阅读说明：本技术 基于tcv的同时沉默2个内源基因的vigs载体 (TCV-based VIGS vector capable of simultaneously silencing 2 endogenous genes ) 是由 张秀春 吴坤鑫 刘志昕 于 2019-11-06 设计创作，主要内容包括：本申请属于植物功能基因组研究技术领域,具体涉一种基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体的专利申请。所述2个基因,其中一个为内源基因PDS,另一个为内源基因“X基因”,该VIGS载体用于植物中基因沉默。构建步骤包括：用人工合成片段构建基于TCV高效沉默PDS基因的病毒诱导沉默载体CPB1B、构建基于TCV高效沉默目标基因“X基因”和PDS的VIGS载体CPB1B-X等步骤。由于利用该载体对拟南芥内源靶标基因进行功能鉴定时,具有直观、快速、高通量、易操作等明显优势,因此具有较好的实用价值和推广应用意义。同时该构建方法还为其他同时沉默两个、多个功能基因的VIGS载体提供了较好借鉴和参考。(The application belongs to the technical field of plant functional genome research, and particularly relates to a TCV-based VIGS vector capable of silencing 2 endogenous genes simultaneously. One of the 2 genes is an endogenous gene PDS, and the other is an endogenous gene 'X gene', and the VIGS vector is used for gene silencing in plants. The construction steps comprise: the virus induction silencing vector CPB1B based on the TCV high-efficiency silencing PDS gene is constructed by using the artificially synthesized fragment, the VIGS vector CPB1B-X based on the TCV high-efficiency silencing target gene X gene and PDS is constructed, and the like. When the vector is used for carrying out function identification on an arabidopsis endogenous target gene, the vector has the obvious advantages of intuition, rapidness, high flux, easiness in operation and the like, so that the vector has better practical value and popularization and application significance. Meanwhile, the construction method also provides better reference and reference for other VIGS vectors capable of silencing two or more functional genes simultaneously.)

基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体

技术领域

本申请属于植物功能基因组研究技术领域，具体涉一种基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体的专利申请。

背景技术

病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是一种根据植物抵抗病毒入侵原理而开发的一种RNA沉默技术，是用于基因功能分析的反向遗传工具。其作用原理是：植物在抵抗病毒入侵时会启动RNA沉默，因此当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后，首先在寄主体内形成双链RNA（dsRNA），双链RNA或部分双链的发夹结构在细胞中被双链RNA专一的核酸内切酶——Dicer或Dicer-like(简称DCL)剪切产生长度20 nt左右小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA），siRNA随后被Argonaute(AGO)蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC特异性地识别与降解细胞质中的同源RNA，从而发生转录后水平的基因沉默（PTGS）。与常用的基因转化、基因敲除和反义抑制等生物技术工具相比，VIGS具有成本低、不需要稳定的遗传转化、能够瞬时沉默基因的表达、而且允许大规模筛选基因等优点。因此，该方法已广泛用于许多植物物种中，用于抗病性、抗逆性和基因的代谢调节及各种植物发育过程的研究。目前已有多种病毒用于VIGS载体的构建，常用的如烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）、苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）等，成功运用于烟草、拟南芥、大豆、苹果等物种中基因功能研究。

芜菁皱缩病毒（Turnip crinkle virus，TCV ）是一种番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）麝香石竹斑驳病毒属（Carmovirus）的常见病毒。TCV主要感染十字花科植物，引起芜菁（Brassica rapa）叶片皱缩、斑驳和轻微扭曲，有时出现更严重的植物畸形或丛矮。前期研究中，发明人在沉默抑制子功能减弱的TCV突变体CPB中***了92 bp拟南芥八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）序列，构建了VIGS载体CPB-CC-PDS，该载体能有效诱导野生型、及拟南芥dcl2、dcl4单突变体发生抗病毒RNA沉默，产生白化现象(Zhang et al., Temperature-Dependent Survival of Turnip Crinkle Virus-Infected Arabidopsis Plants Relies on an RNA Silencing-Based Defense ThatRequires DCL2, AGO2, and HEN1，2012)。

