基于稳定同位素半胱氨酸代谢标记的棕榈酰化修饰蛋白质定量分析方法
阅读说明：本技术 基于稳定同位素半胱氨酸代谢标记的棕榈酰化修饰蛋白质定量分析方法 (Palmitoylation modified protein quantitative analysis method based on stable isotope cysteine metabolic labeling ) 是由 陆豪杰 张晓勤 方彩云 于 2018-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物分析技术领域,涉及一种基于稳定同位素半胱氨酸代谢标记的棕榈酰化修饰蛋白质定量分析方法。本发明采用含重标稳定同位素半胱氨酸的培养基培养细胞,使细胞蛋白质中的半胱氨酸被重标半胱氨酸完全替代,将不同细胞分别培养在含轻、重标半胱氨酸的培养基中,蛋白质提取混合,采用固相载体选择性富集,色谱-质谱分离分析后,可定量分析不同细胞中的棕榈酰化修饰蛋白质。与现有的定量分析方法相比,本方法可减少因繁冗的并行操作带来的误差,以及减少样本的复杂性,简化谱图；促进低丰度蛋白的准确定量；可用于定量分析包括C末端肽段在内的所有潜在的棕榈酰化修饰位点,本方法适用于所有的细胞样品。(The invention belongs to the technical field of biological analysis, and relates to a palmitoylation modified protein quantitative analysis method based on stable isotope cysteine metabolic labeling. The invention adopts a culture medium containing heavy-mark stable isotope cysteine to culture cells, so that the cysteine in cell protein is completely replaced by the heavy-mark cysteine, different cells are respectively cultured in the culture medium containing light-mark cysteine and heavy-mark cysteine, the protein is extracted and mixed, the palmitoylation modified protein in different cells can be quantitatively analyzed after the selective enrichment by a solid phase carrier and the chromatographic-mass spectrometry separation and analysis. Compared with the existing quantitative analysis method, the method can reduce errors caused by complicated parallel operation, reduce the complexity of samples and simplify spectrograms; accurate quantification of low-abundance proteins is facilitated; can be used for quantitative analysis of all potential palmitoylation modification sites including C-terminal peptide fragments, and the method is suitable for all cell samples.)
技术领域
本发明属于生化分析技术领域，涉及一种定量分析细胞中棕榈酰化修饰蛋白质/肽段的方法，尤其涉及一种基于稳定半胱氨酸同位素代谢标记细胞的的棕榈酰化修饰蛋白质定量分析方法，该方法中利用含有轻/重稳定同位素标记的半胱氨酸培养基培养细胞后，用质谱分析定量检测细胞样品中棕榈酰化修饰蛋白质/肽段的表达水平。
