻的孢子悬浮液解冻之后，以成为1×10⁴个-孢子/mL的方式植菌于培养基，用振荡机(PRECI社、PRXYg-98R)在28℃、220r/min的振荡条件下进行2天培养，得到丝状菌颗粒。

＜每丝状菌颗粒1个的密度的测定＞

培养结束后，对含有得到的菌体的培养液50mL，通过与上述实施例1同样的方法进行清洗之后，算出丝状菌颗粒密度[g-干燥菌体/cm³]。

[比较例1]

＜丝状菌颗粒的制备＞

[孢子悬浮液的制备]

通过与上述实施例1同样的方法制备孢子悬浮液。

[丝状菌的颗粒化]

将PDB培养基200mL及0.5％(w/v)的山梨糖醇酐单月桂酸酯放入于带500mL容积挡板的三角烧瓶。将三角烧瓶进行热灭菌之后，将孢子悬浮液以成为2×10³个-孢子/mL的方式植菌于培养基，用振荡机(PRECI社、PRXYg-98R)在27℃、170r/min的振荡条件下进行3天培养，得到丝状菌颗粒。

＜每丝状菌颗粒1个的密度的测定＞

培养结束后，通过与上述实施例1同样的方法进行清洗之后，算出丝状菌颗粒密度[g-干燥菌体/cm³]。

[比较例2]

不使用添加剂，用与比较例1同样的方法进行培养。

[比较例3]

使用聚乙烯醇(0.5％(w/v))作为添加剂，除此之外，用与比较例2同样的方法得到丝状菌颗粒。

[比较例4]

使用聚丙烯酸钠(0.5％(w/v))作为添加剂，除此之外，用与比较例3同样的方法得到丝状菌颗粒。

[比较例5]

不使用添加剂，用与实施例16同样的方法进行培养。

将实施例1～16及比较例1～5的结果示于表1及表2。

[表1]

[表2]

由表1及表2可知：实施例1～16中制备的丝状菌颗粒与比较例1～5的丝状菌颗粒相比，具有高的菌丝密度。

[实施例17]

＜丝状菌颗粒的制备＞

[孢子悬浮液的制备]

通过与上述实施例1同样的方法制备孢子悬浮液。

[丝状菌的颗粒化]

丝状菌颗粒的制备在以下的2阶段的培养中进行。第一阶段的培养为孢子的发芽和颗粒化的工序，第二阶段的培养为颗粒的增殖工序。

第一阶段的培养将作为颗粒形成培养基的PDB培养基装入于30L容积通气搅拌槽((株)MITSUWA FRONTECH制)，进行热灭菌之后，使已灭菌的聚烯丙基胺(分子量15,000、电荷密度17.5、Polysciences,Inc.制)以成为0.0015％(w/v)的方式含有，以成为1×10⁴个-孢子/mL的方式植菌孢子悬浮液。就培养基液量而言，加入灭菌水并调节为15L，在液温27℃、搅拌速度300r/min、槽内压力0.040MPa、供给空气并将DO控制为1.0ppm的条件下进行3天培养。另外，使用消泡传感器，在发泡时，以添加消泡剂(1％KM-72F(信越化学制))的方式进行控制。

第二阶段的培养首先，在将槽内加压的状态下，将培养液的上清液经由设置在槽内的250μm网眼的金属过滤器，从30L容积通气搅拌槽进行排液。其后，将已灭菌的增殖培养基装入于槽内之后，以槽内液量成为15L的方式添加已灭菌的蒸馏水，以培养基浓度成为下述的方式添加各化合物。培养基浓度为：葡萄糖(和光纯药工业社制)6％(w/v)、硫酸镁七水合物0.025％(w/v)、硫酸锌七水合物0.009％(w/v)、硫酸铵0.1％(w/v)、磷酸二氢钾0.06％(w/v)。就培养而言，在27℃、搅拌速度300r/min、槽内压力0.040MPa、供给空气并将DO控制为2ppm的条件下进行12小时培养。就培养中的pH而言，适当添加7N氢氧化钠而维持4。另外，与第一阶段的培养同样地，在发泡时，以添加消泡剂(1％KM-72F)的方式进行控制。

[颗粒的回收]