由于实际研究及应用中，基于VIGS技术大多是沉默单基因的研究。而由于基因功能的关联性，因此，开发设计同时沉默两个、甚至多个功能基因的VIGS载体，具有十分重要的技术价值。

发明内容

基于发明人前期研究工作，在现有基于TCV突变体CPB基础上，本发明目的在于提供一种采用人工合成片段及无缝连接相结合的方法，构建一种可同时沉默2个内源基因（其中一个为内源基因PDS，另一个内源基因例如为DRB2基因（Double strand RNA bindingprotein 2））VIGS载体，该载体可用于目标基因的功能研究，并且可以植物叶片是否发生白化为指示，从而直观判断病毒诱导的基因沉默是否发生。同时该VIGS载体的构建方法也可为开发设计同时沉默两个、甚至多个功能基因的VIGS载体提供一定借鉴和参考。

本申请所采取的技术方案详述如下。

基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体，所述2个基因，其中一个为内源基因PDS，另一个内源基因“X基因”例如为DRB2基因（Double strand RNA binding protein 2），该VIGS载体用于植物（具体例如拟南芥）中基因沉默；该VIGS载体通过如下步骤构建获得：

（一）利用人工合成片段构建基于TCV高效沉默PDS基因的病毒诱导沉默载体CPB1B

（1）靶标PDS的基因片段设计和合成

首先，经生物信息学软件分析（https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder），分析确定现有病毒沉默载体CPB-CC-PDS中PDS片段中可能产生的siRNA序列（序列如SEQ ID NO.1所示）为：5’-AAGATGGTTTATCAGTCAAAG-3’；

然后，人工合成包含该序列的44 bp的PDS基因片段PDS1-F，另外合成在3’端添加碱基“TAC”的反向互补序列PDS1-R(TAC)；

最终合成序列分别为：

PDS1-F：5’-CAAGATGGTTTATCAGTCAAAGAATGGATGGAAAAGCAGGGAGTAC-3’，

PDS1-R(TAC)：5’-TCCCTGCTTTTCCATCCATTCTTTGACTGATAAACCATCTTGGTAC-3’；

（2）构建病毒诱导沉默载体CPB1B

首先，将人工合成片段PDS1-F和PDS1-R(TAC)等量混合后，进行变性、退火处理；

其次，对病毒沉默功能抑制子功能减弱的TCV病毒载体CPB-CC进行Kpn I单酶切，凝胶回收线性化产物并进行去磷酸化处理；

第三，将回收的磷酸化处理产物与经变性、退火的人工合成片段PDS1-F和PDS1-R(TAC)的混合物，进行连接；

第四，将连接产物转入感受态细胞后，随机选取Amp⁺的LB平板上形态正常的菌落进行质粒提取，酶切鉴定的阳性克隆再进行测序鉴定，确保重组正确；

（3）检测验证VIGS病毒载体CPB1B沉默效果

将所构建的VIGS载体CPB1B经Xba I单酶切线性化并进行纯化回收后，用ThermoScientific的Transcript Aid T7 High Yield Transrciption Kit进行体外转录病毒；

转录的病毒接种移栽4周后的拟南芥dcl4突变体幼苗，接种病毒后进行表型观察和半定量RT-PCR检测，以检测和评价沉默效果；

需要解释的是，上述构建过程中，通过人工合成的2个片段的变性、退火处理，最终形成了带有Kpn I粘性末端的双链DNA，因此可直接与经Kpn I酶切的TCV突变体CPB进行连接，从而构建获得含人工合成片段但仅保留一个Kpn I酶切位点的VIGS载体CPB1B；

