阅读说明：本技术 鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法 (Analysis method of deer fetus oligopeptide for immunoregulation of macrophage ) 是由 张辉 张凯月 吴楠 杜延佳 李志成 李晶峰 边学峰 吕金朋 兰梦 高旭 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法,属于生物技术研发分析技术领域,筛选出鹿胎寡肽作用后RAW264.7细胞的增殖指数较空白比明显升高,且与LPS阳性对照组最为接近；本发明方法分析了不同质量浓度对吞噬功能、NO分泌量和细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的释放的影响,获得结果显示,在25μg/mL时,NO有最大的释放量,且与LPS组最为接近；本发明方法中同时进行细胞周期检查,数据结果证明,随着鹿胎寡肽质量浓度的增长,G0/G1期细胞比例呈先上升后下降趋势,S期与G2/M期的细胞比例呈先下降后上升趋势,在25μg/mL时,细胞各时期比例与LPS组最为接近；G0/G1为RNA和蛋白质的合成期,因此相关蛋白的表达量增加,所以吞噬作用、NO及细胞因子的分泌能力在此时期分泌量达最大值。(An analysis method for immunoregulation of macrophage by deer fetus oligopeptide belongs to the technical field of biotechnology research and development analysis, and the proliferation index of RAW264.7 cells after the deer fetus oligopeptide is screened out to act is obviously increased compared with blank ratio and is most similar to an LPS positive control group; the method analyzes the influence of different mass concentrations on the phagocytic function, the NO secretion amount and the release of cell factors such as IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha, and the obtained result shows that the NO has the maximum release amount at 25 mu g/mL and is closest to an LPS group; the cell cycle examination is carried out simultaneously in the method, and data results prove that along with the increase of the mass concentration of the deer fetus oligopeptide, the proportion of cells in the G0/G1 phase is in the trend of rising firstly and then falling, the proportion of cells in the S phase and the G2/M phase is in the trend of falling firstly and then rising, and when the proportion of the cells in each phase is closest to that of an LPS group at 25 mu G/mL; G0/G1 is the synthesis phase of RNA and protein, so the expression level of related protein is increased, and the secretion capacity of phagocytosis, NO and cytokines reaches the maximum value in the phase.)

鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法

技术领域

本发明属于生物技术研发分析技术领域，特别是涉及到鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法。

背景技术

鹿胎为鹿科动物梅花鹿(Cervus nippon Temminck)或马鹿(Cervus elaphusLinnacus)的胎盘和胎兽。鹿胎是我国一种传统名贵的滋补品，古时被誉为“妇科三宝”(鹿胎、乌鸡、阿胶)之一。鹿胎作为中药治疗疾病已有很长历史，其药理作用首先载于《本草纲目》。鹿胎，调经养颜，解诸毒。中医认为：鹿胎主治肾虚阳痿，滋补不足，适用于肾虚，无力，血液不足，女性***，子宫出血等。鹿胎化学成分多样，以氨基酸、维生素、肽类成分为主。其中，寡肽成分易吸收，活性高等优点，已被广泛关注。

免疫系统是机体发挥免疫应答作用的重要系统，可防卫病原体入侵机体，它能发现引起内环境紊乱的外来异物和病原微生物等。其中，巨噬细胞作为机体最重要的吞噬细胞，是病原微生物进入机体的第一道防线，发挥免疫功能，具有吞噬、表达相应抗原递呈分子、分泌多种细胞因子等功能，在机体广泛参与清除病原微生物与衰老细胞，发挥免疫调节作用，以维持机体内环境的稳态，在天然免疫中起重要作用。现代研究表明，胎盘中含有多种活性成分，如生物活性肽、免疫球蛋白、氨基酸、矿物质等其他成分，是一种较为理想的免疫调节剂，其作用机制为通过调控巨噬细胞吞噬和抗原递呈功能以及相关细胞因子的表达，从而参与巨噬细胞免疫应答反应。另有研究表明，生物活性肽类成分在免疫调节及抗氧化等方面表现出了重要的生理活性。但现有技术中鹿胎寡肽对巨噬细胞RAW264.7免疫调节的研究尚未开展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法，采用超滤法提取鹿胎肽，将各超滤组分通过噻唑蓝MTT实验检测各肽段的增殖活性，通过选用中性红吞噬实验，酶联免疫吸附检测法检查鹿胎肽对免疫功能的影响，通过细胞周期实验保证实验结果的准确性，进而验证不同鹿胎超滤组分对免疫调节的作用。

鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、制备上清液

取鹿胎生品40g，粉碎至粒径为60目，取鹿胎生品质量10倍～30倍量的蒸馏水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的条件下，搅拌1次～3次，每次持续6小时～8小时，转速为3600r/min，离心10分钟～30分钟后，取上清液；

步骤二、制备冻干粉

将步骤一获得的上清液经过双层滤油纸滤取后再经过0.45μm滤膜微滤、1KDa、3KDa、10KDa超滤膜超滤，采用超滤分离纯化方法获得分子总提液DFP-1、质量大于10KDa的鹿胎蛋白DFP-2、分子质量3KDa～10KDa鹿胎多肽DFP-3、分子质量1KDa～3KDa鹿胎多肽DFP-4、分子质量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5，冻干后取冻干粉备用；

步骤三、建立蛋白质标准曲线

精密称定1.0mg牛血清白蛋白于10mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容至刻度，获得浓度为0.1mg/mL的BSA标准溶液；

分别吸取BSA标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，各管用蒸馏水补足至1.0mL，以空白管调零，每管加入5mL考马斯亮蓝试剂，涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值；

以牛血清白蛋白标准溶液在每管中的蛋白浓度μg/mL为横坐标x，以测得吸光度值为纵坐标Y作线性回归，获得测定蛋白质含量的标准曲线回归方程；

步骤四、样品溶液测定

取步骤二获得的冻干粉各1mg，加入1mL蒸馏水，配置1mg/mL样品溶液，吸取1mL加入5mL考马斯亮蓝试剂，涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值；

步骤五、测定细胞增殖指数

取对数生长期RAW264.7细胞以10⁵个/孔置于96孔细胞培养板，每孔150μL，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入步骤二获得的冻干粉配置成100μg/mL的溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL脂多糖LPS150μL，每组5个复孔；在37℃、5％CO₂条件下分别培养12h、24h、48h，弃去上清液，每孔加入5mg/mL的MTT噻唑蓝溶液10μL，4h后加入DMSO二甲基亚砜150μL，振荡5min，于490nm波长处测其透光度OD值，获得细胞增殖指数；

步骤六、测定鹿胎寡肽DFP-5药物刺激下细胞增殖指数

在DMEM高糖培养基中分别加入步骤二所得的分子质量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5冻干粉配置成6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL LPS细菌脂多糖150μL，每组5个复孔；在37℃、5％CO₂条件下培养24h，弃掉培养上清液，每孔加入5mg/mL的MTT噻唑蓝溶液10μL，4h后加入DMSO二甲基亚砜150μL，振荡5min，于490nm波长处测其透光度OD值，获得细胞增殖指数；

步骤七、测定细胞吞噬指数

取对数生长期RAW264.7细胞以10⁵个/孔，每孔150μL于96孔板中，37℃、5％CO₂培养箱孵育24h后，弃去培养液，并给予质量浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿胎寡肽DFP-5药物刺激，每组5个复孔，同时设定LPS细菌脂多糖组和空白组，孵育24h，吸出上清液，聚丁二酸丁二醇酯PBS洗涤2次，随后加入200μL细胞培养液，同时加入中性红染液20μL，孵育2h；除去含有中性红染液的细胞培养液，聚丁二酸丁二醇酯PBS洗涤1次，于每孔加入中性红检测裂解液200μL，室温摇床上裂解10min；于540nm波长处测定透光度OD值，获取细胞吞噬指数；

步骤八、测定鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞的细胞因子释放的影响

将对数生长期RAW264.7细胞接种于96孔培养板，每孔体积200μL，密度为10⁵个/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的DFP-5样品溶液150μL，设定空白组和LPS细菌脂多糖组，每组5个复孔，于37℃、5％CO₂条件下培养24h后，取上清液150μL，按各试剂盒说明书测定NO分泌量、IL-1β分泌量、IL-6分泌量以及TFN-α分泌量；

步骤九、测定鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞周期的影响

RAW264.7细胞浓度为10⁵个/mL，每孔2mL接种于6孔板中，24h后吸出培养液，分别加入质量浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿胎寡肽DFP-5，同时设置LPS细菌脂多糖组和空白组，继续孵育，收集样本细胞，细胞数量约为6×10⁶个，用冷聚丁二酸丁二醇酯PBS洗涤2次，吹散细胞至15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用500μL聚丁二酸丁二醇酯PBS重悬细胞，滴加3mL 75％冷乙醇，放入-20℃固定1h，离心，500μL冷聚丁二酸丁二醇酯PBS重悬细胞，加RnaseA核酸内切酶溶液20μL，37℃水浴30min，离心10min，弃上清，加入荧光染料PI染液400μL，混匀后4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测其结果；

