猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用 (Porcine circovirus type 3 virus-like particle and preparation method and application thereof ) 是由 邵伟 徐高原 孙婉莹 陈清秀 张华伟 曾小燕 汤细彪 周明光 金建云 陈章表 于 2021-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用。本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统表达PCV3 Cap蛋白变体,以制备病毒样颗粒。本发明尝试利用杆状病毒的双启动子启动Cap蛋白表达,在保留Cap蛋白N端富含碱性氨基酸的基础上,缺失第1-22位氨基酸并插入编码杆状病毒碱性蛋白P6.9N端富含碱性氨基酸的序列,使Cap蛋白以融合方式进行表达。结果显示,表达的融合蛋白不仅可以形成病毒样颗粒,并且蛋白以较高水平表达,为进一步研制PCV3疫苗及实现PCV3病毒样颗粒的工业化生产提供基础。(The invention provides porcine circovirus type 3 virus-like particles and a preparation method and application thereof. The present invention utilizes an insect-baculovirus expression system to express a variant of PCV3Cap protein to produce virus-like particles. The invention tries to start the expression of the Cap protein by using double promoters of baculovirus, deletes the amino acids from the 1 st to the 22 th positions and inserts a sequence which codes the basic amino acid rich at the P6.9N end of the baculovirus basic protein on the basis of keeping the basic amino acid rich at the N end of the Cap protein, so that the Cap protein is expressed in a fusion mode. The result shows that the expressed fusion protein can not only form virus-like particles, but also express the protein at a higher level, thereby providing a foundation for further developing PCV3 vaccine and realizing the industrial production of PCV3 virus-like particles.)
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体地说，涉及一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用。背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，含有单股环状DNA，是最小的动物DNA病毒之一，首次在1974年于猪肾细胞系(PK-15细胞系)中发现。目前，已发现4种基因型的PCV，分别为PCV1，PCV2，PCV3，PCV4。PCV1无致病性，PCV4是2019年新发现的一种基因型，其致病性有待进一步研究。PCV2可感染单核细胞、巨噬细胞等，造成猪的免疫细胞损伤，导致感染猪较为严重的免疫抑制，从而引起猪断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)、皮炎与肾病综合征(PDNS)、增生性坏死性间质性肺炎(PNP)及繁殖障碍等症状。