（二）构建基于TCV高效沉默目标基因“X基因”和PDS的VIGS载体CPB1B-X

所述“X基因”具体例如为DRB2基因，具体过程为：

（1）靶标基因的基因沉默序列选择及引物设计

首先，对内源靶标基因DRB2基因的反向互补序列进行分析，确定最有可能产生siRNA的序列的100 bp左右目的基因片段作为靶序列，以此进行病毒载体的构建；

以利用网址https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder的软件分析为例，分析确定时应选取尽量包含软件分析前5个最有可能产生siRNA的序列的100 bp目的基因片段作为靶序列，以此进行病毒载体的构建；

实践中，作为参考对照，同时转染外源基因GUS基因进行转化操作，以作为参考对照，即，针对外源GUS基因进行靶向序列的选择，构建***外源GUS的病毒载体，以作为参考对照；

最终确定的内源基因DRB2及外源GUS基因的靶向序列分别为：

DRB2A序列（102bp，如SEQ ID NO.2所示）：

TTTCCAAGGCTGCTGCCATAATTCTGTCAATACCGGAAGTTGCTGCTAAGGATGATCTGCTGCTTCTGGAAGGTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGTAAGATTC

DRB2B序列（100bp，如SEQ ID NO.3所示）

GTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGTAAGATTCTCGATGTGGTTGCAGGAGAAGGCTGTGGACTTGTTGGTCTAAGGTTCTGCATAAAGAACTTCTTTGCAAA

GUS序列（100bp）：

GTCACGCGCTATCAGCTCTTTAATCGCCTGTAAGTGCGCTTGCTGAGTTTCCCCGTTGACTGCCTCTTCGCTGTACAGTTCTTTCGGCTTGTTGCCCGCT

其次，设计扩增靶序列的正反向引物（具体例如利用软件Primer premier 5.0设计靶标序列引物）；设计引物时，为便于后续片段扩增、以及与经Kpn I单酶切后的病毒载体CPB1B进行无缝连接，在正反向引物设计中分别添加病毒载体CPB1B酶切位点Kpn I两侧的序列的部分序列“5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTAC-3’”和5’端的部分序列“5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATG-3’”，因此，最终引物序列设计为：

G-CPB1B-DRB2AF：

5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACTTTCCAAGGCTGCTGCCATAATTC-3’，

G-CPB1B-DRB2AR：

5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGGAATCTTACCCTTTATTTGCCCA-3’；

G-CPB1B-DRB2BF：

5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACGTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGT-3’，

G-CPB1B-DRB2BR：

5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGTTTGCAAAGAAGTTCTTTATGCAG-3;

G-CPB1B-GUSF：

5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACGTCACGCGCTATCAGCTCTTTAATC-3’，

G-CPB1B-GUSR：5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACT-3’；’

（2）扩增靶标基因序列

制备PCR扩增用模板，利用步骤（1）中所设计引物进行PCR扩增，DRB2基因片段以拟南芥cDNA为模板，而GUS基因片段扩增时则以pCAMBIA1300为模板；

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据试剂盒说明书分别对目的片段进行纯化回收预期大小的目的片段；

（3）构建同时沉默2个内源基因的VIGS病毒载体CPB1B-X（针对目标基因DRB2基因时，命名为：CPB1B-DRB2；针对外源参考基因GUS基因，命名为：CPB1B-GUS）

首先，用Kpn I对步骤（一）中所构建的病毒载体CPB1B进行单酶切，回收线性化酶切产物；

其次，采用Gibsob assembly试剂盒将上述回收的CPB1B的线性化酶切产物分别与步骤（2）中扩增的内源靶标基因序列进行连接；

最后，将连接产物转入感受态细胞后，随机选取Amp⁺ 的LB平板上形态正常的菌落进行质粒提取，酶切鉴定的阳性克隆再进行测序鉴定，确保重组构建正确，此即为可同时沉默2个基因的VIGS病毒载体CPB1B-X（也即，可同时沉默内源基因DRB2和PDS，作为参考对照，在转染外源基因GUS基因后，则相当于仅沉默了PDS基因）；

