阅读说明：本技术 含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其应用 (4-phenoxypyridine derivatives containing 3-pyridazinone, 4-pyridazinone and 1,2, 4-triazinone structures and application thereof ) 是由 刘举 陈烨 李春艳 丁实 宫益林 史建涛 郝雪晨 王震 杨亚星 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其应用。本发明的4-苯氧基吡啶类衍生物具有通式(Ⅰ)的结构,化合物具有强的抑制c-Met激酶的作用,并且还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药在制备治疗和/或预防由于c-Met激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途,特别是在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。<Image he="418" wi="642" file="DDA0002276315200000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to 4-phenoxypyridine derivatives containing 3-pyridazinone, 4-pyridazinone and 1,2, 4-triazinone structures and application thereof. The 4-phenoxyl pyridine derivative has a structure shown in a general formula (I), has a strong effect of inhibiting c-Met kinase, and also relates to application of the compound and pharmaceutically acceptable salts, hydrates, solvates or prodrugs thereof in preparing medicines for treating and/or preventing diseases caused by abnormal high expression of c-Met kinase, in particular to application in preparing medicines for treating and/or preventing cancers.)

含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶 类衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及通式(Ⅰ)所示的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，它们的制备方法以及含有所述化合物的药物组合物。本发明还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或其前药在制备治疗由于c-Met激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途，特别是在制备治疗和/或预防癌症药物中的用途。

背景技术

癌症泛指所有的恶性肿瘤，是一类威胁人类生命健康的重大难治性疾病，其死亡率甚至超过心脑血管类疾病，居于所有疾病首位。预计到2030年全球将有2140万新增病例，死亡人数将超过1300万人，所以抗肿瘤药物的研究具有重大意义。近年来，肿瘤的分子靶向治疗越来越受到人们的重视。肿瘤的分子靶向治疗是建立在分子生物学的基础上，将与肿瘤相关的特异性分子及其介导的信号传导通路作为靶点，利用靶标分子及其介导的信号传导通路中的特异性抑制剂或药物进行治疗的手段。相比传统的肿瘤治疗方法，分子靶向治疗能够同时达到定向、定位的优势，减少用药剂量，减少毒副反应，提高疗效的目的。c-Met是酪氨酸激酶受体家族Ron亚族的一个原型成员，由原癌基因c-Met表达，它是唯一已知的肝细胞生长因子(HGF)高亲和力受体。c-Met是一种受体型酪氨酸激酶，在正常细胞与肿瘤细胞中均有表达。正常生理条件下，HGF主要在***表达，通过自分泌或旁分泌的形式作用到数种上皮源性细胞。c-Met主要在各种上皮细胞表达，HGF/c-Met系统在上皮与***的相互作用中具有重要的生理意义。HGF与c-Met激酶结合后，可引起一系列生物效应，如：促进上皮细胞的分离，增强其运动性和侵袭力，促进胎盘的有丝***，促进神经系统和肌肉的发育，调节肺、肾和乳腺的发育和结构的形成等。然而，异常的HGF/c-Met活性与肿瘤的发生、***、血管生成、侵袭性、转移和耐药性等密切相关，它们在多种肿瘤组织中呈现异常的高表达、突变及活性改变，如肺癌、乳腺癌、结肠癌、***癌、胰腺癌、卵巢癌等。此外，c-Met和HGF的高表达还与肿瘤的不良预后及转移过程有关。受体c-Met作为肿瘤细胞信号传导通路的关键节点蛋白，因可以与其他激酶、受体之间相互作用而引起人们的广泛关注。因此，开发结构新颖、疗效显著的c-Met激酶抑制剂将会成为国内外抗肿瘤药物的研究热点。2003年，Krin Brewery公司报道了一系列含有酰基硫脲的4-苯氧基喹啉骨架的c-Met激酶抑制剂，随后许多课题组以及大公司针对这类化合物中化学不稳定的酰基硫脲部分或者是喹啉/喹唑啉部分进行了改造，并相继有一些化合物进入临床。具有4-苯氧基喹啉母核的Cabozantinib是第一个批准上市的小分子c-Met激酶抑制剂，用于不能手术的晚期或转移的甲状腺髓样癌，对VEGFR-2、c-Kit和Flt-3等激酶均有很强的抑制作用。科学研究发现，用吡啶环替代Cabozantinib的6,7-二甲氧基喹啉母核，得到一系列4-苯氧基吡啶类化合物，Altiratinib和Golvatinib保持了良好的c-Met激酶活性，目前分别处在I和Ⅱ期临床研究阶段。目前，c-Met抑制剂研究中主要存在以下问题：临床应用毒副作用较大，临床治疗效果和药代动力学参数不理想，口服生物利用度不高等。因此开发结构新颖、安全有效的新型c-Met激酶抑制剂仍旧是国内外抗肿瘤药物研究重点领域。