PCV3是2015年在美国发现的，对发病猪的组织进行免疫组化(immunohistochemistry，IHC)及定量PCR(immunohistochemistry，IHC)检测，确定发病猪并无PCV2、猪蓝耳病毒(PRRSV)等可能引起PDNS的病毒，提示PCV3类似于PCV2，也可能导致感染猪发生PDNS和繁殖障碍等疾病。而后的研究表明，用感染性克隆获得的PCV3对4周龄且无特定病原(SPF)的小猪进行鼻腔接种可导致小猪出现PDNS疾病。目前PCV3已在世界多个国家流行，并在中国的多个省份被检测到。鉴于PCV2与PCV3同源性较低，存在交叉保护可能性的可能很低，PCV3对猪养殖业可能带来巨大损失，因此开发针对PCV3的检测试剂盒和疫苗对PCV3的检测和控制具有重要的意义。
PCV病毒粒子对外界具有较强抵抗力，采用常规物理、化学方法难以根除，对猪接种疫苗进行免疫预防是有效控制PCV感染的重要手段。针对PCV3，目前尚无商业化的疫苗，主要原因是PCV3极难在体外进行分离培养，较难建立动物感染模型及获得可用于制备灭活疫苗的活病毒。病毒样颗粒是一类仅由病毒结构蛋白组成的在结构上类似亲本病毒粒子的结构，不含病毒核酸，可通过基因合成并利用原核或真核表达系统进行表达，而无需获得活性病毒。因此病毒样颗粒具有类似于亲本病毒一样的免疫原性，但有更高的安全性，其生产制备对环境、设备等条件也较低，有利于降低生产成本和实现大规模生产。PCV3病毒粒子含有唯一的结构蛋白或保护性抗原，即衣壳蛋白Cap，单独表达Cap可以形成病毒样颗粒。因此表达和制备针对PCV3的由Cap蛋白组成的病毒样颗粒，是疫苗研发的重要方向。
为制备PCV3病毒样颗粒，许多研究单位或企业常采用重组大肠杆菌表达系统。目前虽然可以实现Cap蛋白的可溶表达，但表达量低，且原核表达系统不能对表达的蛋白进行磷酸化、糖基化等在真核细胞中存在的修饰，原核表达系统也还存在内毒素的问题，在工业化生产上也需要进行去内毒素处理；蛋白纯化之前需要裂解菌体，有时还需要切除融合序列再进行蛋白的纯化。以上因素使得利用原核表达系统制备PCV3病毒样颗粒工序复杂、得到的疫苗免疫原性可能较差。另外，也有利用酵母表达系统进行分泌表达，其技术策略是在编码Cap的核苷酸序列之前添加编码分泌信号肽的核苷酸序列，是使Cap蛋白分泌表达，但是分泌表达量较低。杆状病毒表达系统，具有容纳较大外源插入基因、蛋白表达水平高、操作简便及翻译后加工修饰等诸多优点而被广泛使用。目前虽有全长和N端32个氨基酸截短型的Cap蛋白在杆状病毒中获得表达并可以形成VLP(virus-like particle)，但是Cap蛋白N端第1～32位氨基酸富含碱性氨基酸，能够介导Cap蛋白的入核转运，完整Cap蛋白的表达可能会影响其在表达系统中的表达量，然而整段的缺失却又有可能会影响病毒样颗粒表面的特性及病毒样颗粒的稳定性，从而影响其免疫原性。初期研究发现完整的PCV3 Cap蛋白及缺失N端32个氨基酸的Cap蛋白在昆虫细胞中的表达量极低，无法满足产业化。此外，上述利用杆状病毒表达系统的方案中，仅将密码子未优化Cap基因插入到了表达载体上，并且也未添加其他元件或者对载体进行改造以进一步提高蛋白的表达量。
综上，PCV3 Cap病毒样颗粒的研发具有重要意义，但在目前Cap蛋白的表达上，原核表达系统工序较为复杂，蛋白无翻译后修饰，获得病毒样颗粒免疫原性较真核表达差的问题，而酵母表达系统分泌表达量较低，昆虫-杆状病毒表达系统仍需进一步优化与改进。因此，目前亟需开发一种高效的PCV3病毒样颗粒的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种猪圆环病毒3型Cap蛋白变体，所述Cap蛋白变体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(由猪圆环病毒3型Cap蛋白第23～214位氨基酸组成)；或
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
第二方面，本发明提供编码所述蛋白变体的核酸分子。
第三方面，本发明提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒是利用昆虫-杆状病毒表达系统表达所述蛋白变体得到的病毒样颗粒。
优选地，所述昆虫-杆状病毒表达系统采用双启动子启动猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的表达，即使用PH启动子并同时融合杆状病毒p6.9基因的启动子和5’端部分编码序列(即编码P6.9蛋白N端部分氨基酸的核酸序列，其中，所述杆状病毒P6.9蛋白N端部分氨基酸至少包括杆状病毒P6.9蛋白N端第2～9位氨基酸，如VYRRRRRS)，将外源目的基因以单拷贝或多拷贝形式插入到启动子下游。