背景技术
现有技术公开了棕榈酰化修饰是一类在生物体内广泛发生的蛋白质翻译后脂质修饰，也是重要的翻译后修饰之一，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中起着重要的作用。棕榈酰化修饰通常是指含有16个碳的饱和棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys的巯基上；棕榈酰化修饰通常发生在中低丰度的蛋白质上，分析难度大，故需先选择性富集后再利用质谱进行定性和定量分析。现有技术中选择性富集棕榈酰化修饰蛋白质/肽段的方法主要有两类，如“以半胱氨酸为中心”和“以棕榈酰为中心”的方法；常用的定量方法有非标记定量、以稳定同位素精氨酸R和/或赖氨酸K为质量标签的定量方法SILAC、ICAT和iodoTMT等；现有定量分析方法大多为化学标记技术，且通常在样品处理过程中甚至是最后一步对肽段进行标记，而样品处理过程步骤繁多，极易造成较大的实验误差；即使是现有的代谢标记技术SILAC，由于定量标签在K/R上，使得一级质谱图中峰成倍增加，不利于低丰度棕榈酰化蛋白质的准确定量，且不能定量分析无K/R但含Cys修饰位点的肽段(如C-末端肽段)等等。
针对现有定量方法中的不足，本申请的发明人拟提供一种新的定量分析细胞中棕榈酰化修饰蛋白质/肽段的方法，本申请利用棕榈酰化修饰发生于半胱氨酸上的特点，以含有稳定同位素半胱氨酸的培养基进行细胞培养，在细胞培养的过程中引入质量标签，使不同的样品在实验初始即可混合在一起进行样品处理、富集和分析，减少了繁冗的并行操作带来的误差，有利于得到更加准确的定量结果；同时，由于半胱氨酸既为修饰位点，又含定量标签，因此可定量分析所有潜在的棕榈酰化修饰位点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术方法中的不足，提供一种新的定量分析蛋白质棕榈酰化修饰水平的方法，具体涉及一种基于稳定同位素半胱氨酸代谢标记培养细胞结合质谱技术定量分析蛋白质棕榈酰化修饰的方法。
具体的，本发明提供了一种基于稳定同位素半胱氨酸代谢标记的棕榈酰化修饰蛋白质定量分析方法，以含有稳定同位素半胱氨酸的培养基进行细胞培养，在细胞培养的过程中引入质量标签，使不同的样品在实验初始即可混合在一起进行样品处理、富集和分析，减少了繁冗的并行操作带来的误差，有利于得到更加准确的定量结果；同时，由于半胱氨酸既为修饰位点，又含定量标签，因此可定量分析所有潜在的棕榈酰化修饰位点。
本发明中，通过使用含轻、重稳定同位素半胱氨酸的培养基对具有不同转移潜能的肝癌细胞系进行培养，提取蛋白质按照1∶1混合后，选择性富集样品中的棕榈酰化修饰肽段/蛋白质，结合质谱精密分析的特点，能实现对具有不同转移潜能的肝癌细胞中棕榈酰化修饰水平的定量分析，并获得差异蛋白质的信息。
本发明的定量方法中，首先用含有轻、重稳定同位素半胱氨酸的培养基进行细胞培养，收集细胞蛋白质，富集棕榈酰化修饰蛋白质后再进行质谱检测。
本发明中以半胱氨酸为质量标签可定量分析蛋白质中所有潜在的棕榈酰化修饰肽段(含C-末端肽段)，是经典的SILAC方法(以赖氨酸K和/或精氨酸R为质量标签)的有利补充。
本发明中，所建立的方法可以用于定性和定量分析包括上述具有不同转移潜能的肝癌细胞在内的所有细胞中棕榈酰化修饰蛋白质/肽段，也可以用于定量检测发生在半胱氨酸残基上的其它类型的翻译后修饰形式(如亚硝基化修饰等)。
更具体的，本发明的一种基于稳定同位素半胱氨酸代谢标记细胞培养(SILAC-Cys)的技术进行棕榈酰化修饰水平差异的检测方法，其包括步骤：
(1)利用含有轻、重标稳定同位素半胱氨酸的培养基进行细胞培养，在重同位素半胱氨酸培养基中，细胞内的轻同位素半胱氨酸可被重同位素的半胱氨酸完全取代，获得完全代谢标记的重标半胱氨酸细胞；
本发明中，培养的细胞选自MHCC97L和/或HCCLM3细胞，MHCC97L和HCCLM3分别为肝癌低转移潜能细胞和肝癌高转移潜能细胞，标记效率～100％；
(2)细胞培养6代以上后，收集轻、重同位素半胱氨酸标记的细胞，提取其中的蛋白质，利用质谱检测其中同位素半胱氨酸的标记情况；