结果以

表示，其中，x代表均值，s代表标准偏差，采用SPSS19.0统计学软件进行配对t检验、单因素方差分析，结果为p＜0.01和p＜0.05有统计学差异，其中，p代表显著性。

所述步骤三和步骤四中考马斯亮蓝试剂的调配方法为，称取50mg的考马斯亮蓝G-250，以25mL的95％乙醇溶解，再加入50mL的85％磷酸摇匀后，以蒸馏水定容至50mL的棕色瓶内，获得考马斯亮蓝试剂备用。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法，筛选出鹿胎寡肽作用后RAW264.7细胞的增殖指数较空白比明显升高，且与LPS阳性对照组最为接近；

进一步的，为了验证鹿胎寡肽对免疫调节作用的影响，本发明方法分析了不同质量浓度对吞噬功能、NO分泌量和细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的释放的影响，获得结果显示，在25μg/mL时，NO有最大的释放量，且与LPS组最为接近；

鹿胎寡肽作用24h后，RAW264.7细胞因子的分泌功能明显的增大，当浓度为25μg/mL时，细胞各因子水平接近于LPS组，证明鹿胎寡肽具有增强细胞因子分泌的作用；

本发明方法中同时进行细胞周期检查，数据结果证明，随着鹿胎寡肽质量浓度的增长，G0/G1期细胞比例呈先上升后下降趋势，S期与G2/M期的细胞比例呈先下降后上升趋势，在25μg/mL时，细胞各时期比例与LPS组最为接近；G0/G1为RNA和蛋白质的合成期，因此相关蛋白的表达量增加，所以吞噬作用、NO及细胞因子的分泌能力在此时期分泌量达最大值。

附图说明

以下结合附图和

具体实施方式

对本发明作进一步的说明：

图1为本发明步骤三获得的牛虚情白蛋白标准曲线图。

图2为本发明步骤六获得的鹿胎寡肽DFP-5各质量浓度对RAW264.7细胞增殖能力的影响柱形图。

图3为本发明步骤七获得的鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞吞噬能力的影响示意图。

图4为本发明步骤八获得的鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞NO分泌量的影响示意图。

图5为本发明步骤八获得的鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞IL-1β分泌量的影响示意图。

图6为本发明步骤八获得的鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞IL-6分泌量的影响示意图。

图7为本发明步骤八获得的鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞TFN-α分泌量的影响示意图。

图8为本发明步骤九获得的RAW264.7细胞周期的变化示意图。

图9为本发明步骤九获得的RAW264.7细胞周期的影响示意柱状图。

具体实施方式

鹿胎寡肽对巨噬细胞免疫调节的分析方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、制备上清液

取鹿胎生品40g，粉碎至粒径为60目，取鹿胎生品质量10倍～30倍量的蒸馏水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的条件下，搅拌1次～3次，每次持续6小时～8小时，转速为3600r/min，离心10分钟～30分钟后，取上清液；

步骤二、制备冻干粉

将步骤一获得的上清液经过双层滤油纸滤取后再经过0.45μm滤膜微滤、1KDa、3KDa、10KDa超滤膜超滤，采用超滤分离纯化方法获得分子总提液DFP-1、质量大于10KDa的鹿胎蛋白DFP-2、分子质量3KDa～10KDa鹿胎多肽DFP-3、分子质量1KDa～3KDa鹿胎多肽DFP-4、分子质量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5，冻干后取冻干粉备用；

步骤三、建立蛋白质标准曲线

精密称定1.0mg牛血清白蛋白于10mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并定容至刻度，获得浓度为0.1mg/mL的BSA标准溶液；

分别吸取BSA标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，各管用蒸馏水补足至1.0mL，以空白管调零，每管加入5mL考马斯亮蓝试剂，涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值；

以牛血清白蛋白标准溶液在每管中的蛋白浓度μg/mL为横坐标x，以测得吸光度值为纵坐标Y作线性回归，获得测定蛋白质含量的标准曲线回归方程；

其中，考马斯亮蓝试剂的调配方法为，称取50mg的考马斯亮蓝G-250，以25mL的95％乙醇溶解，再加入50mL的85％磷酸摇匀后，以蒸馏水定容至50mL的棕色瓶内，获得考马斯亮蓝试剂备用；

步骤四、样品溶液测定

取步骤二获得的冻干粉各1mg，加入1mL蒸馏水，配置1mg/mL样品溶液，吸取1mL加入5mL考马斯亮蓝试剂，涡旋混匀，室温反应5min，于5min～20min之间595nm处测吸光度值；