第五方面，本发明提供猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括：首先构建用于表达所述蛋白变体的重组杆状病毒，然后用重组杆状病毒感染昆虫细胞，待细胞病变后，从细胞培养液中分离得到病毒样颗粒；
所述方法中，将编码所述Cap蛋白变体的核酸序列与PH-p6.9双启动子可操作地连接，并在编码所述Cap蛋白变体的核酸序列的起始密码子之前插入编码杆状病毒P6.9蛋白N端部分氨基酸的核酸序列；其中，所述杆状病毒P6.9蛋白N端部分氨基酸至少包括杆状病毒P6.9蛋白N端第2～9位氨基酸(VYRRRRRS)，优选包括杆状病毒P6.9蛋白N端11位氨基酸(MVYRRRRRSST)，所述PH-p6.9双启动子由杆状病毒PH启动子和p6.9启动子串联而成。
优选地，用于构建重组杆状病毒的载体可选自pFastBac1、pFastBac HTA、pFastBac HTB、pFastBac HTC、pFastBacDual、pIEx-Bac、pOET或pQB等用于昆虫-杆状病毒表达系统的系列载体，以及在这些载体基础上经过改造后的载体；更优选pFastBac1。
优选地，所述昆虫细胞可选自Sf9、Sf21或High Five(Hi5)等，以及在这些细胞基础上经过基因敲除、插入或修饰等改造的昆虫细胞。
本发明中，p6.9启动子的序列如SEQ ID NO:6所示。
PH-p6.9双启动子的序列如SEQ ID NO:7所示。
将N端连有P6.9蛋白N端部分氨基酸的PCV3 Cap蛋白变体的融合蛋白(P6.9蛋白N端第1～11位氨基酸+PCV3 Cap蛋白第23～214位氨基酸)命名为P6-Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
第五方面，本发明提供一种猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗，所述疫苗包含所述蛋白变体，或者所述疫苗包含所述病毒样颗粒，或者所述疫苗包含按照上述方法制备的病毒样颗粒。
第六方面，本发明提供所述蛋白变体，或者所述病毒样颗粒，或者按照上述方法制备的病毒样颗粒的以下任一应用：
1)用于制备猪圆环病毒3型多克隆抗体或单抗；
2)用于制备猪圆环病毒3型抗体检测试剂；
3)用于猪圆环病毒3型病毒感染的检测；
4)用于制备猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗；
5)用于预防猪圆环病毒3型感染以及由其感染所致相关疾病。
进一步地，本发明还涉及对编码猪圆环病毒3型Cap蛋白的核苷酸序列进行优化，以及高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒的构建和PCV3病毒样颗粒(VLP)的制备。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统表达PCV3 Cap蛋白变体，以制备病毒样颗粒。本发明首次尝试在Cap蛋白的N端只进行部分序列的缺失，以保留其富含碱性氨基酸的特性，并证明缺失N端第1～22位氨基酸不影响Cap蛋白病毒样颗粒的组装和形成；同时，本发明首次尝试利用杆状病毒的双启动子启动PCV3 Cap蛋白的表达，并同时融合了杆状病毒碱性蛋白P6.9的N端富含碱性氨基酸序列，进一步保留了Cap蛋白的N端其富含碱性氨基酸的特性。结果显示，表达的融合蛋白不仅可以形成病毒样粒子结构，并且蛋白以较高水平表达，为进一步研制针对PCV3的病毒样颗粒疫苗及PCV3病毒样颗粒的工业化生产提供基础。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中编码PCV3 Cap蛋白的PCR扩增结果。其中，2和3泳道为编码全长PCV3 Cap蛋白(Cap-FL)的序列扩增结果；4和5泳道为编码P6-Cap融合蛋白的序列扩增结果。
图2为本发明较佳实施例中PCR鉴定克隆子。其中，M为DNA分子量标准，1-4分别表示pFB1-PCV3-Cap-FL阳性克隆子，pFB1-PP6-PCV3-P6-Cap阳性克隆子、以pFastBac1空质粒载体为模板的对照和不加模板的空白对照。
