阅读说明：本技术 胶原纤维和由其形成的制品 (Collagen fibers and articles formed therefrom ) 是由 T·J·托德 于 2018-05-21 设计创作，主要内容包括：制造胶原纤维的方法,其包括下列的任何一个、组合或全部：使胶原组织至少部分脱细胞化；均化胶原组织；从胶原组织中分离至少一部分胶原纤维；在分离前或后将胶原纤维暴露到酸溶液；和用胶原纤维形成缝合线、织物结构、针织结构、或生物假体装置中的至少一种。(A method of making a collagen fibre comprising any one, combination or all of the following: at least partially decellularising the collagenous tissue; homogenizing the collagen tissue; separating at least a portion of the collagen fibers from the collagen tissue; exposing the collagen fibers to an acid solution before or after separation; and forming at least one of a suture, a fabric structure, a knitted structure, or a bioprosthetic device with the collagen fibers.)

具体实施方式

。在不脱离其精神的情况下，可在本发明范围内进行许多改变和改进，并且本发明包括所有这些改进。

现在将描述本发明的具体、非限制性的实施方式。应当理解，这些实施方式仅通过举例并且仅说明本发明范围内的小部分实施方式。对本发明相关领域的技术人员显而易见的多种改变和改进被认为在如所附权利要求中进一步限定的本发明的精神、范围和考虑内。

根据本文描述的方法制造的胶原纤维可用来制造缝合线、组织支架、和生物假体组织，其用于各种各样的可植入医疗装置例如支架移植物、心脏瓣膜、动脉导管、血管贴剂、和任何其他可包括生物假体组织的可植入医疗装置。胶原纤维对形成缝合线、组织支架和可植入设备尤其有利，这是因为它们的生物相容性以及也因为它们拥有基于被植入体内环境需求设计和调整缝合线、组织支架、生物假体组织的纤维取向和厚度的能力。

胶原纤维

如本文中使用的，“胶原纤维”应理解为包括胶原蛋白，其通过将均化的胶原组织与酸溶液、盐或盐溶液、或两者接触来沉淀成纤维形状(例如，具有长度和直径)。

本文所描述的胶原组织可以是生物组织。在一个实施方式中，生物组织可以是任何的结缔或胶原组织，不论来自动物或人类来源。生物组织也可以是天然心脏瓣膜、血管、皮肤、毛皮、上皮、硬脑膜、心包、小肠粘膜下层、韧带、肌腱、尾部(尤其啮齿动物尾部)、蹄和足(尤其奶牛或犊牛足)。生物组织也可以是来自动物来源的心包组织，包括但不限于牛、猪、和马的心包。生物组织可以是前述生物组织中的任何一个或组合。在一个可选实施方式中，胶原组织排除了肠、工程化组织、或两者。

可在本文所述方法中使用的酸溶液具有约7或更低、约6或更低、约5或更低、约4或更低、约3或更低、约2或更低或约1或更低的pH。酸溶液也可具有包括前述值和介于任何两个前述值之间的pH。使用的酸可以是乙酸、甲酸、和柠檬酸中的任何一个或组合。

用来沉淀胶原纤维的盐或盐溶液可包括用于沉淀胶原纤维的任何适合盐，例如，氯化钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸钠、硫酸铵中的任何一个或组合。在一个实施方式中，该盐排除了铬化合物，例如，铬盐或铬酸盐。

在将胶原组织与酸溶液和盐或盐溶液接触的实施方式中，胶原组织可首先与酸溶液和盐或盐溶液之一接触并随后与酸溶液和盐或盐溶液的另一个接触。可选地，胶原组织可与包括酸溶液和盐或盐溶液的溶液接触。

在一个任选实施方式中，以纤维形式沉淀的胶原纤维的长度或胶原纤维组的平均长度可以是约1mm或更长、约2mm或更长、约3mm或更长、约4mm或更长、约5mm或更长、约6mm或更长、约7mm或更长、约8mm或更长、约9mm或更长、约10mm或更长、约15mm或更长、约20mm或更长、约25mm或更长、约30mm或更长、约35mm或更长、约40mm或更长、约45mm或更长、约50mm或更长、约55mm或更长、约60mm或更长、约65mm或更长、约70mm或更长、约75mm或更长、约80mm或更长、约85mm或更长、约90mm或更长、约95mm或更长、约100mm或更长、约105mm或更长、约110mm或更长、约115mm或更长、约120mm或更长、约125mm或更长、约130mm或更长、约135mm或更长、约140mm或更长、约145mm或更长、约150mm或更长、约155mm或更长、约160mm或更长、约165mm或更长、约170mm或更长、约175mm或更长、约180mm或更长、约185mm或更长、约190mm或更长、约195mm或更长、和约200mm或更长。胶原纤维的长度或平均长度可以是介于任何两个前述值之间和包括前述值的任何值。