步骤五、测定细胞增殖指数

取对数生长期RAW264.7细胞以10⁵个/孔置于96孔细胞培养板，每孔150μL，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入步骤二获得的冻干粉配置成100μg/mL的溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL脂多糖LPS150μL，每组5个复孔；在37℃、5％CO₂条件下分别培养12h、24h、48h，弃去上清液，每孔加入5mg/mL的MTT噻唑蓝溶液10μL，4h后加入DMSO二甲基亚砜150μL，振荡5min，于490nm波长处测其透光度OD值，获得细胞增殖指数；

步骤六、测定鹿胎寡肽DFP-5药物刺激下细胞增殖指数

在DMEM高糖培养基中分别加入步骤二所得的分子质量小于1KDa鹿胎寡肽DFP-5冻干粉配置成6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL溶液150μL，空白对照组为150μL含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照组为10μg/mL LPS细菌脂多糖150μL，每组5个复孔；在37℃、5％CO₂条件下培养24h，弃掉培养上清液，每孔加入5mg/mL的MTT噻唑蓝溶液10μL，4h后加入DMSO二甲基亚砜150μL，振荡5min，于490nm波长处测其透光度OD值，获得细胞增殖指数；

步骤七、测定细胞吞噬指数

取对数生长期RAW264.7细胞以10⁵个/孔，每孔150μL于96孔板中，37℃、5％CO₂培养箱孵育24h后，弃去培养液，并给予质量浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿胎寡肽DFP-5药物刺激，每组5个复孔，同时设定LPS细菌脂多糖组和空白组，孵育24h，吸出上清液，聚丁二酸丁二醇酯PBS洗涤2次，随后加入200μL细胞培养液，同时加入中性红染液20μL，孵育2h；除去含有中性红染液的细胞培养液，聚丁二酸丁二醇酯PBS洗涤1次，于每孔加入中性红检测裂解液200μL，室温摇床上裂解10min；于540nm波长处测定透光度OD值，获取细胞吞噬指数；

步骤八、测定鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞的细胞因子释放的影响

将对数生长期RAW264.7细胞接种于96孔培养板，每孔体积200μL，密度为10⁵个/孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去上清液，分别加入12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的DFP-5样品溶液150μL，设定空白组和LPS细菌脂多糖组，每组5个复孔，于37℃、5％CO₂条件下培养24h后，取上清液150μL，按各试剂盒说明书测定NO分泌量、IL-1β分泌量、IL-6分泌量以及TFN-α分泌量；

具体操作步骤为：

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

2.加祥：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

7.显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

8.终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行；

步骤九、测定鹿胎寡肽DFP-5对RAW264.7细胞周期的影响

RAW264.7细胞浓度为10⁵个/mL，每孔2mL接种于6孔板中，24h后吸出培养液，分别加入质量浓度为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的鹿胎寡肽DFP-5，同时设置LPS细菌脂多糖组和空白组，继续孵育，收集样本细胞，细胞数量约为6×10⁶个，用冷聚丁二酸丁二醇酯PBS洗涤2次，吹散细胞至15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用500μL聚丁二酸丁二醇酯PBS重悬细胞，滴加3mL 75％冷乙醇，放入-20℃固定1h，离心，500μL冷聚丁二酸丁二醇酯PBS重悬细胞，加RnaseA核酸内切酶溶液20μL，37℃水浴30min，离心10min，弃上清，加入荧光染料PI染液400μL，轻轻混匀后4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测其结果；

结果以

(x代表均值，s代表标准偏差)表示，采用SPSS19.0统计学软件进行配对t检验、单因素方差分析，结果为p＜0.01和p＜0.05(p代表显著性)有统计学差异。

实施例一、

取鹿胎生品40g，进行粉碎至粒径为60目，取鹿胎生品质量10倍量的蒸馏水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的条件下，搅拌1次，每次持续6小时，转速为3600r/min，离心10分钟后，取上清液。得率为0.139％。

实施例二、

取鹿胎生品40g，进行粉碎至粒径为60目，取鹿胎生品质量20倍量的蒸馏水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的条件下，搅拌2次，每次持续7小时，转速为3600r/min，离心20分钟后，取上清液。得率为0.274％。

实施例三、

取鹿胎生品40g，进行粉碎至粒径为60目，取鹿胎生品质量25倍量的蒸馏水，添加至粉碎后鹿胎生品中，在4℃的条件下，搅拌3次，每次持续8小时，转速为3600r/min，离心30分钟后，取上清液。得率为0.436％。