发明内容

本发明的目的在于设计并合成一系列新的含有含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物。经过体外活性筛选，表明该类化合物具有抗肿瘤活性。

本发明提供一种具有通式Ⅰ所示的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，

其中：

R选自氢、C₁-C₁₀烷基、C₃-C₇环烷基、或被卤代的C₁-C₁₀烷基；

X选自1-4个相同或不同的取代基：如：氢、卤素、C₁-C₁₀烷基、或C₁-C₄烷氧基；

L为

R₁选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、任选被羟基或卤素取代的C₁-C₆烷基；

Ar选自C₆-C₁₀芳基或5-10元杂芳基；其中，所述杂芳基含有1-3个选自N、O或S的杂原子，并且Ar被1-3个相同或不同的R₂取代；

R₂选自氢、羟基、卤素、硝基、酯基、氨基、氰基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷基硫基、被羟基取代或被氨基取代或被卤代的C₁-C₆烷基、被羟基取代或被氨基取代或被卤代的C₁-C₆烷氧基、被单或双C₁-C₆烷基取代的氨基、C₁-C₆烷基酰氨基、游离的或成盐的或酯化的或酰胺化的羧基、C₁-C₆烷基亚磺酰基、C₁-C₆烷基磺酰基、C₁-C₆烷基酰基、氨基甲酰基、和被单或双C₁-C₆烷基取代的氨基甲酰基。

进一步的，上述的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中，

R选自C₁-C₁₀烷基、或C₃-C₇环烷基；

X选自1-4个相同或不同的取代基：如，氢、或卤素；

L为

R₁选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基；

Ar选自苯基、萘基、或5-10元杂芳基；其中，所述杂芳基含有1-3个选自N、O或S的杂原子，并且Ar被1-3个相同或不同的R₂取代；

R₂选自氢、羟基、卤素、硝基、酯基、氨基、氰基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、被卤代的C₁-C₆烷基、被卤代的C₁-C₆烷氧基、被单或双C₁-C₆烷基取代的氨基、C₁-C₆烷基酰氨基、C₁-C₆烷基磺酰基、C₁-C₆烷基酰基、或氨基甲酰基。

进一步的，上述的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中，

R选自甲基、乙基、丙基、丁基、环丙基、环丁基、环戊基、或环己基；

X选自1-2个相同或不同的取代基：如，氢、氟、或氯；

L为

R₁选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基；

Ar选自苯基或5-6元杂芳基；其中，所述杂芳基含有1-3个选自N、O或S的杂原子，并且Ar被1-3个相同或不同的R₂取代；

R₂选自氢、羟基、卤素、硝基、氨基、氰基、甲基、C₁-C₆烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、甲磺酰基、被单或双C₁-C₆烷基取代的氨基、或C₁-C₆烷基酰氨基。

进一步的，上述的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中，

R选自甲基、乙基、或环丙基；

X选自1-2个相同或不同的取代基：如，氢、或氟；

L为

R₁选自氢、甲基、乙基、或环丙基；

Ar选自苯基，并且Ar被1-3个相同或不同的R₂取代；

R₂选自氢、卤素、甲氧基、或三氟甲基。

进一步的，上述的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，具有如下结构式，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：

一种药物组合物，包含上述的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物及其药学上接受的盐、水合物、溶剂化物或前药作为活性成分以及药学上可接受的赋形剂。

而且，按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明中通式(Ⅰ)所示的4-苯氧基吡啶类衍生物及构型异构体可以与酸生成药学上可接受的盐。可药用加成盐包括无机酸和有机酸加成盐，与下列酸加成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、琥珀酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。

此外，本发明还包括本发明衍生物的前药。本发明衍生物的前药是通式(Ⅰ)的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

本发明中“卤素”是指氟、氯、溴或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“亚烷基”是指直链或支链的亚烷基；“环烷基”是指取代或未取代的环烷基；“芳基”是指无取代基或连有取代基的苯基、萘基；“杂芳基”是指含有一个或多个选自N、O、S杂原子的单环或多环的环状体系，环状体系是芳香性的，如咪唑基、吡啶基、吡唑基、(1,2,3)-和(1,2,4)-***基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、萘基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基和苯并噁唑基等。

本发明的有益效果是：

本发明，通过对c-Met酶活性测试发现，本发明化合物具有显著的抑制c-Met激酶活性，可用于制备c-Met抑制剂的药物，特别用于制备治疗和/或预防癌症的药物，更特别的用于制备治疗和/或预防肺癌和结肠癌的药物。

本发明，通过体外抑制c-met高表达细胞株人肺腺癌细胞株A549、人肺癌细胞H460和人结肠癌细胞HT-29活性试验，证明本发明化合物对肺癌细胞和人胃癌细胞具有显著抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防肺癌和结肠癌的药物。

具体实施方式

下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。下列实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。化合物的核磁共振氢谱用Bruker ARX-600测定，质谱用Agilent6460QQQ测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。