在另一个任选实施方式中，胶原纤维的直径或胶原纤维组的平均直径可以是约1,000微米或更小、约950微米或更小、约900微米或更小、约850微米或更小、约800微米或更小、约750微米或更小、约700微米或更小、约650微米或更小、约600微米或更小、约550微米或更小、约500微米或更小、约450微米或更小、约400微米或更小、约350微米或更小、约300微米或更小、约250微米或更小、约200微米或更小、约150微米或更小、约100微米或更小、约95微米或更小、约90微米或更小、约85微米或更小、约80微米或更小、约75微米或更小、约70微米或更小、约65微米或更小、约60微米或更小、约55微米或更小、约50微米或更小、约45微米或更小、约40微米或更小、约35微米或更小、约30微米或更小、约25微米或更小、约20微米或更小、约15微米或更小、约10微米或更小、约5微米或更小、和约1微米或更小。胶原纤维的直径或平均直径可以是介于任何两个前述值之间和包括前述值的值。在实施方式的进一步方面，每个胶原纤维沿其长度可具有变化的直径(例如波状)并因此表征为沿其长度具有平均直径。

制造胶原纤维的方法

在一个实施方式中，提供了制造胶原纤维的方法。方法可包括下列步骤中的任何一个、组合、或全部：从胶原组织中生产胶原蛋白粉末、使胶原组织至少部分脱细胞化、使胶原组织均化、温育胶原组织、从胶原组织中分离至少部分胶原纤维、在分离前或后将胶原纤维暴露到酸溶液中、和沉淀胶原纤维。

从胶原组织中生产胶原粉末。可粉碎胶原组织以形成胶原纤维。在一个实施方式中，冷冻胶原组织并随后粉碎成胶原粉末。在另一个实施方式中，将胶原组织干燥或脱水并随后粉碎成胶原粉末。在进一步实施方式中，将胶原组织冷冻和干燥并随后粉碎成胶原纤维。存在本领域内已知的可适用的冷冻胶原组织的多种方法，例如，将胶原组织浸没在液氮中(例如，冷却到约-175℃到-225℃的温度)、将胶原组织暴露在干冰中、和简单地将胶原组织放置在冰箱中。

使胶原组织脱细胞化。胶原组织或胶原粉末(如果使用了冷冻干燥方法)可经历脱细胞化方法。根据一个方面，脱细胞化可在胶原组织冷冻干燥之前或之后进行。根据另一个方面，脱细胞化方法可在缺少冷冻干燥步骤下进行。

脱细胞化方法旨在用于从胶原组织的所在细胞上分离胶原组织的细胞外基质(ECM)。存在各种各样可用的脱细胞化处理，例如化学、物理、酶促方法、和其组合。在一个实施方式中，脱细胞化可包括物理、化学、和酶促方法的任何一个或组合。在另一个实施方式中，脱细胞化方法可排除物理方法或酶促方法。

在一个任选实施方式中，脱细胞化可通过化学方法的一种或组合进行。根据这个实施方式的方面，胶原组织或粉末(如果冷冻干燥和研磨)可悬浮在溶胞缓冲液中。溶胞缓冲液可包括一种或多种盐(例如NaCl、Tris-HCl、和/或EDTA)、一种或多种表面活性剂、洗涤剂、或肥皂(例如，

X-100非离子型表面活性剂，Dow Chemical)和/或十二烷基硫酸钠(SDS))、或一种或多种盐和洗涤剂的组合。溶胞缓冲液可包括离子型表面活性剂(例如SDS)、非离子型表面活性剂(例如

X-100)、或两者。一个示例性溶胞缓冲液包括100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTA、0.1％的SDS和1％的

