一种唾液酸颗粒及其制备方法
阅读说明：本技术 一种唾液酸颗粒及其制备方法 (Sialic acid particles and preparation method thereof ) 是由 汪志明 李翔宇 杨刚 陆姝欢 马凡提 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种唾液酸颗粒及其制备方法。本发明提供一种唾液酸颗粒,其唾液酸含量≥98.0％,堆密度≥0.5g/mL,水分含量≤0.3％。本发明还提供唾液酸颗粒的制备方法,包括将唾液酸提取液结晶得到唾液酸粗晶体,采用洗涤溶液对所述唾液酸粗晶体进行第一步洗涤和第二步洗涤的步骤,再进行造粒的步骤；洗涤溶液包括有机溶剂和水；第二步洗涤采用的洗涤溶液较第一步洗涤采用的洗涤溶液的有机溶剂含量提高10-90％。本发明的唾液酸颗粒的纯度高,堆密度高,含水量低,具有装样体积小、无扬尘、产品均一性好、稳定高的优势；制备方法操作简单、成本低、清洁生产、环境污染小,具有很高的应用价值。(The invention relates to the technical field of biological medicines, and particularly relates to sialic acid particles and a preparation method thereof. The invention provides sialic acid particles, wherein the sialic acid content is more than or equal to 98.0%, the bulk density is more than or equal to 0.5g/mL, and the water content is less than or equal to 0.3%. The invention also provides a preparation method of the sialic acid particles, which comprises the steps of crystallizing the sialic acid extracting solution to obtain sialic acid crude crystals, adopting a washing solution to carry out the steps of the first step washing and the second step washing on the sialic acid crude crystals, and then carrying out granulation; the washing solution comprises an organic solvent and water; the washing solution used in the second washing step has an organic solvent content increased by 10-90% compared with the washing solution used in the first washing step. The sialic acid particles have the advantages of high purity, high bulk density, low water content, small sample loading volume, no dust, good product uniformity and high stability; the preparation method has the advantages of simple operation, low cost, clean production, little environmental pollution and high application value.)
技术领域
本发明涉及生物医药
技术领域
，具体涉及一种唾液酸颗粒及其制备方法。背景技术
唾液酸，又称N-乙酰神经氨酸，是一种含9个碳原子的羧基化单糖的酰化衍生物。目前，唾液酸的制备方法主要有化学合成法、酶合成法、天然产物提取法和微生物发酵法等。经上述方法制备得到的唾液酸经提纯、结晶、干燥等步骤制备为唾液酸晶体。
目前，虽然通过纯化方法的改进使得唾液酸产品的纯度得到明显提高，但是，获得的唾液酸颗粒堆密度低，在应用的过程中容易导致“飞粉”，混合时容易粘壁，进而难以应用于下游片剂、固体混合剂等剂型领域。