图3为本发明较佳实施例中间接免疫荧光检测重组病毒表达的PCV3 Cap蛋白。其中，Mock为健康Sf9细胞，Bac-PCV2-Cap为表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的病毒。
图4为本发明较佳实施例中PCV3 Cap蛋白的表达及鉴定结果。其中，1)为PCV3Cap蛋白的SDS-PAGE检测，M：蛋白分子量标准；1：Bac-PCV3-Cap-FL病毒感染的全细胞样品；2：Bac-PP6-PCV3-PP6-Cap病毒感染的全细胞样品。2)为PCV3 Cap蛋白的Western blot检测，M：蛋白分子量标准；1：Bac-PCV3-Cap-FL病毒感染的全细胞样品；2：Bac-PP6-PCV3-PP6-Cap病毒感染的全细胞样品；Control:Bac-PCV2-Cap病毒感染的全细胞样品。其中第一抗体为针对PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体。
图5为本发明较佳实施例中重组杆状病毒表达的PCV3 Cap形成病毒样颗粒的电镜观察1)和Western blot鉴定2)结果。
图6为本发明较佳实施例中不同接毒条件下P6-Cap蛋白的表达情况。
图7为本发明较佳实施例中P6-Cap蛋白纯化的SDS-PAGE图。
图8为本发明较佳实施例中免疫仔猪PCV3 Cap抗体水平的ELISA检测结果。
具体实施方式
本发明的目的之一是提供新的可自组装形成病毒样颗粒的PCV3 Cap的核苷酸和氨基酸序列，以保留Cap蛋白N端富含碱性氨基酸的特性，减少其形成的病毒样的颗粒与天然病毒结构间的差异从而缩小两者间免疫原性的差别。
本发明的目的之二是提供提高PCV3 Cap蛋白在杆状病毒表达系统中的表达量的构建方法，以降低生产成本。
本发明的目的之三是提供基于上述目的而得到的PCV3病毒样粒子，为PCV3的疫苗制备和血清学检测提供免疫原或抗原。
为了达到上述目的，本发明通过缺失PCV3 Cap蛋白N端第1～22位氨基酸，将编码核酸序列克隆到pFastBac1载体的PH启动子下游并同时融合杆状病毒p6.9基因的启动子和5’端部分编码序列(即编码杆状病毒P6.9蛋白N端第1～11位氨基酸的核酸序列)，然后构建重组杆状病毒进行Cap蛋白的表达，并通过电镜检测病毒样颗粒的形成。获得的重组病毒抗原表达水平高，融合的Cap蛋白能够很好地形成病毒样颗粒，并具有很好的免疫原性。本发明制备的病毒样颗粒表达水平高，利用其制备的疫苗安全性高，免疫仔猪后能够使本体动物产生较高水平的特异性抗体。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的载体pFastBac1购自Invitrogen，所有内切酶及T4 DNA连接酶均购自Thermo Scientific。
实施例1重组病毒的构建
重组杆状病毒获取的具体技术路线如下：
1、获取Cap蛋白编码序列
S1、设计正向和反向扩增引物，分别为5’-TAAGGATCCAATCATGCGTCACCGTGCTATCTTCCGTCGCCGTTCCCGCCCTAGGAGACGTCGACGCCACAGAAGGCGCTACGTGCGCCGCAAGCTGTTCATCCGCCGCCCCACAGCTGGCACATACTACACCAA-3’(下划线代表BamHI限制性酶切位点，斜体表示在酶切位点和ATG起始密码子间插入的核苷酸序列)和5‘-GACAAGCTTTTACAGCACGCTCTTGTACCTGATCCA-3’(下划线表示HindIII限制性酶切位点)，序列合成由武汉擎科生物公司完成。
S2、以CN111558037A中公开的pFastdual-PCV3 ORF2重组转移载体为模板，采用步骤S1中的正向和反向引物，利用PrimerSTAR Max DNA Polymerase(宝生物工程(大连)有限公司)并参照使用说明书进行聚合酶链式扩增(PCR)，以获得全长的编码PCV3 Cap的核苷酸序列，序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本步骤中PCR的条件设置如下：
98℃，3min预变性→(98℃，15S变性→55℃，15S退火→72℃，10S延伸)，循环34次→72℃，5min。
S3、扩增得到的片段经过1％的琼脂糖凝胶电泳后(图1，Cap-FL)，切胶，然后通过胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit,Omega)根据使用说明书进行回收，命名为Cap-FL。