X-100。该化学方法可单独进行或与其他化学方法和/或物理方法组合进行。

在另一个任选实施方式中，可通过物理方法的一种或组合进行脱细胞化。示例性物理方法涉及温度、力、压力、声音破坏、和电破坏的使用。根据这个实施方式的一个方面，可使用温度方法。温度方法可涉及快速冻融机制。通过快速冷冻组织，在质膜周围形成微小的冰晶并溶解细胞。根据这个实施方式的另一个方面，可在胶原组织或粉末上使用压力的直接力。压力脱细胞化涉及施加于胶原组织的静水压力的受控使用。根据这个实施方式的进一步方面，也可以使用声音或电破坏。将组织暴露到电脉冲或声波中导致脱细胞化。

均化和温育胶原组织。胶原组织或胶原粉末可经历均化和温育过程。可在使用任何适合的方法和/或设备将胶原组织或胶原粉末脱细胞化后进行均化方法，例如机械地、超声地、在剪切下、和/或在压力下。适合的均化装置的实例包括转子-定子均化器。在一些实施方式中，组织或粉末悬浮在液体中，例如，水、盐溶液、或缓冲溶液。根据这个实施方式的方面，胶原组织或胶原蛋白粉末可在至少5,000rpm、至少10,000rpm、至少15,000rpm、至少20,000rpm、至少25,000rpm、或至少30,000rpm的速度下均化。在均化方法之后，胶原组织或胶原粉末可在约4℃下温育约1到12个小时或更长。

从胶原组织中分离胶原纤维。在均化和温育后，可离心胶原组织或粉末。根据这个实施方式的方面，可以悬浮液提供胶原组织或粉末并以至少约1,000rpm、至少约5,000rpm、至少约10,000rpm、至少约15,000rpm、至少约20,000rpm、至少约25,000rpm、或至少约30,000rpm的速度离心至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、或至少约30分钟。倾析上清液且用酸溶液(例如乙酸)清洗剩余的不溶物质。

在一些实施方式中，选择酸溶液使其不会溶解存在的胶原纤维。使用的酸溶液可具有约7或更小、约6或更小、约5或更小、约4或更小、约3或更小、约2或更小或约1或更小的pH。酸溶液也可具有包括前述值和介于任何两个前述值之间的pH。酸可以是乙酸、甲酸、和柠檬酸的任何一种或组合。

在一些实施方式中，酸溶液导致一些或全部的胶原纤维变成凝胶或凝胶状。凝胶或凝胶状物质可从喷丝帽中挤出形成纤维。可将纤维挤出到盐溶液中和/或与盐溶液一起挤出，其目的在下文中详细地解释。凝胶或凝胶状物质也可被静电纺丝，例如成为织物或涂层。

随后将胶原纤维移除并暴露到盐或盐溶液中进一步沉淀胶原纤维。示例性的盐包括氯化钠、磷酸钾、氯化钾、和/或硫酸铵。

缝合线

缝合线可从本文描述的胶原纤维中产生。

在一个实施方式中，单一的缝合线可从单一的胶原纤维或从编织的、扭曲的、旋纺在一起的多个胶原纤维制成。根据一个方面，无论从单一或多个胶原纤维制成的缝合线可仅由胶原纤维制造。根据另一个方面，缝合线可包括与不同的天然或合成纤维或与单丝或复丝形式的合成聚合物结合的一种或多种胶原纤维。

在另一个单独实施方式中，缝合线可以是可吸收的缝合线或不可吸收的缝合线。可吸收的缝合线可在给定的时间段后在组织中分解。不可吸收的缝合线可由经过化学处理的或与另外的材料或纤维结合后提供的胶原纤维制作，所述另外的材料或纤维通过至少部分地固定使缝合线至少部分地抵抗人体的新陈代谢，例如，如下文详细讨论的。在实施方式的一个方面中，不可吸收的胶原纤维缝合线可以是编织的缝合线，其包括与一种或多种不可吸收材料编织在一起的一个或多个胶原纤维，仅举几例不可吸收材料，例如丝、聚丙烯、聚乙烯、尼龙、聚酰胺、聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、或金属纤维。