专利申请CN110642908A通过优化结晶工艺制备微米级别的稳定水合晶体，但是，水合晶体的含水量较高。专利申请CN110478324A采用唾液酸晶体与水溶性糖类和/或水溶性胶体混合，但是，其引入了水溶性糖类、水溶性胶体，降低了唾液酸的纯度，这些方法制备的唾液酸颗粒难以适用于药物合成等应用领域。因此，亟需开发含水量低、纯度高且具有较高堆密度的唾液酸产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种唾液酸颗粒，该唾液酸颗粒具有较高的纯度、晶体堆密度和较低的含水量。本发明的另一目的是提供该唾液酸颗粒的制备方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种唾液酸颗粒，所述唾液酸颗粒的唾液酸含量≥98.0％，堆密度≥0.5g/mL，水分含量≤0.3％。
以上所述的唾液酸颗粒具有高纯度、高晶体堆密度、低水分含量的特点，在使用时不容易产生“飞粉”，混合时不容易粘壁，更适合应用于唾液酸的片剂、固体混合剂等剂型的制备。
进一步优选地，所述唾液酸颗粒的唾液酸含量≥98.5％，堆密度≥0.5g/mL，水分含量≤0.3％。
以上所述的唾液酸颗粒可采用包括如下步骤的方法制备得到：将唾液酸提取液结晶得到唾液酸粗晶体，采用洗涤溶液对所述唾液酸粗晶体进行洗涤后，再进行造粒；所述洗涤溶液包括有机溶剂和水；所述洗涤包括第一步洗涤和第二步洗涤，其中，第二步洗涤采用的第二洗涤溶液较第一步洗涤采用的第一洗涤溶液的有机溶剂含量提高10-90％。
优选地，所述第一洗涤溶液中，有机溶剂的含量为50-90％。所述第二洗涤溶液中，有机溶剂的含量大于95％。
优选地，第一洗涤溶液中有机溶剂的含量为50-85％，第二洗涤溶液中，有机溶剂的含量为95-100％。
优选地，所述有机溶剂为乙醇和/或异丙醇。
当采用乙醇和异丙醇的混合溶剂时，所述有机溶剂中，乙醇和异丙醇的体积比优选为1：(0.5-1.5)。更优选为1:1。
优选地，所述第一步洗涤的时间为1-2h，所述第二步洗涤的时间为2-5h。
优选地，所述洗涤溶液与待洗涤的唾液酸粗晶体的质量比为(1-10)：1。
进一步优选地，第一步洗涤中，洗涤溶液与待洗涤的唾液酸粗晶体的质量比为(2-5)：1；第二步洗涤中，洗涤溶液与待洗涤的唾液酸粗晶体的质量比为(5-8)：1。
经过以上洗涤步骤，第一步洗涤后分离得到的晶体含水量可低至8％，所述第二步洗涤后分离得到的晶体的结合水含量可低于3％，游离水含量可低至3％。
优选地，第二步洗涤后分离得到的晶体中有机溶剂的含量为15-20％。
优选地，所述造粒采用挤压造粒。
在所述造粒后还包括干燥的步骤，干燥工艺可选真空干燥、微波干燥、冷冻干燥等常规工艺，例如所述干燥工艺可在60-80℃真空干燥3-5h。
优选地，所述唾液酸粗晶体的含水量为10-25％。
进一步优选地，所述结晶的条件为：pH 0.5-2、温度0-10℃、搅拌转速10-200rpm。结晶时间优选为4-16h。
以上所述的唾液酸提取液为选自发酵制得的唾液酸单体提取液、发酵制得聚唾液酸后水解得到的唾液酸提取液、燕窝提取的唾液酸提取液、酶催化合成得到的唾液酸提取液中的一种或多种的混合物。
第二方面，本发明提供一种唾液酸颗粒的制备方法，所述方法包括将唾液酸提取液结晶得到唾液酸粗晶体，采用洗涤溶液对所述唾液酸粗晶体进行洗涤后，再进行造粒的步骤；所述洗涤溶液包括有机溶剂和水；所述洗涤包括第一步洗涤和第二步洗涤，其中，第二步洗涤采用的第二洗涤溶液较第一步洗涤采用的第一洗涤溶液的有机溶剂含量提高10-90％。
与其他提纯、结晶和造粒过程的条件参数相比，晶体的洗涤步骤的作用往往容易被忽视。本发明意外地发现，对于唾液酸颗粒而言，晶体的洗涤步骤对于结合水的去除，对唾液酸颗粒的纯度和堆密度具有明显影响。本发明对唾液酸晶体的洗涤方法进行了大量的尝试，发现很多洗涤方法虽然能够获得合适的堆密度，但无法保证较高的纯度。而通过将洗涤步骤分两步进行有机溶剂梯度洗涤，尤其是，将第二步洗涤的有机溶剂含量较第一步洗涤提高10-90％时，能够在保证较高纯度的同时显著提高唾液酸颗粒堆密度，而且还有利于降低含水量。
通过将第一步洗涤和第二步洗涤的洗涤溶液中的溶剂含量控制在特定范围内，能够进一步提高唾液酸颗粒的纯度和堆密度。
具体地，第一洗涤溶液中有机溶剂的含量为50-90％。第二洗涤溶液中，有机溶剂的含量大于95％。
优选地，第一洗涤溶液中有机溶剂的含量为50-85％，第二洗涤溶液中，有机溶剂的含量为95-100％。
本发明进一步对有机溶剂进行了筛选并发现，与其他唾液酸难溶的有机溶剂相比，乙醇、异丙醇不仅更有利于去除杂质，提高唾液酸的纯度，而且还能够更显著地提高唾液酸颗粒堆密度，降低其含水量。