下面的合成路线(路线1)描述了本发明的通式(Ⅰ)衍生物的制备，所有的原料都是通过这些合成路线中描述的方式、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终衍生物都是通过这些合成路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些合成路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。

按照本发明的通式(Ⅰ)衍生物，均可按照路线1的方法由相应的中间体Q和相应的M通过缩合反应制备得到。

路线1

M的合成路线如路线2所示，其他取代基如权利要求中所定义；

路线2

按照本发明通式(Ⅰ)化合物，中间体Q可通过如路线3所示的方法制备，其他取代基如权利要求中所定义。

路线3

按照本发明通式(Ⅰ)化合物，中间体Q也可通过如路线4所示的方法制备，其他取代基如权利要求中所定义。

路线4

按照本发明通式(Ⅰ)化合物，中间体Q还可通过如路线5所示的方法制备，其他取代基如权利要求中所定义。

路线5

以上五条路线中所有中间体的取代基R、X、L、R₁、Ar如权利要求中所定义。

实施例1:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物1)的制备

步骤1 N-(4-氯代吡啶-2-基)环丙基甲酰胺(a)

2-氨基4-氯吡啶8.80g和三乙胺20.80g溶解于80mL的二氯甲烷中，冰浴条件下向该溶液中滴加30mL含有9.30g环丙基甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后升至室温。搅拌12h，反应完毕后混合物用20％K₂CO₃溶液、饱和食盐水分别洗涤3次，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂得粗产物，柱色谱分离，得白色固体N-(4-氯代吡啶-2-基)环丙基甲酰胺(a)。

步骤2 N-[4-(2-氟-4-硝基苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(b)

将中间体(a)N-(4-氯代吡啶-2-基)环丙基甲酰胺8.00g和2-氟-4-硝基苯酚15.98g加入到100mL氯苯中，140℃反应40h。冷却至室温，减压浓缩，残余物用适量二氯甲烷溶解，以K₂CO₃溶液、饱和食盐水分别洗涤3次，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂得棕色固体，柱层析得淡黄色固体产物N-[4-(2-氟-4-硝基苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(b)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.00(s,1H),8.43(m,1H),8.30(d,J＝5.7Hz,1H),8.19(m,1H),7.76(d,J＝2.2Hz,1H),7.61(t,J＝8.5Hz,1H),6.86(m,1H),2.04–1.95(m,1H),0.78(t,J＝6.3Hz,4H)。

步骤3 N-[4-(4-氨基-氟-2-氟苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(M)

将中间体(b)N-[4-(2-氟-4-硝基苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺6.00g，铁粉5.28g，醋酸11.36g，加入到100mL乙酸乙酯中，再加入20mL水，加热回流2h，反应完毕，趁热过滤，分出有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得白色固体N-[4-(4-氨基-氟-2-氟苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(M)。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.79(s,1H),8.15(d,J＝5.7Hz,1H),7.59(s,1H),6.95(t,J＝9.0Hz,1H),6.67–6.61(m,1H),6.49(dd,J＝13.1,2.2Hz,1H),6.40(d,J＝8.7Hz,1H),5.44(s,2H),2.03–1.88(m,1H),0.76(br,4H)。

步骤4 3-氧代-2-(2-苯基腙基)丁酸乙酯(d)

向500mL的三颈瓶中加入30g苯胺及200mL水，开动搅拌，室温下缓慢滴加90mL浓盐酸，滴毕后冷却反应液，温度低于0℃时，向反应液中滴加NaNO₂溶液(将26.7g亚硝酸钠置于90mL冰水)，控制滴速，使反应温度低于5℃，滴毕后，0～5℃反应30min，得苯胺的重氮盐溶液。向500mL三颈瓶中先后加入79.3g乙酸钠、120mL水、220mL无水乙醇，开动搅拌，待乙酸钠全溶后加入44g乙酰乙酸乙酯，室温下搅拌30min，将所得溶液冷却至-3℃。搅拌下，将苯胺的重氮盐溶液滴加至该反应液中，保持反应液温度在-3℃左右。滴加过程中析出大量黄色固体，滴毕，0℃反应2h，抽滤得黄色固体，水洗滤饼至中性，常温减压干燥，得黄色粉末3-氧代-2-(2-苯基腙基)丁酸乙酯(d)。MS(ESI)m/z(％):235.1[M+H]⁺.