（4）检测VIGS病毒载体CPB1B-X沉默效果

将VIGS载体CPB1B-X（VIGS病毒载体CPB1B-DRB2为例）经Xba I单酶切线性化并进行纯化回收后，用Thermo Scientific的TranscriptAid T7 High Yield Transrciption Kit进行体外转录病毒；

用10ng/µl的转录病毒接种移栽后4周的拟南芥dcl2drb4突变体幼苗，每株接种3片叶，10 ul/片叶，在18℃、长日照16h/8h光周期条件下，对接种病毒后叶片进行表型观察和RT-PCR沉默效果检测。

对TCV研究后，发明人认为其具有如下特点：TCV为单链的正链RNA病毒，全长4054bp，没有5^’帽子和3^’多聚A尾，便于体外合成；并且TCV是研究最清楚的病毒之一，编码包括P28、P88、P38、P8和P9在内的5个蛋白5个基因的功能都已知道。而已有研究表明，TCV在模式植物拟南芥中的复制量很高，可产生大量的病毒RNA、双链RNA（dsRNA）和vsiRNA，因此便于检测；同时鉴于TCV编码的沉默抑制子已鉴定。因此，基于TCV开发设计同时沉默两个、甚至多个功能基因的VIGS载体是一种较为易于实现的途径。

总体而言，本申请构建双沉默基因的VIGS载体思路为：首先通过添加特定碱基使人工合成的2个PDS片段经变性、退火处理，最终形成了带有Kpn I粘性末端的双链DNA，因此可直接与经Kpn I酶切的TCV突变体CPB进行连接，从而构建获得含人工合成片段但仅保留一个Kpn I酶切位点的VIGS载体CPB1B；其次，在CPB1B载体中再次***另一段靶标基因序列获得了病毒载体CPB1B-X。具体检测验证时，借助体外转录进行摩擦接种拟南芥叶片后，不仅能诱导靶标基因沉默并且还能利用PDS基因被沉默后产生的白化现象作为指示剂，以判断病毒诱导的基因沉默是否发生。由于利用该载体对拟南芥内源靶标基因进行功能鉴定时，具有直观、快速、高通量、易操作等明显优势，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。同时该构建方法还为利用人工合成片段开发设计同时沉默两个、甚至多个功能基因的VIGS载体提供了较好借鉴和参考。

附图说明

图1为病毒载体CPB1B结构示意图；

图2为病毒载体CPB1B感染拟南芥突变体dcl4第21天表型观察；

图3为半定量RT-PCR检测病毒载体CPB1B感染拟南芥突变体dcl4沉默效果；

图4为病毒载体CPB1B-DRB2感染拟南芥突变体dcl2drb4第21天表型观察；

图5为半定量RT-PCR检测病毒载体CPB1B-DRB2感染拟南芥突变体dcl2drb4沉默效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。

实施例1

在现有VIGS载体CPB-CC-PDS的基础上，发明人设计并人工合成了44 bp的拟南芥PDS片段，因此本实施例首先就基于TCV高效沉默拟南芥PDS基因的病毒诱导沉默载体CPB1B的构建过程简介如下。

（一）靶标拟南芥PDS的基因片段设计和合成

首先，经生物信息学软件分析（https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder），分析确定现有病毒沉默载体CPB-CC-PDS中拟南芥八氢番茄红素脱氢酶基因（Phytoene desaturase，PDS）片段中可能产生的siRNA序列（如SEQ ID NO.1所示）为：5’-AAGATGGTTTATCAGTCAAAG-3’；

然后，人工合成包含该序列的44 bp的PDS基因片段PDS1-F，而为形成具有KpnI粘性末端的双链DNA，因此在3’端添加碱基“TAC”，从而形成反向互补序列PDS1-R(TAC)；