优选地，所述有机溶剂为乙醇和/或异丙醇。
当采用乙醇和异丙醇的混合溶剂时，所述有机溶剂中，乙醇和异丙醇的体积比优选为1：(0.5-1.5)。更优选为1:1。
在对唾液酸晶体进行洗涤时，优选将第一步洗涤时间为1-2h，将第二步洗涤控制洗涤时间为2-5h。上述洗涤条件的控制能够进一步有利于杂质的去除和晶体堆密度的提高。
优选地，所述洗涤溶液与待洗涤的唾液酸粗晶体的质量比为(1-10)：1。
进一步优选地，第一步洗涤中，洗涤溶液与待洗涤的唾液酸粗晶体的质量比为(2-5)：1；第二步洗涤中，洗涤溶液与待洗涤的唾液酸粗晶体的质量比为(5-8)：1。
上述两步洗涤中，唾液酸粗晶体经第一步洗涤后，再经固液分离得到唾液酸湿晶体，唾液酸湿晶体经第二步洗涤后，再经固液分离得到唾液酸晶体。
本发明所述的分离方法可为离心等本领域常用的分离方法。
经过两步骤洗涤后，第一步洗涤后分离得到的晶体含水量可低至8％，所述第二步洗涤后分离得到的晶体的结合水含量可低于3％，游离水含量可低于8％。
优选地，第二步洗涤后分离得到的晶体中有机溶剂的含量为10-20％。
本发明所述的唾液酸颗粒的制备方法还包括将洗涤后的唾液酸晶体进行造粒的步骤，所述造粒优选采用挤压造粒。
所述挤压造粒包括但不限于螺杆挤压造粒等。造粒过程中的筛板目数可为10-20目，筛板目数可根据具体的粒度要求进行调整。
在所述造粒后还包括干燥的步骤，所述干燥为在60-80℃真空干燥3-5h。
经上述真空干燥后，唾液酸颗粒的含水量≤0.3％。
在干燥后还包括对颗粒粉碎整粒的步骤，得到均匀的要求粒度。
本发明所使用的唾液酸粗晶体的含水量为10-25％。唾液酸粗晶体的结晶的条件为：pH 0.5-2、温度0-10℃、搅拌转速10-200rpm。结晶时间优选为4-16h。
本发明所述的唾液酸提取液为选自发酵制得的唾液酸单体提取液、发酵制得聚唾液酸后水解得到的唾液酸提取液、燕窝提取的唾液酸提取液、酶催化合成得到的唾液酸提取液中的一种或多种的混合物。
优选地，所述唾液酸提取液中唾液酸的含量≥20g/L。
作为本发明的优选方案，所述唾液酸颗粒的制备方法包括如下步骤：
(1)将发酵制得的唾液酸提取液(唾液酸含量为300-500g/L)酸调(硫酸、盐酸等)pH至0.5-2后进行结晶，结晶条件为：温度0-4℃，结晶时间4-16小时，结晶转速10-200rpm；
(2)结晶后离心，离心时间20-60min，转速4000-10000rpm,得到唾液酸粗晶体，含水量为10-25％；
(3)将唾液酸粗晶体用2-5倍质量的50-85％的乙醇或异丙醇洗涤，洗涤时间为1-2h；
(4)离心，离心时间20-60min，转速4000-10000rpm，得到湿晶体；
(5)在湿晶体中加入5-8倍质量的95-100％的乙醇和/或异丙醇洗涤，洗涤2-5h；
(6)降温至20-25℃后进行离心分离，离心时间20-60min，转速4000-10000rpm，得到唾液酸晶体，其乙醇含量为15-20％；
(7)造粒：使用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10-20目，得到颗粒均匀湿颗粒；
(8)将步骤(7)的颗粒于60-80℃，真空干燥4h；
(9)将干燥后的颗粒粉碎并过筛，转速2000-3000rpm，进行粉碎整粒,得到要求的粒度。
第三方面，本发明提供采用以上所述的唾液酸颗粒的制备方法制备得到的唾液酸颗粒。
优选地，所述唾液酸颗粒的唾液酸含量≥98.0％，堆密度≥0.5g/mL，水分含量≤0.3％。
本发明的有益效果在于：本发明制备得到的唾液酸颗粒的纯度高(唾液酸含量≥98％)，堆密度高(≥0.5g/ml)，含水量低(≤0.3％)，具有装样体积小、无扬尘、产品均一性好、稳定高的优势。本发明提供的唾液酸颗粒的制备方法的操作简单、成本低、清洁生产、环境污染小，具有很高的应用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中唾液酸粗晶体的制备方法为专利CN109627269B中实施例1的方法，具体如下：
(1)将聚唾液酸发酵液经过陶瓷膜过滤除菌体，将清液加热到70℃，使清液重的蛋白变性析出，加热半小时后，加活性炭脱色并吸附蛋白，加活性炭搅拌半小时，过滤并降温到室温，得到电导率为小于2000μS/cm的溶液，得到聚唾液酸；
(2)向步骤(1)得到的聚唾液酸中加入硫酸使pH＝1，80℃水解4小时，得到唾液酸；
(3)使用超滤膜1KDa除去未水解完全的聚唾液酸，得到SA清液；
(4)向步骤(3)得到的SA清液中加入氢氧化钠，pH调节至6；