本发明的实施例中，收集、重同位素半胱氨酸标记效率～100％的HCCLM3细胞，经蛋白质提取、选择性富集棕榈酰化修饰蛋白质和质谱分析，考察SILAC-Cys技术定量分析棕榈酰化修饰蛋白质的可行性；
(3)将MHCC97L和HCCLM3分别培养在含有轻和重稳定同位素半胱氨酸的培养基中，获得轻标MHCC97L和重标HCCLM3细胞，分别提取其中的蛋白质，按1∶1混合后，利用商业化材料Thiopropyl Sepharose 6B选择性富集其中潜在的棕榈酰化修饰蛋白质/肽段，再经过质谱分析，能够定量地检测上述两种具有不同转移潜能的细胞中棕榈酰化修饰水平的差异；
(4)利用Western Blot方法对潜在的棕榈酰化修饰差异蛋白质进行验证。
本发明提供了一种基于细胞培养稳定同位素半胱氨酸代谢标记(SILAC-Cys)技术、结合棕榈酰化修饰蛋白质的选择性富集方法，定量分析了转移潜能不同的细胞MHCC97L和HCCLM3中棕榈酰化修饰的蛋白质，并对其中的1个潜在修饰蛋白质进行了Western Blot验证。本发明为检测不同细胞样品中蛋白质棕榈酰化修饰水平提供了有效的手段。
本发明的优点及有益效果：
本发明利用稳定同位素半胱氨酸作为质量标签定量分析蛋白质棕榈酰化修饰水平，结合棕榈酰化修饰富集方法，通过色谱-质谱检测定量分析了转移潜能不同的肝癌细胞MHCC97L和HCCLM3中棕榈酰化修饰水平的差异；与现有的定量分析方法相比，本方法在实验初始引入质量标签，且标记效率高，可减少因繁冗的并行操作带来的误差；利用半胱氨酸高度活泼、低频但存在于大多数蛋白质的特性，联用高特异的富集技术，可大大减少样本的复杂性，简化谱图，促进低丰度蛋白的准确定量；半胱氨酸既为修饰位点又含定量标签，可用于定量分析包括C末端肽段在内的所有潜在的棕榈酰化修饰位点，是传统SILAC定量方法(利用赖氨酸和/或精氨酸稳定同位素标记)的有效补充；利用棕榈酰化修饰肽段在一级质谱图中形成对峰的特征可对被鉴定到的修饰肽段实现双重验证。
本定量方法适用于所有的细胞样品，既可用于棕榈酰化等半胱氨酸修饰组的定量，又可用于全蛋白质组的定量。
附图说明：
图1为在含重同位素半胱氨酸培养基中，培养不同传代次数后的细胞蛋白质的凝胶电泳图，以考马斯亮蓝染色，箭头所示为β-actin蛋白所在的分子量区间，图中H-LM3-2(3，4，5，6，7，8，9)表示重标半胱氨酸标记的HCCLM3第2次传代细胞蛋白，L-LM3表示轻标半胱氨酸标记的HCCLM3细胞蛋白。
图2为以β-actin为例，利用质谱方法分析重标同位素半胱氨酸对细胞蛋白的标记效率，将在含有重标半胱氨酸同位素的培养基中培养第0次(a)、第6次(b)和第9次(c)传代后的细胞，分别提取蛋白质、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，选取目标条带(如图2示)胶内酶解，质谱分析，其中，图A和图B分别为不同传代次数后肽段LC(+57)YVALDFEQEMATAASSSSLEK(m/z 2553.1)和C(+57)PEALFQPSFLGMESCGIHETTFNSIMK(m/z 3254.4)的质谱图，如图所示，随着传代次数的增加，细胞蛋白中原本存在的轻标半胱氨酸肽段的含量逐渐降低，而含有重同位素半胱氨酸的肽段含量逐渐增多，到了第9次传代时，只有重同位素半胱氨酸肽段能被检测到，而轻标半胱氨酸肽段基本无法检测到，说明经过9次传代后的细胞所含有的轻标半胱氨酸已几乎被重同位素半胱氨酸完全取代；
图中L sample表示轻半胱氨酸标记的HCCLM3细胞蛋白，H6sample和H9sample分别表示重标半胱氨酸标记的HCCLM3第6次和第9次传代细胞蛋白。
图3为以β-actin为例，利用质谱检测考察该方法用于定量分析的可行性，其中显示了，分别收集在含轻、重同位素半胱氨酸的培养基中培养传代9次后的HCCLM3细胞，提取蛋白质后，按1∶1混合，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，截取β-actin分子量区间的目标条带进行胶内酶解、肽段提取及质谱分析；
图中所示为轻标和重标肽段LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK在质谱图中的信号强度，结果表明，轻、重标肽段峰强基本一致，与理论值相符，说明重同位素半胱氨酸可以通过细胞培养代谢标记进入蛋白质中，且能用于定量蛋白质组学研究中；