任选地，包括胶原纤维的缝合线可用适合的涂料、软化剂或抗菌剂浸渍，或通过着色剂着色，例如，经美国联邦药物管理局(“FDA”)或其他监管机构所批准。

在优选实施方式中，缝合线符合美国药典(USP)或其他标准中所阐述的对可吸收或不可吸收缝合线的标准。

在优选实施方式中，缝合线是可吸收的缝合线或不可吸收的缝合线，其具有约1N/mm或更大、约2N/mm或更大、约3N/mm或更大、约4N/mm或更大、约5N/mm或更大、约10N/mm或更大、约15N/mm或更大、约20N/mm或更大、约25N/mm或更大、约30N/mm或更大、约35N/mm或更大、约40N/mm或更大、约45N/mm或更大、约50N/mm或更大、约55N/mm或更大、约60N/mm或更大、约65N/mm或更大、约70N/mm或更大、约75N/mm或更大、约80N/mm或更大、约85N/mm或更大、约90N/mm或更大、约95N/mm或更大、约100N/mm或更大、约105N/mm或更大、约110N/mm或更大、约115N/mm或更大、约120N/mm或更大、约125N/mm或更大、约130N/mm或更大、约135N/mm或更大、约140N/mm或更大、约145N/mm或更大、约150N/mm或更大、约155N/mm或更大、约160N/mm或更大、约165N/mm或更大、约170N/mm或更大、约175N/mm或更大、约180N/mm或更大、约185N/mm或更大、约190N/mm或更大、约195N/mm或更大、约200N/mm或更大的结拉抗张强度(N)/缝合线平均直径(mm)。在另一个优选实施方式中，可吸收的缝合线具有介于任何两个前述值之间的结拉强度。仍在另一个优选实施方式中，不可吸收的缝合线具有介于任何两个前述值之间和包括前述值的结拉强度。

在另一个优选实施方式中，缝合线是可吸收的或不可吸收的缝合线，其具有至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、和至少约95％的断裂伸长率。在另一个优选实施方式中，可吸收的缝合线具有介于任何两个前述值之间的断裂伸长率。仍在另一个优选实施方式中，不可吸收的缝合线具有介于任何两个前述值之间和包括前述值的断裂伸长率。

生物假体组织

通过在彼此周围或基底周围编织、针织或包装胶原纤维，或从纤维制造无纺材料，可使用胶原纤维生产生物假体组织。使用胶原纤维生产的生物假体组织可设计为期望的尺寸、厚度和孔隙率。随后生物假体组织可经历进一步的化学方法使其适合植入。

在一个实施方式中，胶原纤维、包括胶原纤维的缝合线、包括胶原纤维的生物假体组织、和包括胶原纤维的任何医疗装置具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、和至少约99％的胶原蛋白纯度。在另一个实施方式中，胶原纤维、包括胶原纤维的缝合线、包括胶原纤维的生物假体组织、和包括胶原纤维的任何医疗装置具有包括前述值和介于任何两个前述值之间的纯度。

胶原纤维、缝合线、或生物假体组织的进一步处理

固定方法。在一个实施方式中，由胶原纤维生产的胶原纤维、缝合线、生物假体组织或制品可经历固定或交联处理，其结果是使胶原纤维的抗原性更低和至少部分或全部交联。固定方法应理解为包括任何化学、加热或其他方法，其结果是胶原纤维得以保存和使其机械和尺寸上稳定。固定方法也可作为化学方法的一部分来使胶原纤维抵抗身体的吸收或甚至不能吸收。

固定方法可包括将胶原纤维与一种或多种固定剂接触。已知的固定剂包括醛、聚醛、二异氰酸酯、碳二亚胺、光氧化剂、和聚环氧化合物。在优选实施方式中，使用的固定剂是戊二醛。然而，一些戊二醛固定的组织的实施方式特别容易钙化，因为戊二醛固定可产生剩余的醛基和不稳定的席夫碱。剩余的醛基和席夫碱可能是钙潜在的结合位点。醛基也可氧化成已知吸引和结合钙的羧酸基团。

因此，开发了多种技术来减少戊二醛固定的组织的醛和酸水平，并因此减少其在植入到患者体内后的钙化倾向，例如，下述的封端程序。

固定方法可包括调整戊二醛固定剂溶液的pH以减少钙结合位点的产生，如Edwards Lifesciences的美国专利号6,878,168所公开，其全部内容通过引用并入本文。在优选实施方式中，戊二醛固定剂溶液的pH是约在下列范围或提供在下列范围，所述范围包括下列pH值和介于任何两个下列pH值之间：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、和9.0。