(5)将步骤(4)得到的溶液使用300Da纳滤膜进行纳滤得纳滤液，使用真空加热蒸发浓缩以使所述纳滤液中SA含量为450g/L；
(6)将步骤(5)得到的溶液使用硫酸将pH调至1后，降温到2℃搅拌16小时，结晶；
(7)采用转速为10000rpm的离心机过滤机收集粗晶体，此时粗晶体的含水量为20％。
以下实施例中使用的检测方法如下：
唾液酸的检测：
将样品溶解后过0.22μm滤膜后进液相色谱进行检测。
色谱仪型号：SHIMADZU LC-15C；色谱柱型号：Aminex HPX-87H，300mm*7.8mm(catalog#125-0140)；检测器：UV检测器。检测波长：210nm；柱温：60℃；流动相：0.005M硫酸；流速：0.60ml/min；进样体积：20μl。
颗粒堆密度的检测：
堆密度是指粉体质量除以该粉体所占容器的体积V求得的密度，亦称堆密度，即ρb＝W/V。
先将足够量的样品过筛去除存储时可能形成的大块；再称取约100g(W，精确至0.1％)的样品置250mL的量筒，不压实；读取未处理的外观上的体积V。
实施例1
本实施例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比2倍的75％乙醇洗涤，洗涤时间1h，再以转速8000rpm离心30min，得到湿晶体，含水量为10％；再向湿晶体中加入重量比5倍的95％乙醇，洗涤4h，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，乙醇含量为10％，结合水含量为1.3％，游离水含量为3％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于70℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到唾液酸颗粒，堆密度0.65g/mL，唾液酸含量99.2％，水分含量0.2％。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的唾液酸颗粒，堆密度0.65g/mL，唾液酸含量99.2％，水分含量0.2％。
实施例2
本实施例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量25％)用晶体重量比2倍的80％异丙醇洗涤，洗涤时间1h，再以转速8000rpm离心30min，得到湿晶体，含水量为12％；再向湿晶体中加入重量比5倍的95％异丙醇，洗涤4h，降至室温后，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，异丙醇含量为12％，结合水含量为2.5％，游离水含量为5％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于80℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.55g/mL，唾液酸含量98.9％，水分含量0.3％。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的唾液酸颗粒，堆密度0.55g/mL，唾液酸含量98.9％，水分含量0.3％。
实施例3
本实施例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比5倍的85％乙醇洗涤，洗涤时间2小时，再以转速5000rpm离心30min，得到湿晶体，含水量为10％；再向湿晶体中加入重量比5倍的95％乙醇，洗涤2h，降至室温后，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，乙醇含量为15％，结合水含量为0.8％，游离水含量为5.5％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于80℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.62g/mL，唾液酸含量99.3％，水分含量0.2％。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的唾液酸颗粒，堆密度0.62g/mL，唾液酸含量99.3％，水分含量0.2％。
实施例4