图中所示Light和Heavy分别表示轻标半胱氨酸和重标半胱氨酸的细胞蛋白样品。
图4为利用Western Blot检测两种转移潜能不同的肝癌细胞MHCC97L和HCCLM3中蛋白质棕榈酰化修饰水平的差异情况，
图中，(A)为孵育抗棕榈酰化修饰泛抗血清后，低转移潜能的肝癌细胞MHCC97L蛋白质比高转移潜能的细胞HCCLM3呈现更明显的阳性条带；(B)相同上样量的上述MHCC97L和HCCLM3细胞蛋白质经聚丙烯凝胶电泳分离、考马斯亮蓝染色后，显色程度基本一致；(C)为内参蛋白β-actin的Western Blot结果。
图5为潜在棕榈酰化修饰差异蛋白质双链RNA特异性腺苷脱氨酶(Double-stranded RNA-specific adenosine deaminase，DSRAD)的Western Blot验证结果，显示了结合硫酯键对羟胺处理敏感的特点，利用Thiopropyl Sepharose 6B富集后，以抗DSRAD的蛋白质抗体进行Western Blot检测分析MHCC97L和HCCLM3细胞中DSRAD的棕榈酰化修饰水平，结果表明，在上样量相同的情况下，DSRAD的表达及棕榈酰化修饰水平在MHCC97L中均高于HCCLM3。图中97L和LM3分别表示为MHCC97L和HCCLM3细胞蛋白样品。
具体实施方式
结合图表和具体实施例对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
实施例1基于SILAC-Cys技术代谢标记MHCC97L和HCCLM3细胞
分别在含有重同位素标记半胱氨酸的DMEM培养基(10％透析胎牛血清)和轻同位素半胱氨酸的DMEM培养基(10％胎牛血清)中，37℃，5％CO2条件下按本领域公知的方法培养MHCC97L和HCCLM3细胞，用显微镜观察细胞的生长状态，待细胞密度生长至80％左右时，对细胞进行分装传代，每次传代时，只保留10％的前代细胞继续培养，剩余的90％细胞则用于检测稳定同位素的标记程度，当达到所需细胞代数时，待细胞密度生长到90％以上后，除去培养基并用PBS清洗细胞，胰酶消化后收集细胞；所收集的细胞用PBS清洗2次后，保存在-80℃冰箱中备用。
实施例2利用质谱方法分析重同位素半胱氨酸对细胞蛋白质的标记效率
收集重半胱氨酸标记的不同传代次数的HCCLM3细胞，分别加入裂解液(25mMHEPES，25mM NaCl，1mM EDTA，1×protease inhibitor cocktail(EDTA Free)和1×PMSF，pH 7.4)，4℃超声裂解进行蛋白质提取，所得的蛋白裂解产物于4℃20,000×g离心30min后，取上清按本领域公知的BCA法进行蛋白质定量；
取30μg上述各蛋白样品按本领域公知的聚丙烯凝胶电泳分离、考马斯亮蓝染色，选取图1箭头所示55KDa～40KDa的条带进行胶内酶解、肽段提取，并用SpeedVac真空抽干，将肽段样品重悬于20μl 5％ACN-0.1％FA水溶液中，15,000×g室温离心30min，取15μl上清进行LC-MS分离分析，采用Magic C18AQ反相色谱柱(100μm id×15cm，MichromBioresources，USA)进行色谱分离，色谱梯度：B相(90％ACN-0.1％FA)在50min从5％线性上升到45％，流速为500nL/min，采用LTQ Orbitrap XL质谱仪(美国热电公司)进行质谱检测；
如图2所示，随着传代次数的增加，细胞蛋白逐渐被重同位素半胱氨酸标记，到了第9次传代时，只有重同位素半胱氨酸肽段能被检测到，而轻标半胱氨酸肽段基本检测不到，说明经过9次传代后的细胞所含有的轻标半胱氨酸已几乎被重同位素半胱氨酸完全取代，即标记效率～100％；
进一步地，取第9次传代后的轻、重标HCCLM3细胞蛋白质样品1∶1混合，进行质谱分析，如图3示，来自于β-actin的轻、重标肽段LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK在质谱图中的信号强度相当，与理论值相符，说明重同位素半胱氨酸可以通过细胞培养完全代谢标记进入蛋白质中，且能用于定量蛋白质组学研究中，SILAC-Cys定量分析方法具有可行性。