步骤5 4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酸乙酯(e)

将中间体(d)3-氧代-2-(2-苯基腙基)丁酸乙酯5.00g，乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦8.50g加入到50mL干燥甲苯中，回流反应，过夜，反应完毕，减压蒸发除去大部分溶剂，向反应混合物中加入石油醚，室温搅拌0.5h，过滤出沉淀，乙醇重结晶，得白色固体4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酸乙酯(e)。MS(ESI)m/z(％):259.1[M+H]⁺。

步骤6 4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酸(Q-1)

室温下，向100mL三颈瓶中加入中间体(e)4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酸乙酯4.0g，四氢呋喃40mL，水10mL，氢氧化钠1.25g，升温至50℃，5h反应完全。将反应液减压蒸发除去大部分溶剂，将反应混合物倒入冰水中，冰浴条件下用6mol/L的盐酸调节反应液pH至2，反应液中析出大量白色固体，搅拌1h，抽滤，滤饼用大量水洗至中性，干燥，得固体4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酸(Q-1)。MS(ESI)m/z(％):229.1[M-H]^-。

步骤7 N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物1)

在反应瓶中加入4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酸(1.20mmol)(Q-1)，N-[4-(4-氨基-氟-2-氟苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(1.00mmol)(M)，HATU(1.20mmol)，三乙胺(1.20mmol)，15ml DMF，室温搅拌3h反应完毕。反应液倒入100mL 20％的碳酸钠水溶液，分别用50mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用20％的碳酸钠水溶液洗涤三次，饱和食盐水洗涤有机层两次，分出有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去二氯甲烷，柱层析分离得化合物1。¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.97(s,1H),8.62(s,1H),8.11(d,J＝5.8Hz,1H),7.84–7.67(m,2H),7.61(d,J＝7.6Hz,2H),7.54(t,J＝7.8Hz,2H),7.47(t,J＝7.4Hz,1H),7.25(s,1H),7.14(t,J＝8.6Hz,1H),6.91(d,J＝1.0Hz,1H),6.62(dd,J＝5.8,2.3Hz,1H),2.66(d,J＝0.7Hz,3H),1.51(m,1H),1.03(dt,J＝8.0,4.0Hz,2H),0.88–0.80(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):500.2[M+H]⁺。

替换适当的原料及试剂，按照实施例1的制备方案，最终制得实施例2—8(化合物2—8)。

实施例2:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(4-氟苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物2)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.92(s,1H),8.64(s,1H),8.12(d,J＝5.7Hz,1H),7.82–7.68(m,2H),7.60(dd,J＝8.8,4.7Hz,2H),7.26–7.18(m,3H),7.14(t,J＝8.6Hz,1H),6.91(s,1H),6.64(dd,J＝5.7,2.2Hz,1H),2.66(s,3H),1.57–1.45(m,1H),1.11–0.97(m,2H),0.93–0.79(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):518.1[M+H]⁺,540.1[M+Na]⁺.

实施例3:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(4-氯苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物3)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.89(s,1H),8.44(s,1H),8.12(d,J＝5.8Hz,1H),7.82–7.66(m,2H),7.59(d,J＝8.8Hz,2H),7.50(d,J＝8.8Hz,2H),7.24(s,1H),7.15(t,J＝8.6Hz,1H),6.92(t,J＝7.4Hz,1H),6.63(m,1H),2.66(s,3H),1.55–1.43(m,1H),1.07–1.00(m,2H),0.89–0.81(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):534.1[M+H]⁺,556.1[M+Na]⁺.

实施例4:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(2-氟苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物4)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.94(s,1H),8.78(s,1H),8.11(d,J＝5.7Hz,1H),7.74(d,J＝12.1Hz,2H),7.48(t,J＝6.8Hz,2H),7.39–7.26(m,3H),7.12(t,J＝8.6Hz,1H),6.92(s,1H),6.67–6.57(m,1H),2.66(s,3H),1.56–1.45(m,1H),1.07–0.97(m,2H),0.91–0.78(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):518.1[M+H]⁺,540.1[M+Na]⁺.

实施例5:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(2-氯苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物5)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.93(s,1H),8.78(s,1H),8.11(d,J＝5.8Hz,1H),7.74(dd,J＝12.0,2.1Hz,2H),7.63–7.54(m,1H),7.52–7.40(m,3H),7.25(s,1H),7.12(t,J＝8.7Hz,1H),6.94(d,J＝0.9Hz,1H),6.61(dd,J＝5.8,2.3Hz,1H),2.68(s,3H),1.56–1.43(m,1H),1.06–0.98(m,2H),0.87–0.80(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):534.1[M+H]⁺,556.1[M+Na]⁺.

实施例6:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(4-甲氧基苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物6)

IR(KBr,cm^-1):3392.8,3290.6,1656.9,1595.1,1527.6,1502.6,1421.5,1300.0,1246.0,1168.9,1026.1,983.7,866.0；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.98(s,1H),8.55(s,1H),8.11(d,J＝5.8Hz,1H),7.82–7.68(m,2H),7.52(d,J＝8.9Hz,2H),7.25(s,1H),7.14(t,J＝8.6Hz,1H),7.03(d,J＝8.9Hz,2H),6.90(s,1H),6.62(dd,J＝5.7,2.2Hz,1H),3.87(s,3H),2.65(s,3H),1.55–1.44(m,1H),1.08–1.00(m,2H),0.89–0.83(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):530.2[M+H]⁺.