本实施例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比2倍的50％乙醇洗涤，洗涤时间1h，再以转速6000rpm离心30min，得到湿晶体，含水量为17％；再向湿晶体中加入重量比8倍的90％乙醇，洗涤4h，降至室温后，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，乙醇含量为12％，结合水含量为3.0％，游离水含量为5.5％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于80℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.65g/mL，唾液酸含量98.6％，水分含量0.3％。
本实施例还提供采用上述方法制备得到的唾液酸颗粒，堆密度0.65g/mL，唾液酸含量98.6％，水分含量0.3％。
对比例1
专利CN109627269B中实施例1的制备方法，该方法制备得到的唾液酸颗粒的唾液酸含量98.6％，堆密度0.2g/mL，水分0.6％。
对比例2
本对比例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)按照晶体重量的8倍加入无水乙醇，在60℃水浴锅里进行搅拌，直到湿晶体中结合水为0；离心分离湿晶体，然后用纯净水快速淋洗两次。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于70℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.3g/mL，唾液酸含量98.2％，水分含量0.3％。
对比例3
本对比例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比2倍的75％乙醇洗涤，洗涤时间5h，再以转速8000rpm离心30min，得到湿晶体乙醇含量为10％，含水量12％，其中结合水含量为5.3％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于70℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.45g/mL，唾液酸含量93.5％，水分5％。
对比例4
本对比例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比5倍的95％乙醇，洗涤5h，降至室温后，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，乙醇含量为15％，结合水含量为1％，游离水含量为5％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于70℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.52g/mL，唾液酸含量96.3％，水分0.2％。
对比例5
本对比例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比2倍的75％乙醇洗涤，洗涤时间1h，再以转速8000rpm离心30min，得到湿晶体，含水量为10％；再向湿晶体中加重量比5倍的75％乙醇，洗涤4h，降至室温后，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，乙醇含量为10％，结合水含量为5％，游离水含量为10.2％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于70℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.53g/mL，唾液酸含量96.7％，水分2.5％。
对比例6
本对比例提供一种唾液酸颗粒的制备方法，具体如下：
将唾液酸粗晶体(含水量20％)用晶体重量比2倍的75％乙酸乙酯在25℃下洗涤，洗涤时间1h，再以转速8000rpm离心30min，得到湿晶体，含水量为15％；再向湿晶体中加重量比5倍的95％乙酸乙酯，于40℃洗涤4h，降至室温后，以转速8000rpm离心30min，得到唾液酸晶体，乙酸乙酯含量为12％，结合水含量为5％，游离水含量为6％。
采用螺杆挤压造粒方式，筛板目数为10目，得到颗粒均匀湿晶体，进一步于70℃下真空干燥4h；再将干燥晶体过40目筛，进行粉碎整粒，得到的唾液酸颗粒，堆密度0.51g/mL，唾液酸含量94.7％，水分3.2％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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