固定方法也可进一步包括与一种或多种固定剂接触后的热处理步骤。与没有热处理的戊二醛固定的组织相比，已证明戊二醛固定的组织在热处理后减少了醛和羧酸的含量，并因此显著降低了植入后的钙化。可在生物假体组织浸入溶液前、期间、后对溶液中的戊二醛固定剂进行热处理。热处理可包括加热溶液中的戊二醛固定剂至约在下列范围或提供在下列范围中的温度，所述范围包括下列温度和介于任何两个下列温度范围之间：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、和80℃。于2003年5月13日授予EdwardsLifesciences的美国专利号6,561,970中描述了用于热处理戊二醛固定的组织的示例性方法，其全部内容通过引用并入本文。戊二醛固定的组织的热处理在商业上具体为EdwardsLifesciences的Carpentier-Edwards

(TFX)组织。

封端剂和/或还原剂处理

在固定方法之后或与之同时，可用封端剂、还原剂、或两者处理胶原纤维。胶原纤维可包括固有的存在于胶原纤维中的官能团，其要么由于被交联或固定，要么由于经受了任何数量的化学或物理方法(包括本文公开的预处理、预应力、或预破坏)。在美国专利号7,972,376中描述了用封端剂和/或还原剂处理的示例性方法，其全部内容通过引用并入如同在本文中全部阐述。

在一个实施方式中，在某些情况下官能团的存在可能是不期望的，因为当植入宿主中时，它们可能促成胶原纤维的钙化。例如，醛、羧酸、胺和其他的钙潜在结合位点可相互作用或吸引钙、磷酸盐、免疫原性因子、或其他钙化前体。在另一个实施方式中，官能团的存在可能未必是不期望的，但可能提供用于进一步化学反应或用于共价结合期望与胶原纤维关联的试剂的反应基。

例如，由于它们的负电荷，戊二醛固定胶原纤维后形成的负电荷羧酸基团可能吸引正电荷的钙离子，导致胶原纤维的钙化或其他不利的细胞相互作用。

因此，可用封端剂处理胶原纤维。封端剂可以是能阻止、去除或改变官能团的任何试剂，所述官能团可实际或潜在的在胶原纤维和宿主之间产生不期望的反应，例如钙化、免疫学反应等等。

在一个实施方式中，在没有固定或交联胶原纤维的步骤下，可用封端剂处理胶原纤维。在另一个实施方式中，在固定和/或交联胶原纤维之前、期间和之后，用封端剂处理胶原纤维。

如上述解释，含醛制剂(例如戊二醛)和与胶原纤维关联的胺基团反应可导致不稳定的席夫碱的形成。因此期望进一步处理胶原纤维来用更稳定的胺替代席夫碱。

在一个实施方式中，封端剂可包括下列的任何一个或组合：胺，例如烷基胺、氨基醇和乙醇胺；氨基酸，例如赖氨酸和羟赖氨酸；氨基磺酸盐，例如牛磺酸、氨基硫酸盐、硫酸葡聚糖、和硫酸软骨素；亲水性多功能聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯亚胺；疏水性多功能聚合物；α-二羰基化合物，包括丙酮醛、3-脱氧葡糖醛酮、和乙二醛；肼，例如己二酸二酰肼；N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯；碳二亚胺，例如1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-环已基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺(CMC)、和1,3-二环己基碳二亚胺(DCC)；和2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)。

在另一个实施方式中，封端剂可以是与官能团反应的任何试剂，其中官能团是自由醛或自由羧酸。封端剂可以是胺，例如烷基胺或氨基醇。封端剂可以是乙醇胺。

在进一步实施方式中，封端剂可以是与官能团反应的任何试剂，其中官能团是胺、羟基、或巯基。根据这个实施方式，封端剂可包括羰基官能团。羰基官能团可以是醛或羧酸并且可选自一元醛、聚醛、一元羧酸、聚羧酸等等。

无论如何，封端剂和官能团之间的某些反应可产生不稳定的席夫碱，并期望将席夫碱还原成更稳定的胺。

因此，胶原纤维的处理可进一步包括用还原剂处理。可选择还原剂来还原至少一些席夫碱，席夫碱由交联剂和胶原纤维、封端剂和胶原纤维、及封端剂和交联剂反应形成。在一个实施方式中，可在有或没有固定或交联胶原纤维的情况下用还原剂处理胶原纤维。在另一个实施方式中，可在有或没有封端剂情况下用还原剂处理胶原纤维。在进一步实施方式中，可在有或没有固定或交联和封端胶原纤维的情况下用还原剂处理胶原纤维。