S4、设计用于扩增含有杆状病毒p6.9基因片段融合的Cap编码序列的引物(表1)：
表1用于扩增杆状病毒p6.9基因片段融合的Cap编码序列的相关引物合成
S5、利用P6-for-BamHI和P6-Rev为一对引物，以DH10Bac菌液(来自Bac-to-Bac系统)为模板，利用PrimerSTAR Max DNA Polymerase进行PCR扩增，得到含有p6.9启动子序列(133bp，SEQ ID NO:6)和编码P6.9蛋白N端第1～11位氨基酸的DNA片段(33bp)。
S6、利用P6-Cap-for和Cap-Rev-XbaI为一对引物，上述pFastdual-PCV3 ORF2为模板，利用PrimerSTAR Max DNA Polymerase进行PCR扩增，得到含有编码Cap蛋白第23～214位氨基酸残基的DNA片段(579bp)。
S7、利用P6-for-BamHI和Cap-Rev-XbaI为一对引物，以步骤S2和S3中扩增得到的DNA片段为模板(等量)进行重叠PCR扩增，得到融合DNA片段(图1，P6-Cap)并跑琼脂糖凝胶后回收，即得含有杆状病毒p6.9基因片段融合的Cap编码序列，序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的融合蛋白序列如SEQ ID NO:4所示。
2、质粒构建
S1、用BamHI和XbaI双酶切编码P6-Cap的片段和pFastBacI，然后用T4 DNA连接酶进行连接，4℃过夜；
S2、将步骤S1中的连接产物转化到Top10化学感受态细胞(Invitrogen)中，37℃摇床中摇菌1h后，全部涂菌到含有庆大霉素的固体平板上，37℃培养过夜(16h)；
S3、挑取单菌落，通过PCR检测阳性克隆。
本步骤中，使用引物P6-Cap-for和Cap-Rev-HindIII并利用rTaq DNA聚合酶进行PCR鉴定，条件设置如下：
95℃，3min预变性→(95℃，20S变性→55℃，30S退火→72℃，30S延伸)，循环19次→72℃，5min。
S4、取鉴定为阳性的一个克隆(图2，泳道2)，37℃摇床中摇16h后，用质粒提取试剂盒提取质粒，进行测序，测序结果正确，保存菌。质粒命名为pFB1-PP6-PCV3-P6-Cap。
之后，按照相同方法构建pFB1-PCV3-Cap-FL，除在S1步骤中用BamHI和HIndIII双酶切编码Cap-FL的片段与pFastBacI不同外，其他操作同pFB1-PP6-PCV3-P6-Cap质粒的构建。
3、重组病毒的构建与获得
S1、采用Bac-to-Bac系统(Invitrogen)，并根据说明书，将步骤2中获得的供体质粒pFB1-PP6-PCV3-P6-Cap和pFB1-PCV3-Cap-FL转化到DH10Bac中，然后进行两轮的蓝白斑筛选并进行PCR检测，提取鉴定正确的重组杆状病毒基因组，分别命名为Bac-PP6-PCV3-P6-Cap和Bac-PCV3-Cap-FL。
S2、利用Cellfectin转染试剂，分别用Bac-PP6-PCV3-P6-Cap和Bac-PCV3-Cap-FL转染Sf9细胞，然后观察转染情况，转染后第6天收取培养基，4℃保存，记为P0种毒。
S3、按照2.0×106cell/mL的密度，接种P0种毒进行盲传，获得的种毒依次记为P1、P2种毒；其中，P2种毒作为后续表达毒种。
实施例2重组病毒及表达Cap的鉴定
为了鉴定重组病毒，采用间接免疫和蛋白免疫印迹的方式：
间接免疫主要过程如下：在24孔板中，每孔接种1×105cell，然后感染Bac-PCV3-Cap-FL、Bac-PP6-PCV3-P6-Cap或Bac-PCV2-Cap(表达PCV2 Cap蛋白的杆状病毒由武汉科前生物股份有限公司构建和保存)，同时将不加病毒感染的健康Sf9细胞(Mock)做空白对照。在病毒感染72h时，细胞用4％多聚甲醛溶液固定10min，然后用0.2％的Triton X-100溶液进行透化10min，并用5％的BSA常温封闭3h，再用抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体与细胞在常温下封闭3h，用PBS轻轻洗3次之后，再用荧光标记的羊抗小鼠IgG二抗(Invitrogen)常温下封闭30min，然后用PBS轻轻洗3次之后，用荧光显微镜观察。间接免疫的荧光结果见图3。
其中，所述抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体的制备过程主要包括：