将通过上述的操作得到的丝状菌颗粒培养液用尼龙网眼过滤器过滤数十秒，至滤液的滴落着落，得到湿状态的丝状菌颗粒。在第二阶段中得到的颗粒迅速地供于发酵性的评价。一部分通过与上述实施例1同样的方法进行清洗之后，算出丝状菌颗粒密度[g-干燥菌体/cm³]。

＜富马酸及乙醇生产率的评价＞

[培养方法]

在已灭菌的1L容积通气搅拌槽中添加已灭菌的培养基和制备的丝状菌颗粒(湿状态)之后，加入已灭菌的蒸馏水，将液量调节为500mL。此时的培养基组成为：葡萄糖(和光纯药工业社制)10％(w/v)、硫酸镁七水合物0.025％(w/v)、硫酸锌七水合物0.009％(w/v)、硫酸铵0.1％(w/v)、剩余为水，相对于培养基的丝状菌颗粒的占有体积成为36vol％。其后，立即进行培养第0小时的取样之后，在35℃、以搅拌速度500r/min、通气速度0.3～1.0vvm供给高浓度氧(＞90％)的条件下进行培养。其后，一边经时地进行取样，一边进行5小时培养。就pH而言，适当添加7N氢氧化钠溶液，pH(35℃)维持4。

[利用高效液相色谱(HPLC)的各种成分的测定]

将取样的发酵液使用孔径为0.20μm的醋酸纤维素制薄膜过滤器(ADVANTEC社制)过滤后，用0.0085N硫酸水溶液适当稀释，设为HPLC分析用样品。HPLC的分析条件如下所述。

·柱：ICSep ICE-ION-300

·洗提液：0.0085当量硫酸、0.4mL/min

·检测法：RI(HITACHI、L-2490)

·柱温度：40℃

·注入液量：20μL

·保持时间：40min

该分析体系中的各成分的保持时间如下所述。

·葡萄糖：16min

·富马酸：26min

·乙醇：34min

[生产速度的算出]

由发酵液的分析值，将(1)糖的消耗速度(P[g/L/h])、(2)富马酸生产速度(Q[g/L/h])及(3)乙醇生产速度(R[g/L/h])的3项目设为评价轴。由HPLC分析结果求出各成分的浓度[g/L]，利用以下的式(1)～(3)算出速度。

糖的消耗速度

P[g/L/h]＝(G₀-G)/T (1)

富马酸生产速度

Q[g/L/h]＝(F-F₀)/T (2)

乙醇生产速度

R[g/L/h]＝(E-E₀)/T (3)

(式中，G₀、F₀及E₀表示培养0小时的葡萄糖浓度、富马酸浓度、乙醇浓度，G、F及E表示培养后的葡萄糖浓度、富马酸浓度、乙醇浓度，T表示发酵时间(h)。)

[比较例6]

＜丝状菌颗粒的制备＞

[孢子悬浮液的制备]

通过与上述实施例1同样的方法制备孢子悬浮液。

[丝状菌的颗粒化]

丝状菌颗粒的制备用以下的2阶段的培养进行。

就第一阶段的培养而言，将山梨糖醇酐单月桂酸酯0.5％(w/v)及PDB培养基及0.5％(w/v)的山梨糖醇酐单月桂酸酯装入于30L容积通气搅拌槽((株)MITSUWA FRONTECH制)，进行热灭菌之后，以成为1×10⁴个-孢子/mL的方式植菌孢子悬浮液。就培养基液量而言，加入灭菌水并调节为15L，在液温27℃、搅拌速度300r/min、槽内压力0.040MPa、供给空气并将DO控制为1.0ppm的条件下进行3天培养。另外，使用消泡传感器，在发泡时以添加消泡剂(1％KM-72F(信越化学制))的方式进行控制。

第二阶段的培养用与实施例17同样的方法进行。

[颗粒的回收]

培养结束后，通过与上述实施例17同样的方法得到湿状态的丝状菌颗粒，迅速地供于发酵性的评价。一部分算出丝状菌颗粒密度[g-干燥菌体/cm³]。

＜富马酸及乙醇生产率的评价＞

用与上述实施例17同样的方法进行。

将实施例17及比较例6的评价结果示于表3。需要说明的是，结果采用从培养开始至培养结束5小时的速度。

[表3]

由表3可知，通过利用本发明的菌丝密度高的丝状菌颗粒，确认富马酸及乙醇的生产速度提高。