实施例四、鹿胎寡肽对巨噬细胞RAW264.7免疫调节研究

(1)鹿胎肽蛋白含量测定

以牛血清白蛋白质量浓度(X)为横坐标，以吸光度OD值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线如图1。经公式计算得DFP-1、DFP-2、DFP-3、DFP-4、DFP-5溶液的蛋白含量分别为0.4326mg/mL、0.2914mg/mL、0.3160mg/mL、0.3926mg/mL、0.3460mg/mL。

(2)不同超滤组分对RAW264.7细胞的增殖作用

DFP各超滤组分对RAW264.7细胞的增殖均一定的促进作用；当RAW264.7细胞培养12h后，DFP-1、DFP-2、DFP-3组分对RAW264.7细胞增殖的促进作用具有显著性差异(p＜0.05)，DFP-4、DFP-5组分对RAW264.7细胞的促进作用具有极显著性差异(p＜0.01)。当RAW264.7细胞培养24、48h后，5种样品与空白组相比均有极显著性差异，培养时间在24h时，各组分的增殖能力最强，故后续细胞培养时间均为24h，且DFP-5组分对RAW264.7细胞的增殖作用与阳性最为接近，因此选择DFP-5做进一步研究。

表1不同超滤组分对RAW264.7细胞的增殖作用(n＝5)

注：*代表同一时间(表中同一行)不同样品与空白组之间的显著性差异。其中，*代表差异显著(p＜0.05)，**代表差异极显著(p＜0.01)。

(3)DFP-5不同质量浓度对RAW264.7细胞的增殖作用

LPS和DFP-5均能促进RAW264.7细胞的增殖，在质量浓度为6.25μg/mL～400μg/mL的范围内，RAW264.7细胞的增值指数呈先上升后下降的趋势。当DFP-5质量浓度为12.5μg/mL、200μg/mL时，对RAW264.7细胞增殖影响显著(p＜0.05)；当DFP-5质量浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL时，对RAW264.7细胞增殖的影响极显著(p＜0.01)，且25μg/mL质量浓度时增殖指数最大为1.95±0.09。如图2所示，图中与空白组相比，*代表差异显著(p＜0.05)，**代表差异极显著(p＜0.01)。随着DFP-5质量浓度的继续增加，增殖指数开始骤降，当质量浓度升至400μg/mL时，与空白对照组相比，DFP-5对RAW264.7细胞增殖的影响已无统计学意义，故选择12.5μg/mL～200μg/mL DFP-5进行免疫调节机制的进一步研究。

(4)中性红吞噬实验结果

LPS组和DFP-5均能显著增强RAW264.7细胞的吞噬能力，且随着质量浓度的增加，对RAW264.7细胞吞噬能力的刺激作用呈先上升后下降的趋势。如图3所示，图中与空白组相比，*代表差异显著(p＜0.05)，**代表差异极显著(p＜0.01)。当质量浓度增至25μg/mL时，吞噬指数达到1.87±0.12，表明DFP-5能有效激活RAW264.7细胞发挥吞噬作用。

(5)DFP-5对RAW264.7细胞NO分泌量的影响

DFP-5对RAW264.7细胞NO分泌量的刺激作用与剂量相关，DFP-5质量浓度为25μg/mL时，细胞NO的分泌量达最大值，为21.57±1.8μmol/L；如图4所示，图中与空白组相比，*代表差异显著(p＜0.05)，**代表差异极显著(p＜0.01)。DFP-5各质量浓度对细胞活性物质NO分泌量均具有极显著性差异(p＜0.01)，但弱于LPS组。

(6)DFP-5对RAW264.7细胞的细胞因子释放的影响

DFP-5对RAW264.7细胞中细胞因子分泌量的影响与剂量呈相关性。如图5～图7所示，图中与空白组相比，*代表差异显著(p＜0.05)，**代表差异极显著(p＜0.01)。经25μg/mL DFP-5处理后，细胞因子白介素IL-1β、白介素IL-6和肿瘤因子TNF-α的分泌量与空白组相比均有极显著性作用(p＜0.01)，且其各因子的分泌量最高，趋近于阳性对照组。

(7)DFP-5对RAW264.7细胞周期的影响

由图8和图9所示，与空白组相比，经DFP-5处理24h后，G0/G1期的细胞比例呈先上升后下降的趋势，处于S期及G2/M期的细胞与总细胞数中的占比呈先下降后上升的趋势。当DFP-5质量浓度达到25μg/mL时，各时期的变化趋势与LPS组最接近。