实施例7:N-(4-{[2-(乙酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物7)

MS(ESI)m/z(％):474.2[M+H]⁺.

实施例8:N-(4-{[2-(乙酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(4-氟苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物8)

MS(ESI)m/z(％):492.2[M+H]⁺.

实施例9:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物9)的制备

步骤1 3-氧代-2-(2-苯基腙基)戊酸乙酯(f)

向500mL的三颈瓶中加入25g苯胺及200mL水，开动搅拌，室温下缓慢滴加75mL浓盐酸，滴毕后冷却反应液，温度低于0℃时，向反应液中滴加NaNO₂溶液(将22.3g亚硝酸钠置于80mL冰水)，控制滴速，使反应温度低于5℃，滴毕后，0～5℃反应30min，得苯胺的重氮盐溶液。向500mL三颈瓶中先后加入66g乙酸钠、100mL水、200mL无水乙醇，开动搅拌，待乙酸钠全溶后加入40.1g丙酰基乙酸乙酯，室温下搅拌30min，将所得溶液冷却至-3℃。搅拌下，将苯胺的重氮盐溶液滴加至该反应液中，保持反应液温度在-3℃左右。滴加过程中析出大量黄色固体，滴毕，0℃反应2h，抽滤得黄色固体，水洗滤饼至中性，常温减压干燥，得黄色粉末3-氧代-2-(2-苯基腙基)戊酸乙酯(f)。MS(ESI)m/z(％):249.1[M+H]⁺.

步骤2 5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酸乙酯(g)

向500mL三颈瓶中加入56g中间体(f)3-氧代-2-(2-苯基腙基)戊酸乙酯、280mL甲苯，室温搅拌至全溶后加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛53.7g，85℃反应3h。反应液逐渐变为红黑色溶液，且有气泡放出，为甲醇。反应液降至室温，蒸干大部分溶剂，有灰色固体析出，抽滤，滤饼用甲苯洗涤。若颜色很深，可加入5v/m的甲苯打浆。抽滤得固体5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酸乙酯(g)。

步骤3 5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酸(Q-2)

室温下，向1000mL三颈瓶中加入11.63g氢氧化钠及600mL水，搅拌溶解后加入60g中间体(g)5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酸乙酯，溶液呈淡黄色，升温至50℃，1h反应完全。将反应液降至室温，冰浴条件下用6mol/L的盐酸调节反应液pH至2，反应液中析出大量白色固体，搅拌2h，抽滤，滤饼用大量水洗至中性，干燥得固体5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酸(Q-2)。

步骤4 N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物9)

在反应瓶中加入5-甲基-4-氧代-1-苯基-1,4-二氢哒嗪-3-甲酸(1.20mmol)(Q-2)，N-[4-(4-氨基-氟-2-氟苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(1.00mmol)(M)，HATU(1.20mmol)，三乙胺(1.20mmol)，15ml DMF，室温搅拌3h反应完毕。反应液倒入100mL 20％的碳酸钠水溶液，分别用50mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用20％的碳酸钠水溶液洗涤三次，饱和食盐水洗涤有机层两次，分出有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去二氯甲烷，柱层析分离得化合物9。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.30(s,1H),10.88(s,1H),9.11(d,J＝0.6Hz,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),7.99(dd,J＝12.7,2.3Hz,1H),7.84(d,J＝7.7Hz,2H),7.71–7.60(m,3H),7.53(t,J＝7.4Hz,2H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),6.74(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),2.14(s,3H),2.01–1.93(m,1H),0.81–0.73(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):500.1[M+H]⁺,522.1[M+Na]⁺.

替换适当的原料及试剂，按照实施例9的制备方案，最终制得实施例10—19(化合物10—19)。

实施例10:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(4-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物10)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.22(s,1H),10.81(s,1H),9.00(s,1H),8.14(d,J＝5.7Hz,1H),7.92(dd,J＝12.7,2.3Hz,1H),7.86–7.77(m,2H),7.59(d,J＝2.1Hz,1H),7.44(dd,J＝14.4,5.0Hz,3H),7.33(t,J＝8.9Hz,1H),6.67(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),2.48–2.40(m,3H),1.95–1.84(m,1H),0.74–0.65(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):518.2[M+H]⁺,540.1[M+Na]⁺.

实施例11:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(4-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物11)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.21(s,1H),10.88(s,1H),9.11(s,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),7.98(dd,J＝12.7,2.2Hz,1H),7.88(d,J＝8.9Hz,2H),7.70(d,J＝8.9Hz,2H),7.66(d,J＝2.1Hz,1H),7.56–7.49(m,1H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),6.74(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),2.13(s,3H),2.01–1.94(m,1H),0.81–0.73(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):534.1[M+H]⁺,556.1[M+Na]⁺.

