阅读说明：本技术 一种特异性检测精氨酸的荧光检测剂及检测试纸的制备方法 (Fluorescence detection agent for specifically detecting arginine and preparation method of detection test paper ) 是由 黄潇楠 路昭然 朱晓雨 韩天宇 于 2019-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种特异性检测精氨酸的荧光检测剂及检测试纸的制备方法。该检测剂((E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸,DBAB)是由4-(二乙基氨基)苯甲醛和2-氨基苯甲酸一步式合成；然后将白色滤纸浸入DBAB溶液中制备得到检测试纸。在溶液中,DBAB对精氨酸表现出特异识别性。比色实验中,DBAB-Arg的混合溶液表现出明显的黄色到无色的颜色变化；荧光实验中,DBAB-精氨酸的混合溶液表现出明显的青色到紫色的荧光变化。在试纸实验中也有相同的现象。根据紫外吸收光谱和荧光光谱显示,DBAB对于精氨酸是具有双吸收信号和双发射信号的多通道传感器。该检测方法具有高选择性和瞬时响应性。(The invention discloses a fluorescence detection agent for specifically detecting arginine and a preparation method of detection test paper. The detector ((E) -2- ((4- (diethylamino) benzylidene) amino) benzoic acid, DBAB) was synthesized from 4- (diethylamino) benzaldehyde and 2-aminobenzoic acid in one step; and then, soaking the white filter paper into the DBAB solution to prepare the detection test paper. In solution, DBAB exhibits specific recognition for arginine. In a colorimetric experiment, a mixed solution of DBAB-Arg shows obvious color change from yellow to colorless; in fluorescence experiments, the DBAB-arginine mixed solution showed a clear cyan to violet fluorescence change. The same phenomenon also occurs in the test paper experiment. DBAB is a multichannel sensor with double absorption and double emission signals for arginine, shown by ultraviolet absorption and fluorescence spectroscopy. The detection method has high selectivity and transient responsiveness.)

一种特异性检测精氨酸的荧光检测剂及检测试纸的制备方法

技术领域

本发明属于氨基酸检测技术领域，具体涉及一种特异性检测精氨酸的荧光检测剂及检测试纸的制备方法。

背景技术

在人体内20种常见氨基酸中，精氨酸因其对人脑化学的重要影响而备受关注，包括血管扩张，免疫反应和神经传递。精氨酸(Arg)又称蛋白氨基酸，是最具碱性的氨基酸，与其他20种氨基酸相比，其等电点(pI)最高，为10.76。精氨酸在细胞***，伤口愈合，蛋白质生成，免疫反应等多种生物功能中起重要作用。此外，精氨酸在人体内参与鸟氨酸循环，促进尿素的形成，使人体内产生的氨经鸟氨酸循环转变成无毒的尿素，再由尿中排出，从而降低血氨浓度；精氨酸是***蛋白的主要成分，有促进***生成、提供***运动能量的作用；精氨酸也是一氧化氮(NO)的生理前体，其作为血管稳态中的关键介质起到重要作用。在血浆样本分析中，精氨酸衍生物种的数量异常时可能是不健康的，甚至危及生命。因此，精氨酸可用作诊断某些疾病的指标。因此，开发可行的精氨酸检测方法是非常有必要的。目前虽然已经报道了许多测定精氨酸的方法，例如高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC)和毛细管电泳，这些方法大多需要专门的实验设备和复杂的程序，成本较高。因此开发一种简单、廉价、高灵敏度和高选择性的精氨酸检测方法尤为必要。而荧光化学传感器便是这类检测方法之一，它相较于其他方法具有许多优点，如操作简易、灵敏度高以及显著的选择性和快速响应性。

发明内容

本发明提供了一种特异性检测精氨酸的荧光检测剂((E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸，DBAB)及检测试纸的制备方法。该检测剂是由4-(二乙基氨基)苯甲醛和2-氨基苯甲酸一步式合成；然后将白色滤纸浸入DBAB的THF(四氢呋喃)溶液中制备得到检测试纸。

本发明所述的特异性检测精氨酸的荧光检测剂的制备方法为：将4-(二乙基氨基)苯甲醛溶于脱水乙醇中；将2-氨基苯甲酸溶解在有机溶剂中；然后将2-氨基苯甲酸溶液和乙酸加入到4-(二乙基氨基)苯甲醛的脱水乙醇溶液中形成混合物；将混合物在48-52℃下搅拌4.9-5.1小时后冷却至室温，过滤，最后用乙醇和己烷洗涤，即得到特异性检测精氨酸的荧光检测剂(E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸。