最终合成序列分别为：

PDS1-F：5’-CAAGATGGTTTATCAGTCAAAGAATGGATGGAAAAGCAGGGAGTAC-3’，

PDS1-R(TAC)：5’-TCCCTGCTTTTCCATCCATTCTTTGACTGATAAACCATCTTGGTAC-3’。

（二）构建病毒诱导沉默载体CPB1B

（1）人工合成片段的变性、退火处理

将人工合成片段PDS1-F和PDS1-R(TAC)等量混合后，进行变性、退火处理，从而获得带有Kpn I酶切位点的粘性末端的双链DNA；

20µl体系设计如下：

10 X T4 ligase buffer，2.0µl；

PDS1-F，1.0 µl (100 ng)；

PDS1-R(TAC)，1.0 µl (100 ng)；

ddH₂O，16µl

混匀后，变性退火程序如下：94℃、5 min，84℃、5 min，74℃、5 min，64℃、5 min，54℃、5 min，44℃、5 min，34℃、5 min，24℃、5 min，14℃、5 min。

（2）病毒载体CPB-CC单酶切及去磷酸化

为获得线性化的病毒载体CPB-CC，首先对病毒沉默功能抑制子功能减弱的TCV病毒载体CPB-CC进行Kpn I单酶切，然后再切胶、纯化回收线性化产物，并根据FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase产品说明(赛默飞世尔科技)进行去磷酸化，最后再过柱回收纯化后产物。

Kpn I酶切时，30.0μL酶切体系设计如下：

10×Buffer，3.0μL；

Kpn I，1.0μL；

CPB-CC，20.0μL (约1.5 μg )；

ddH₂O，6.0μL；

37℃酶切2小时，

（3）目的基因片段与病毒载体CPB-CC连接反应

利用 T4 ligase，将步骤（1）中获得的变性退火产物与步骤（2）获得的去磷酸化质粒进行连接，10µl连接体系设计如下：

10 x T4 ligase buffer (NEB)，0.75 μL；

Ligase，1 μL；

CPB-CC酶切产物，2.0 μL(100 ng)；

annealed PCR products（步骤（1）中变性、退火处理后产物），2.5 μL；

ddH₂O，3.75 μL；

16℃连接过夜。

（4）转化、筛选获得重组载体

取步骤（3）中5μL连接产物，热击转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在氨苄青霉素(50mg/L)的LB培养基上进行重组子的筛选，挑取阳性克隆进行酶切鉴定和测序验证，对构建正确的质粒命名为CPB1B。

病毒载体CPB1B结构示意图如图1所示。

（三）检测VIGS病毒载体CPB1B沉默效果

为检测所构建的VIGS载体沉默拟南芥PDS基因的效果，发明人进一步进行了实验检测。具体过程简介如下。

（1）病毒体外转录

将所构建的病毒载体CPB1B经Xba I单酶切线性化后，纯化回收，根据ThermoScientific的TranscriptAid T7 High Yield Transrciption Kit试剂盒说明书，设计20.0μL体系进行病毒体外转录，具体20.0μL体系设计如下：

5X transcripts aid buffer，4μL；

Transcript Aid Enzyme Mix，2μL；

ATP/CTP/GTP/UTP mix，2 μL；

CPB1B酶切回收产物，1μL（约1μg）；

DEPC-treated water，2μL；

37℃ 温浴2 h。

（2）病毒接种

将步骤（1）中体外转录产物用接种缓冲液（接种缓冲液的配制：50 mM Glycine；30 mMK₂HPO₄ (pH 9.2)；1% Bentonite；1% celite）稀释成10ng/µl，采用摩擦接种法接种移栽4周后的拟南芥dcl4突变体幼苗，每株接种3片叶，10 ul/片叶。