还原剂可以是包括氢硼化物的试剂的任何一种或组合。在一个实施方式中，还原剂可以是选自由氢硼化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、烷基硼氢化物、氨基硼氢化物、氨基硼氢化锂、和具有式XBR₃H的有机硼氢化物盐组成的组中的任何一种或组合，其中R是烷基和X是锂、钠或钾。氨基硼氢化锂，仅举几例可以是二甲氨基硼氢化锂、吗啉代硼氢化锂、和吡咯烷硼氢化锂。有机硼氢化物盐还原剂可以是三仲丁基硼(氢)化锂、三仲丁基硼(氢)化钠、三仲丁基硼(氢)化钾、或氢化铝锂。还原剂也可以是乙酰丙酮中的硫酸氢钠、甲醛中甲酸的单独、组合、或与氢硼化物还原剂组合。

胶原纤维可经过处理步骤，其中胶原纤维与溶液中的封端剂和还原剂接触。在一个实施方式中，选择封端剂来与胶原纤维有关的一个或多个官能团反应和选择还原剂来减少席夫碱。交联剂和胶原纤维的反应、封端剂和胶原纤维的反应、封端剂和交联剂的反应中的任何一种或多种可形成席夫碱。封端剂可以是胺或氨基醇，例如乙醇胺，官能团可以是醛或羧酸，还原剂可以是氢硼化物，例如氢硼化钠和交联剂可以是含醛剂，例如戊二醛。可先用溶液中的封端剂和再用还原剂的顺序进行处理或在存在封端剂和还原剂二者的溶液中同时进行处理。一些实施方式包括多于一个的封端和/或还原步骤。在一个实施方式中，可在约80到约100rpm下运行的轨道振动器上用溶液中的封端剂和还原剂进行处理约4小时。

在2011年7月5日授权给Edwards Lifesciences公司的美国专利号7,972,376中描述了用封端剂和还原剂处理生物组织的示例性方法，其全部内容通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。

在固定的胶原纤维进行预处理、预应力或预损坏以生成随后可被封端的其他酸结合位点的过程后，可进行封端剂和/或还原剂处理，如在2008年12月11日公布的美国专利公开号2008/0302372A1(Edwards Lifesciences的标题为“预应力和封端生物假体组织的方法”)中所描述，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，胶原纤维可经历快速脉冲流(在约4Hz到约1,500Hz的范围内)、胶原纤维的反复弯曲、升温(在约26℃到65℃的范围内)、酸性溶液(在约4到约7的pH范围内)、碱性溶液(在约8到约10的pH范围内)、或用于产生其他酸结合位点的前述步骤的任何组合，所述结合位点可在单独的处理方法中被封端和/或还原。

甘油处理

胶原纤维可进一步经历无水的、非水的、含水的甘油溶液的处理，以基本上(如果不完全)去除胶原纤维中的间隙水，同时保留大量的结合水。认为甘油至少部分地替换了间隙水。因此，该方法也被称为“甘油化”和该组织被称为“甘油化的”。甘油处理之后的胶原纤维在组织间隙内可能含有残留水或水分，但可能适合于包装以干燥储存，也就是说，没有储存在液体中的必要。这样的处理可应用于纤维、包含多个纤维的纺织品(例如，缝合线或织物)、或包含纤维的装备，例如，人工瓣膜、贴片、或移植物。

在一个实施方式中，胶原纤维可用包括甘油的无水、非水或水性溶液处理。在一个实施方式中，无水、非水或水性溶液可包括按体积计约25％、按体积计约30％、按体积计约35％、按体积计约40％、按体积计约45％、按体积计约50％、按体积计约55％、按体积计约60％、按体积计约65％、按体积计约70％、按体积计约75％、按体积计约80％、按体积计约85％、按体积计约90％、或按体积计约95％的甘油。在另一个实施方式中，无水、非水或水性溶液包括位于任何两个前述值之间和包括前述值的甘油量。

在另一个实施方式中，无水、非水或水性甘油溶液可包括至少一种醇。在一个实施方式中，无水、非水或水性溶液可包括按体积计约5％、按体积计约10％、按体积计约15％、按体积计约20％、按体积计约25％、按体积计约30％、按体积计约35％、按体积计40％、按体积计45％、按体积计50％、按体积计55％、按体积计60％、按体积计65％、按体积计70％、或按体积计75％的醇。在另一个实施方式中，无水、非水或水性溶液可包括位于任何两个前述值之间和包括前述值的醇量。醇可以是C₁、C₂、C₃、C₄、和C₅醇的任何一种或组合，例如乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、2-丁醇、和异丁醇。