实施例3利用棕榈酰化修饰泛抗血清Western blot方法检测MHCC97L和HCCLM3细胞中蛋白质棕榈酰化修饰水平
按实施例2的方法，取30μg实施例1中的MHCC97L和HCCLM3细胞蛋白质，按本领域公知的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜后，将PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜，按本领域公知的Western blot方法进行检测，加入β-actin抗体(1∶5000稀释)或抗棕榈酰化修饰泛抗血清(1∶20稀释)震荡4℃孵育过夜，用TBS-T洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶8000稀释)，室温震荡孵育1h后，再次用TBS-T溶液洗膜，并加入ECL超敏显色液，用ImageQuantECL仪器捕获显色图像，如图4示，低转移潜能的肝癌细胞MHCC97L蛋白质比高转移潜能的细胞HCCLM3呈现更明显的阳性条带，说明：在两种细胞系中，蛋白质棕榈酰化修饰水平具有明显差异，且MHCC97L中修饰程度相对较高。
实施例4 SILAC-Cys技术定量分析MHCC97L和HCCLM3细胞中棕榈酰化修饰蛋白质组
按实施例1的方法培养MHCC97L和HCCLM3细胞，按实施例2的方法进行蛋白质提取和定量；取等量的MHCC97L和HCCLM3细胞蛋白质按1∶1混合，混合后的蛋白质样品在20mMTCEP溶液中还原30min，在50mM NEM溶液中室温、避光条件下进行烷基化反应2.5h。重复两次上述还原、烷基化反应，以完全封闭蛋白质中的自由巯基，通过两次氯仿/甲醇沉淀方法除去体系中过量的NEM。蛋白样品重溶在含有0.1％SDS的Tris缓冲液(50mM Tris，5mMEDTA，pH 7.4)后，加入2M NH2OH(pH7.4)溶液和Thiopropyl Sepharose 6B富集材料在室温孵育4h，以富集棕榈酰化修饰蛋白质，富集后洗涤Thiopropyl Sepharose 6B材料以除去非特异性吸附。离心收集富集材料于37℃用胰蛋白酶酶解过夜，离心除去上清，用DTT孵育解离材料上的棕榈酰化修饰肽段后，用IAA对肽段样品进行烷基化反应，用C18小柱除盐、冻干；
将上述肽段样品重溶于20μl 5％ACN-0.1％FA水溶液，15,000×g室温离心30min，取15μl上清进行LC-MS分离分析，采用Acclaim PepMap 100C18色谱柱(1.0mm×15cm，Thermo Fisher，USA)进行色谱分离，色谱梯度：B相(100％ACN-0.1％FA)在110min从5％线性上升到45％，流速为500nL/min。采用Q-Exactive质谱仪(美国热电公司)系统进行质谱分析，质谱采集时间为120min；
将采集到的质谱数据用pFind(版本号3.0)软件进行检索搜库，所用数据库为Uniprot-human蛋白数据库，检索参数设置为：Variable modifications(可变修饰)为Carboxyamidomethylation(C)，Carboxyamidomethylation+4(C)，Nethylmaleimide(C)，Nethylmaleimide+4(C)，Acetyl(protein N-term)和Oxidation(M)，母离子质量误差为±10ppm，串级碎片离子质量误差为±0.05Da，酶选择胰蛋白酶(Trypsin)，半酶切模式下漏切位点为2个；同时，在pFind软件中编辑了定量模式，设置“SILAC[(C，13C)；(N，15N)]”为重标，“none”为轻标，从而可以得到含有修饰位点的肽段和相应蛋白质的相对含量。
实施例5潜在棕榈酰化修饰差异蛋白质的验证
按实施例1进行MHCC97L和HCCLM3细胞培养，按实施例4提取蛋白质后，取500μg等量的MHCC97L和HCCLM3细胞蛋白质进行棕榈酰化修饰蛋白质富集，按本领域公知的凝胶电泳分离后，以抗DSRAD的蛋白质抗体进行Western Blot检测分析MHCC97L和HCCLM3细胞中DSRAD的棕榈酰化修饰水平，如图5示，在上样量相同的情况下，DSRAD的表达及棕榈酰化修饰水平在MHCC97L中均高于HCCLM3，与实施例4中质谱定量分析结果一致。