实施例12:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(2-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物12)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ12.66(s,1H),8.57(s,1H),8.22(d,J＝1.0Hz,1H),8.11(d,J＝5.8Hz,1H),7.99(dd,J＝12.2,2.3Hz,1H),7.81(s,1H),7.74(td,J＝7.9,1.3Hz,1H),7.48(dd,J＝21.2,14.4Hz,2H),7.39–7.28(m,2H),7.16(t,J＝8.7Hz,1H),6.59(dd,J＝5.8,2.3Hz,1H),2.26(s,3H),1.57–1.47(m,1H),1.10–1.03(m,2H),0.89–0.82(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):518.1[M+H]⁺,540.1[M+Na]⁺.

实施例13:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(4-甲氧基苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物13)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.44(s,1H),10.88(s,1H),9.03(s,1H),8.22(d,J＝5.6Hz,1H),8.00(d,J＝12.6Hz,1H),7.76(d,J＝8.9Hz,2H),7.67(s,1H),7.53(d,J＝8.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.8Hz,1H),7.17(d,J＝8.9Hz,2H),6.75(d,J＝3.5Hz,1H),3.85(s,3H),2.14(s,3H),2.03–1.92(m,1H),0.84–0.68(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):530.2[M+H]⁺,552.1[M+Na]⁺.

实施例14:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(4-三氟甲基苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物14)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.07(s,1H),10.88(s,1H),9.20(d,J＝0.7Hz,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),8.10(d,J＝8.6Hz,2H),8.05–7.95(m,3H),7.65(d,J＝2.3Hz,1H),7.54(dd,J＝8.9,1.4Hz,1H),7.41(t,J＝8.9Hz,1H),6.75(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),2.14(s,3H),2.01–1.93(m,1H),0.77(t,J＝5.6Hz,4H)；MS(ESI)m/z(％):568.2[M+H]⁺,590.1[M+Na]⁺.

实施例15:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(3-氯4-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物15)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.17(s,1H),10.88(s,1H),9.11(s,1H),8.26–8.11(m,2H),8.05–7.94(m,1H),7.92–7.84(m,1H),7.68(dd,J＝28.8,5.5Hz,2H),7.54(d,J＝8.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),6.74(dd,J＝5.7,2.3Hz,1H),2.12(s,3H),2.02–1.92(m,1H),0.82–0.73(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):552.1[M+H]⁺,574.1[M+Na]⁺.

实施例16:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(3,4-二甲氧基苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物16)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.42(s,1H),10.88(s,1H),9.03(s,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),8.00(dd,J＝12.7,2.3Hz,1H),7.66(d,J＝2.2Hz,1H),7.52(dd,J＝8.8,1.3Hz,1H),7.43–7.31(m,3H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),6.74(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),3.87(s,3H),3.84(s,3H),2.14(s,3H),2.02–1.93(m,1H),0.81–0.73(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):560.2[M+H]⁺,582.2[M+Na]⁺.

实施例17:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(4-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物17)

MS(ESI)m/z(％):500.2[M+H]⁺.

实施例18:N-(4-{[2-(乙酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-5-甲基-4-氧代-1-(4-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物18)

MS(ESI)m/z(％):492.2[M+H]⁺.

实施例19:N-(4-{[2-(乙酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-氧代-1-(4-氟苯基)-1,4-二氢哒嗪-3-甲酰胺(化合物19)

实施例20:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物20)的制备

步骤1 [2-氰基-2-(2-苯基亚肼基)乙酰基]氨基甲酸乙酯(h)

取苯胺15.0，浓盐酸90mL，200mL水，使之溶解，该溶液冷却到0℃以下，滴加含有亚硝酸钠13.4g的70mL水溶液，滴加过程中保持温度低于0℃，滴毕，保温搅拌0.5h。滴加400mL乙醇溶解的2-氰基-2-乙酰基氨基甲酸乙酯26.4g和无水乙酸钠39.7的混合液，保温反应3h。将反应混合物中析出的固体过滤，滤饼水洗，干燥得淡黄色产物，即为中间体[2-氰基-2-(2-苯基亚肼基)乙酰基]氨基甲酸乙酯(h)。MS(ESI)m/z(％):[M+H](m/z):260.2。

步骤2 3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-腈(i)

将中间体(h)[2-氰基-2-(2-苯基亚肼基)乙酰基]氨基甲酸乙酯12.1g，乙酸钠19.1g，加至200mL冰乙酸中，升温至回流反应3h，将反应液冷却至室温。反应混合物慢慢倒入1.2L冰水中，搅拌，析出固体，过滤，滤饼水洗两次，石油醚洗涤两次，干燥得橘黄色产物，即为中间体3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-腈(i)。ESI-MS[M+H](m/z):215.1。

步骤3 4-甲基l-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-腈(j)