S1：设计正向引物Cap-NcoI-For(5’-ATACCATGGATACCTACCAGAACAACTGGCGTTCTGGCGGCTCTCCCACAGCTGGCACATACTACACC-3’)，然后与实施例1中的反向引物(5‘-GACAAGCTTTTACAGCACGCTCTTGTACCTGATCCA-3’)作为一对引物，以Cap-FL核酸片段为模板，进行PCR扩增，获得编码包含Cap蛋白第32～214位氨基酸的核酸序列(SEQ ID NO:8)，其氨基酸序列见SEQID NO:9。
S2：将S1中获得的核酸片段同pET-28a(Novagen)载体进行NcoI和HindIII双酶切，跑1％琼脂糖凝胶后回收，然后用T4 DNA连接酶进行酶连，经转化、涂板、PCR鉴定后得到阳性克隆子，然后提取质粒测序。
S3：取测序正确的质粒，转化到BL21(DE3)感受态细胞(北京全式金)中，进行蛋白的表达，其诱导条件为37℃，IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间为6h，然后收集细胞进行蛋白的纯化。
S4：蛋白以包涵体进行表达，纯化以包涵体纯化的方法进行，主要过程为裂解细菌后收集沉淀，用含有1％Triton X-100的PBS缓冲液重悬沉淀，超声处理，然后离心取沉淀，重复3次。
S5：沉淀再用含有1M尿素的PBS缓冲液重悬，室温放置10min后再次离心获得沉淀，然后沉淀用含8M尿素的磷酸盐缓冲液(0.1M NaH2P04；0.01M Tris-Cl，pH8.0)进行充分溶解，4℃过夜，离心后取上清，进行充分的梯度透析。
S6：利用透析后的蛋白溶液作为抗原，以100μg/只的总量加弗氏完全佐剂(Sigma)免疫Balb/c小鼠(购自武汉生物制品研究所)，14天后以相同剂量但替换为弗氏不完全佐剂(Sigma)进行第二次免疫，二免14天后再进行与第二次相同疫苗及剂量的第三次免疫。
S7：第三次免疫后第7天，进行摘眼球采血，常温静置，待血液凝固后离心获得血清即为抗PCV3 Cap蛋白的多克隆抗体。
蛋白免疫印迹主要过程如下：用Bac-PCV3-Cap-FL、Bac-PP6-PCV3-PP6-Cap或Bac-PCV2-Cap重组病毒感染细胞密度为2.0×106cell/mL的悬浮Sf9细胞(0.5moi)，感染后5天，取40μL全细胞培养液，加SDS-PAGE Loading Buffer，沸水煮10min，然后通过SDS-PAGE进行电泳，再通过湿转将蛋白转到PVDF膜，经脱脂牛奶封闭，抗PCV3Cap抗体孵育，洗膜，辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG(Proteintech)孵育和洗膜后，通过化学发光显色仪显色。蛋白免疫结果见图4中2)。
实施例3电镜观察
将200mL密度为2×106cell/mL的Sf9细胞分别感染Bac-PCV3-Cap-FL、Bac-PP6-PCV3-P6-Cap，其中接毒量为0.5moi。感染第4天时，通过SDS-PAGE检测Cap的表达情况，见图4中1)。待感染细胞破碎之后(感染后8d)，收集细胞培养液，10000g离心0.5h去掉细胞碎片，取上清，200，000g离心2h，再用双蒸水(ddH2O)重悬沉淀，然后经25％-45％的蔗糖密度梯度，180,000g离心2h，取离心管底部沉降物，用ddH2O重悬，然后用磷钨酸盐负染，再进行电子显微镜观察，见图5中1)。
电镜结果显示，两种表达策略中都有约20-25nm的结构形成，为确定得到的结构是由Cap蛋白组装形成的VLP，对用于制备电镜的样品进行SDS-PAGE分离后经Western blot检测，见图5中2)。Western blot结果显示，电镜制样的样品的确是含有Cap蛋白的悬液。电镜结果表明两种表达策略表达的Cap蛋白都能很好地形成VLP。这表明Cap蛋白的N端部分缺失及融合P6.9 N端第1-11位氨基酸不影响其病毒样颗粒的形成。
实施例4蛋白表达条件摸索
为进一步摸索蛋白的合适表达条件，以提高蛋白的表达量，用实施例1的Bac-PP6-PCV3-P6-Cap，以不同moi感染密度为2×106cell/mL的High Five细胞，在感染后第6天，通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达情况，结果见图6。结果显示，以0.5moi和1moi的病毒量感染2×106cell/mL High Five细胞，P6-Cap蛋白可以得到较高水平的表达。