在一个实施方式中，溶液是按体积计约75％的甘油和按体积计25％的乙醇的非水性溶液。将胶原纤维沉浸在溶液中足够的时间段以允许溶液渗入胶原纤维。随后将胶原纤维从溶液中移除以允许多余溶液的去除。在2011年8月30日授予Edwards Lifesciences公司的美国专利号8,007,992中描述了对于生物组织适合的处理，其全部内容通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。

在另一个优选实施方式中，水性甘油溶液可用来将胶原纤维至少部分地脱水，如在2003年3月18日授予克利夫兰诊所基金会(The Cleveland Clinic Foundation)的美国专利号6,534,004中描述，其全部内容通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。

胶原纤维也可通过除上述的甘油处理方法以外的方法处理来干燥或脱水胶原纤维。在本文中参考胶原纤维或可植入的生物假体装置所使用的术语“干燥”或“脱水”应理解为包括残留的水或水分，其在甘油或其他处理以减少胶原纤维中的水含量后存在于胶原纤维中。在一个实施方式中，甘油或其他处理后的干燥的或脱水的胶原纤维的水含量为按重量计约25％或更少、按重量计约20％或更少、按重量计约15％或更少、按重量计约10％或更少、按重量计约9％或更少、按重量计约8％或更少、按重量计约7％或更少、按重量计约6％或更少、按重量计约5％或更少、按重量计约4％的或更少、按重量计约3％或更少、按重量计约2％或更少、或按重量计或约1％或更少。本文提供的百分率应理解为基于胶原纤维和水含量的总重量。

适合干燥胶原纤维的其他处理的实例包括将纤维与包含其他多元醇的溶液接触，例如，丙二醇溶液。适合的溶液和方法与上述使用甘油的溶液和方法类似，其中用丙二醇替换甘油，因此用丙二醇替换至少一部分间隙水。其他适合的方法使用聚醚，例如，聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)取代甘油。其他实施方式同时和/或顺序地使用任何上述方法的组合。例如，在两个或更多的步骤中替换或去除间隙水，首先将胶原纤维与较低浓度溶液接触，之后与更高浓度溶液接触。

胶原纤维也可冻干或冷冻干燥用于干燥储存。首先可在包括一种或多种冷冻保护剂的冷冻保存液中温育胶原纤维以减少或最小化在冷冻期间可能发生的对结构基质的冰晶损害。适合的冷冻保护剂包括多元醇、二醇、乙二醇、丙二醇、三醇、甘油、糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、糖醇、甘露醇、苏糖醇、和二甲基亚砜(DMSO)。如果要冷冻干燥胶原纤维，通常溶液也包括一种或多种干燥保护组分，以最小化在干燥期间的结构损害，并且可包括在冷冻期间既不膨胀也不收缩的有机溶剂和水的组合。冷冻保护剂和干燥保护剂可以是相同的一种或多种物质。如果不冷冻干燥胶原纤维，可通过将它们(在无菌容器中)放置到约-80℃的冰箱中、或通过将其浸入无菌液氮中冷冻它们，并随后储存在低于-160℃的温度下直到使用。胶原纤维在使用前可先解冻，通过例如浸入包含约37℃水浴的无菌不透水的容器中或通过允许组织在环境条件下达到室温。

实施例

将牛心包组织切成小块，在液氮中冷冻，并用研钵和研杵研磨成粉末。将获得的粉末悬浮在溶胞缓冲液(100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTA、0.1％SDS、1％

X-100)中。随后以全速机械均化(

125均化器)悬浮液几秒钟。

随后将均化的悬浮液在4℃下培育过夜。培育后，将均化的悬浮液以10,000rpm的速度离心10分钟，从废弃的上清液中分离胶原纤维。用0.25M的乙酸洗涤剩余的胶原纤维，之后胶原纤维变成凝胶状。然后加入浓氯化钠溶液以沉淀胶原纤维。可选地，可在从上清液中分离胶原纤维前将浓盐溶液加入到乙酸浆液中。

在沉淀后去除胶原纤维线，其具有约5-10cm(约2-4英寸)的长度、和沿着其长度不均匀的直径。将胶原纤维的样品扭曲在一起形成纱线。

应理解，尽管表明了本公开内容的优选实施方式，但详细的描述和具体的实施例是以说明性而非限制性的方式给出。在不脱离其精神的情况下，在本公开内容的范围内可做出许多改变和改进，并且本公开内容包括所有这样的改进。