将中间体(i)3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-腈7.3g，溶解于50mL DMF中，该溶液冷却到0℃以下，慢慢分批加入60％的氢化钠2.1g。保温反应半小时，滴加含有碘甲烷5.8g的20mL DMF溶液，搅拌反应完3h，反应完毕。将反应液倒入冰水中，搅拌半小时，析出固体，过滤，滤饼水洗两次，石油醚洗涤两次，干燥得橘黄色固体产物，即为中间体4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-腈(j)。ESI-MS[M+H](m/z):229.2。

步骤4 4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酸(Q-3)

将中间体(j)4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-腈5.0g，浓盐酸60mL，冰乙酸130mL的混合液升温回流反应5h。减压浓缩反应液，将剩余物加入到100mL水中，搅拌半小时，析出固体，过滤，水洗两次，干燥得灰白色固体，即为中间体(4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酸)(Q-3)。

步骤5 N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物20)

在反应瓶中加入4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酸(1.20mmol)(Q-3)，N-[4-(4-氨基-氟-2-氟苯氧基)吡啶-2-基]环丙基甲酰胺(1.00mmol)(M)，HATU(1.20mmol)，三乙胺(1.20mmol)，15ml DMF，室温搅拌3h反应完毕。反应液倒入100mL 20％的碳酸钠水溶液，分别用50mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，有机相用20％的碳酸钠水溶液洗涤三次，饱和食盐水洗涤有机层两次，分出有机层用无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去二氯甲烷，柱层析分离得化合物20。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.96(s,1H),10.88(s,1H),8.22(d,J＝5.6Hz,1H),7.90(d,J＝12.5Hz,1H),7.66(s,1H),7.63–7.52(m,5H),7.48(t,J＝7.1Hz,1H),7.41(t,J＝8.9Hz,1H),6.74(d,J＝5.5Hz,1H),3.31(s,3H),2.06–1.92(m,1H),0.89–0.67(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):517.2[M+H]⁺.

替换适当的原料及试剂，按照实施例20的制备方案，最终制得实施例21—31(化合物21—31)。

实施例21:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(4-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物21)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.93(s,1H),10.88(s,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),7.89(dd,J＝12.6,2.3Hz,1H),7.70–7.60(m,3H),7.55(dd,J＝8.8,1.3Hz,1H),7.45–7.34(m,3H),6.74(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),3.30(s,3H),2.03–1.90(m,1H),0.77(t,J＝5.9Hz,4H)；MS(ESI)m/z(％):535.2[M+H]⁺,557.1[M+Na]⁺.

实施例22:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(4-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物22)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ10.92(s,1H),8.45(s,1H),8.12(d,J＝5.7Hz,1H),7.88(dd,J＝11.9,2.2Hz,1H),7.77(s,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,2H),7.48(d,J＝8.8Hz,2H),7.38(d,J＝8.1Hz,1H),7.19(t,J＝8.6Hz,1H),6.63(dd,J＝5.7,2.2Hz,1H),3.54(s,3H),1.55–1.45(m,1H),1.12–0.97(m,2H),0.91–0.76(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):551.1[M+H]⁺,573.2[M+Na]⁺.

实施例23:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(2-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物23)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.98(s,1H),10.87(s,1H),8.20(d,J＝5.7Hz,1H),7.87(dd,J＝12.6,2.2Hz,1H),7.68–7.34(m,7H),6.73(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),3.30(s,3H),1.96(m,1H),0.77(t,J＝6.3Hz,4H)；MS(ESI)m/z(％):535.1[M+H]⁺,557.1[M+Na]⁺.

实施例24:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(4-甲氧基苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物24)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.93(s,1H),10.88(s,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),7.90(dd,J＝12.6,2.2Hz,1H),7.65(d,J＝2.2Hz,1H),7.59–7.52(m,1H),7.49(d,J＝8.9Hz,2H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),7.08(d,J＝9.0Hz,2H),6.73(dd,J＝5.7,2.4Hz,1H),3.82(s,3H),3.30(s,3H),2.03–1.91(m,1H),0.77(t,J＝6.7Hz,4H)；MS(ESI)m/z(％):547.2[M+H]⁺.

实施例25:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(3-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物25)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.92(s,1H),10.88(s,1H),8.21(d,J＝5.6Hz,1H),7.90(d,J＝12.5Hz,1H),7.72–7.29(m,7H),6.81–6.64(m,1H),3.31(s,3H),1.97(d,J＝4.9Hz,1H),0.86–0.70(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):535.2[M+H]⁺.

实施例26:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(3-氯苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物26)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ10.90(s,1H),8.76(s,1H),8.12(d,J＝5.7Hz,1H),7.88(d,J＝11.8Hz,1H),7.78(s,1H),7.64(s,1H),7.52(d,J＝3.5Hz,1H),7.47–7.34(m,3H),7.18(t,J＝8.6Hz,1H),6.71–6.55(m,1H),3.53(s,3H),1.59–1.47(m,1H),1.10–1.00(m,2H),0.90–0.79(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):551.1[M+H]⁺,573.1[M+Na]⁺.