接种后在黑暗条件下保湿过夜，然后移至人工气候箱中培养，控制培养温度为18℃，空气湿度约为60%，采用长日照16h/8h光周期条件。定期进行表型观察。

感染后第21天表型如图2所示，可以看出，CPB1B病毒有效沉默拟南芥内源PDS基因，产生了明显白化现象。

（3）沉默效果的半定量RT-PCR检测

采集病毒感染第13天的1厘米左右的上部未接种的叶片进行RNA提取，并反转录为cDNA（相关操作可参考： 《TRNzol Universal Reagent总RNA提取试剂（TianGen）》、《FastKingcDNA第一链合成试剂盒（TianGen）》的说明书），以Actin基因作物内标基因，对靶标基因PDS进行半定量PCR检测，检测时，PCR扩增用引物序列设计如下：

AT-Actin1-443F：5’-GTCGTACTACCGGTATTGTGC-3’，

AT-Actin1-618R：5’-TGCTGTGGTGGTGAAAGAGT-3’；

AtPDS-604F：5’-GGTATTTGGGCTATTTTGCG-3’，

AtPDS-757R：5’-CTCCCTGCTTTTCCATCCA-3’。

半定量检测结果如图3所示，可以看出，拟南芥dcl4突变体感染病毒CPB1B后内源PDS基因表达量比对照明显降低，与观察植物产生白化现象的表型一致。

实施例2

在实施例1基础上，以100 bp左右的2段拟南芥双链结合蛋白2序列（Double strandRNA binding protein 2, DRB2）作为内源目标基因“X”序列，作为对照，以拟南芥外源GUS基因转染作为参考对照，发明人进一步构建了VIGS载体CPB1B-DRB2A、CPB1B-DRB2B和CPB1B-GUSA，本实施例就相关过程简要介绍说明如下。

（一）靶标基因序列选择及引物设计

首先，确定针对目标基因序列分析的合适siRNA靶序列，然后设计PCR扩增用引物。

最终确定的靶向序列为：

DRB2A序列（102bp，如SEQ ID NO.2所示）：

TTTCCAAGGCTGCTGCCATAATTCTGTCAATACCGGAAGTTGCTGCTAAGGATGATCTGCTGCTTCTGGAAGGTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGTAAGATTC

DRB2B序列（100bp，如SEQ ID NO.3所示）

GTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGTAAGATTCTCGATGTGGTTGCAGGAGAAGGCTGTGGACTTGTTGGTCTAAGGTTCTGCATAAAGAACTTCTTTGCAAA

GUS序列（100bp）：

GTCACGCGCTATCAGCTCTTTAATCGCCTGTAAGTGCGCTTGCTGAGTTTCCCCGTTGACTGCCTCTTCGCTGTACAGTTCTTTCGGCTTGTTGCCCGCT。

需要说明的是，引物设计时，为便于利用Gibson Assembly试剂盒进行无缝连接，在正反引物的5’端均添加了载体CPB1B酶切位点KpnI两侧的序列，因此，最终引物序列设计为：

G-CPB1B-GUSF：

5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACGTCACGCGCTATCAGCTCTTTAATC-3’，

G-CPB1B-GUSR：5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACT-3’；

G-CPB1B-DRB2AF：

5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACTTTCCAAGGCTGCTGCCATAATTC-3’，

G-CPB1B-DRB2AR：

5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGGAATCTTACCCTTTATTTGCCCA-3’；

G-CPB1B-DRB2BF：

5’-TTGACTGATAAACCATCTTGGTACGTTGTTTTGGGCAAATAAAGGGT-3’，

G-CPB1B-DRB2BR：

5’-CTAAGATGAGAAGACTACACTATGTTTGCAAAGAAGTTCTTTATGCAG-3’。

（二）扩增靶标基因序列

以拟南芥cDNA或pCAMBIA1300为模板，分别利用步骤（1）中所设计引物进行PCR扩增；PCR扩增时，50μL扩增体系设计如下：

10 X Buffer，5μL；

dNTP Mix (2.5 each)，5μL；

正向引物，10μM、1μL；

反向引物，10μM、1μL；

Polymerase，2.5U/μL、1.0μL；

DNA模板，1μL (50 ng)；

ddH₂O加至50μL。

利用PCR仪（美国赛默飞世尔Arktik 多功能PCR仪）进行扩增，扩增程序为：95℃、3min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、5min。

PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，对目的片段进行纯化回收预期大小的目的片段。

（三）构建同时沉默拟南芥2个基因的病毒诱导沉默载体CPB1B-DRB2A、CPB1B-DRB2B和对照载体CPB1B-GUSA

首先，用Kpn I对步骤（一）中所构建的病毒载体CPB1B进行单酶切，回收线性化酶切产物；

其次，采用Gibsob assembly试剂盒将上述回收的CPB1B的线性化酶切产物与扩增的内源靶标基因序列进行连接；

最后，将连接产物转入感受态细胞后，随机选取Amp⁺ 的LB平板上形态正常的菌落进行质粒提取，酶切鉴定的阳性克隆再进行测序鉴定，确保重组构建正确。（具体操作可参考实施例1中相关操作）

将最终测序验证的构建正确的质粒分别命名为：CPB1B-DRB2A和CPB1B-DRB2B（这两个质粒用来同时沉默2个内源基因DRB2和PDS）、CPB1B-GUSA（这个质粒用来仅沉默内源基因PDS，而转入的外源GUS基因作物对照）；

（四）检测VIGS病毒载体CPB1B-X沉默效果及半定量RT-PCR检测

将VIGS载体CPB1B-X经Xba I单酶切线性化并进行纯化回收后，用Thermo Scientific的TranscriptAid T7 High Yield Transrciption Kit进行体外转录病毒；

用10ng/µl的转录病毒接种移栽4周后的拟南芥dcl2drb4突变体幼苗，每株接种3片叶，10 ul/片叶，在18℃、长日照16h/8h光周期条件下，对接种病毒后叶片进行表型观察和RT-PCR沉默效果检测。

感染后第21天表型如图4所示，可以看出，病毒CPB1B-GUSA、CPB1B-DRB2A和CPB1B-DRB2B均能有效沉默拟南芥内源PDS基因产生白化现象。

半定量PCR检测时，同样以Actin作为内参基因（PDS和Actin的扩增引物与实施例1相同，具体操作可参考实施例1中相关操作），PCR检测时，针对DRB2的PCR的扩增引物设计如下：

DRB2-714F: 5’-AAGCAGCAGATCATCCTTAGCAGCA-3’，

DRB2-1181R: 5’-CTTCCTTCTACTCCAATTTCAAGAC-3’。

半定量结果如图5所示，可以看出：拟南芥dcl2drb4双突变体感染病毒CPB1B-GUSA、CPB1B-DRB2A和CPB1B-DRB2B后内源PDS基因表达量比对照明显降低，与观察植物产生白化现象的表型一致，并且***拟南芥外源基因GUS片段的病毒载体CPB1B-GUSA感染的植株DRB2的表达量与仅接种缓冲液的Mock对照基本一致，但感染***拟南芥内源基因DRB2片段的病毒CPB1B-DRB2A和CPB1B-DRB2B的植株DRB2表达量明显降低。以上结果说明CPB1B在***1个内源基因DRB2片段后构建的VIGS载体CPB1B-DRB2A、2B能同时沉默拟南芥的2个内源基因PDS和DRB2。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 基于TCV的同时沉默2个内源基因的VIGS载体

<130> none

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 1

aagatggttt atcagtcaaa g 21

<210> 2

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

tttccaaggc tgctgccata attctgtcaa taccggaagt tgctgctaag gatgatctgc 60

tgcttctgga aggttgtttt gggcaaataa agggtaagat tc 102

<210> 3

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 3

gttgttttgg gcaaataaag ggtaagattc tcgatgtggt tgcaggagaa ggctgtggac 60

ttgttggtct aaggttctgc ataaagaact tctttgcaaa 100