实施例5疫苗制备及动物实验
1、疫苗制备
将感染的Sf9细胞经过高压破碎，离心去掉细胞碎片后，经两次25％-45％的蔗糖密度梯度离心，取离心管底部沉降物用0.02M的PBS重悬，无菌过滤后作为抗原。然后跑SDS-PAGE蛋白胶并以50μg/mL的BSA为参照品(图7)，评估P6-Cap蛋白的含量，并稀释成50μg/mL，用于配制疫苗：
1)P6-Cap抗原液(50μg/mL)12mL；
2)氢氧化铝佐剂(2mg/mL)3mL，购自美国CHEMTRADE公司。
将1)的抗原液和2)的佐剂充分混合，即得抗原含量为40μg/mL的猪圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗。
2、动物免疫及抗体检测
(1)猪圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗安全性评价
取21-27日龄实验仔猪(长白猪种，平均体重5.8±0.6kg)，选用PCV2、PCV3抗原和抗体阴性及PRRSV抗原阴性猪。取10头猪，随机分为2组，分空白对照组和疫苗组。其中空白对照组5头，颈部肌肉多点注射灭菌生理盐水1mL；疫苗组5头，颈部肌肉多点注射疫苗1mL。观察免疫猪精神状态、取食、活动、注射部位病变等情况，连续观察14天，同时每3天测量猪直肠温度。结果显示疫苗组同空白对照组一样，免疫仔猪精神状态、取食和活动正常，注射部位无红肿、溃烂等，两组仔猪体温也均处于正常范围内(38℃-39.5℃)，这表明利用杆状病毒表达系统制备的圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗对本体动物是安全的。
(2)猪圆环病毒3型病毒样颗粒疫苗免疫原性评价
取21-27日龄实验仔猪(长白猪种，平均体重6.1±0.5kg)，选用PCV2、PCV3抗原和抗体阴性及PRRSV抗原阴性猪。取10头猪，随机分为2组，分空白对照组和疫苗组。其中空白对照组5头，颈部肌肉多点注射灭菌生理盐水1mL；疫苗组5头，颈部肌肉多点注射疫苗1mL。注射免疫14天时，以相同疫苗和剂量进行第二次免疫，在第二次免疫14天时，采取猪血清标本，疫苗组血清经1:1000稀释，然后以ELISA法(抗原包被板是利用碳酸盐包被缓冲液将原核表达的PCV3 Cap蛋白(SEQ ID NO:9)按照100μg/孔的浓度包被到96孔酶标板上制成)检测两组试验仔猪抗Cap蛋白的抗体，结果见图8。结果表明，本发明中利用昆虫-杆状病毒表达系统制备的疫苗可以刺激免疫仔猪产生较高效价的抗PCV3 Cap蛋白抗体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用
<130> KHP211111116.5
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus strain E2)
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tggcacgcta accacttcat cacccgcctg aacgagtggg agaccgccat cagcttcgag 180
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accaagacca tgttcggtca caccgccatc gacctggacg gtgcctggac caccaacacc 300
tggctgcagg acgaccctta cgctgaaagc agcacccgta aggttatgac ctccaagaag 360
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gtgcagtggg gcgctctgct gtggagcatc tacgtgcctg aaaagaccgg tatgaccgac 540
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<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)
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Ser Val Leu
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