实施例27:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(3-氯-4-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物27)

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.91(s,1H),10.88(s,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),7.97–7.80(m,2H),7.63(dt,J＝17.8,6.6Hz,3H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.40(t,J＝8.9Hz,1H),6.74(dd,J＝5.7,2.3Hz,1H),3.30(s,3H),2.02–1.91(m,1H),0.81–0.71(m,4H)；MS(ESI)m/z(％):569.1[M+H]⁺,591.1[M+Na]⁺.

实施例28:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}-3-氟苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(3,4-二甲氧基苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物28)

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ10.96(s,1H),8.57(s,1H),8.12(d,J＝5.8Hz,1H),7.89(dd,J＝11.9,2.2Hz,1H),7.78(d,J＝1.5Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,1H),7.21–7.11(m,2H),7.07(d,J＝2.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.7Hz,1H),6.63(dd,J＝5.8,2.3Hz,1H),3.93(s,3H),3.91(s,3H),3.54(s,3H),1.57–1.50(m,1H),1.09–1.03(m,2H),0.89–0.83(m,2H)；MS(ESI)m/z(％):577.2[M+H]⁺,599.2[M+Na]⁺.

实施例29:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(4-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物29)

MS(ESI)m/z(％):517.2[M+H]⁺,539.2[M+Na]⁺.

实施例30:N-(4-{[2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基]氧基}苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-苯基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物30)

MS(ESI)m/z(％):499.2[M+H]⁺,521.2[M+Na]⁺.

实施例31:N-(4-{[2-(乙酰胺基)吡啶-4-基]氧基}苯基)-4-甲基-3,5-二氧代-2-(4-氟苯基)-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-甲酰胺(化合物31)

MS(ESI)m/z(％):509.2[M+H]⁺,521.2[M+Na]⁺.

实施例32体外抗肿瘤细胞活性

对部分含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物进行了体外抑制c-met激酶活性筛选和抑制人肺腺癌细胞株A549、人肺癌细胞H460、人结肠癌细胞HT-29活性筛选。

c-Met酶活性测试

用于测量c-Met激酶活性的试验基于酶联免疫吸附试验(ELISA)。具体操作是：

室温下，在0.25mg/mL PGT包被的板上，将实施例化合物、50pM c-Met(His-标记的重组人Met(氨基酸974-末端)，通过杆状病毒表达)和5μM ATP在试验缓冲液中(25mM MOPS,PH 7.4，5mM MgCl₂，0.5raM MnCl₂，100μM原钒酸钠，0.01％Triton X-100，1mM DTT，最后DMSO浓度1％(v/v))温育20分钟。通过冲洗除去反应混合物并用0.2μg/mL缀合辣根过氧化物酶(HRP)的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体(PY20)检测磷酸化聚合物底物。加入1M磷酸终止显色后，于450nm处通过分光光度法定量显色的底物(TMB)的颜色。实施例化合物对c-Met激酶的抑制数据见表1。

体外细胞毒活性测试

(1)细胞复苏并传代2-3次稳定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。将细胞消化液倒入离心管中后，之后加入培养液以终止消化。将离心管在800r/min下离心10min，弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10μL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为10⁴个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100μL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。

(2)用50μL二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2mg/mL药液，然后在24孔板中将样品稀释为20,4,0.8,0.16,0.032μg/mL。

每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。

(3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(PBS)将细胞冲洗两遍，在每孔中加入MTT(四氮唑)(0.5mg/mL)100μL放入培养箱中4h后，弃去MTT溶液，加入二甲基亚砜100μL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲臜充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过Bliss法可求出药物IC₅₀值。实施化合物的抑制人肺腺癌细胞细胞株A549、人肺癌细胞H460、人结肠癌细胞HT-29活性结果见表1。

化合物的抑制c-met激酶、人肺腺癌细胞株A549、人肺癌细胞H460、人结肠癌细胞HT-29活性结果见表1所示，表1中的IC₅₀≦0.1μM，以A表示，0.1μM﹤IC₅₀≦1.0μM，以B表示，1.0μM﹤IC₅₀≦5.0μM，以C表示，5.0μM﹤IC₅₀≦10.0μM，以D表示，10.0μM﹤IC₅₀≦30.0μM，以E表示。

表1

从表1可以清楚地看出，本发明所要保护的通式(Ⅰ)的含3-哒嗪酮、4-哒嗪酮和1,2,4-三嗪酮结构的4-苯氧基吡啶类衍生物在体外对肿瘤细胞株和c-met激酶均具有良好的体外抑制活性。该类化合物具有良好的抗肿瘤药物开发应用前景。

尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之。