所述的4-(二乙基氨基)苯甲醛的脱水乙醇溶液的浓度范围为0.07-0.09mmol/mL。

所述的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮中的一种或几种。

所述的2-氨基苯甲酸溶液的浓度范围为15-20mmol/mL。

所述的4-(二乙基氨基)苯甲醛和2-氨基苯甲酸的摩尔比为0.6-0.7:1，4-(二乙基氨基)苯甲醛和乙酸的摩尔比为6.4-6.5:1。

本发明所述的特异性检测精氨酸的检测试纸的制备方法为：将白色滤纸切成均匀的纸条并浸入(E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸的四氢呋喃溶液中，(E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸的浓度为0165-0.175mmol/mL，浸泡2-10分钟后取出，在室温下通风干燥即得。

所述的特异性检测精氨酸的荧光检测剂的使用方法为：将待测液滴入(E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸的四氢呋喃或DMF溶液中，观察溶液是否变色，若变色，则待测液中含精氨酸，若不变色，则待测液中不含精氨酸。

所述的特异性检测精氨酸的检测试纸的使用方法为：将待测液滴在检测试纸上，或将检测试纸置入待测液中，观察检测试纸是否变色，若变色，则待测液中含精氨酸，若不变色，则待测液中不含精氨酸。

本发明以荧光席夫碱为基材，通过将其溶液负载到滤纸上，可制得便携、低成本和响应快速的精氨酸检测试纸。在溶液中，DBAB对精氨酸表现出特异识别性。DBAB由于聚集诱导发光原理而在高浓度发射蓝绿色光，由于精氨酸的胍基的碱性和氢键作用，可与DBAB分子的羧基相互作用，从而破坏分子间聚集而发射紫光。比色实验中，DBAB-Arg的混合溶液表现出明显的黄色到无色的颜色变化；荧光实验中，DBAB-精氨酸的混合溶液则表现出明显的青色到紫色的荧光变化。在试纸实验中也有相同的现象。根据紫外吸收光谱和荧光光谱显示，DBAB对于精氨酸是具有双吸收信号和双发射信号的多通道传感器。该检测方法具有高选择性和瞬时响应性，精氨酸的检测限为0.3mmol/mL。

附图说明

图1为本发明的特异性检测精氨酸的荧光检测剂的工作示意图。

图2为实施例1中合成的检测剂DBAB的¹H NMR和¹³C NMR图。

图3为实施例1中合成的DBAB的ESI MS图。

图4为实施例1中DBAB在溶液中检测精氨酸的环境光、紫外光、紫外吸收光谱和荧光光谱图。

图5为实施例1中DBAB检测精氨酸的反应时间图。

图6为实施例2中检测试纸应用图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：特异性检测精氨酸的荧光检测剂

(1)DBAB的制备：将4-(二乙基氨基)苯甲醛(2.00g，11.28mmol)溶于脱水乙醇(130ml)中；将2-氨基苯甲酸(1.55g，17.06mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，2-氨基苯甲酸的浓度为20mmol/mL；然后将制得的2-氨基苯甲酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液和两滴乙酸(质量浓度98％)加入到4-(二乙基氨基)苯甲醛的脱水乙醇溶液中形成混合物；将混合物在50℃下搅拌5小时，然后冷却至室温，过滤，最后用乙醇和己烷洗涤固体产物，即得特异性检测精氨酸的荧光检测剂(E)-2-((4-(二乙基氨基)亚苄基)氨基)苯甲酸DBAB。

(2)精氨酸的检测：将DBAB溶于DMF中，浓度为1.7mM，并以DMF为溶剂将该溶液稀释至0.169mM用于吸光度和荧光分析。在去离子水中制备L-氨基酸(甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His))溶液(均为100mM)。将0.02mL(100mM)不同L-氨基酸溶液分别加到2mL(0.169mM)DBAB溶液中制备测试溶液。将得到的溶液充分混合后快速在室温下记录其吸光度及荧光光谱。同时，我们在环境光和365nm的紫外光下对上述不同混合溶液进行激发。

(3)响应时间的测量：首先记录420nm处2mL(0.169mM)DBAB溶液的吸光度值，然后将0.02mL(100mM)精氨酸溶液加到该DBAB溶液中形成混合溶液，无需混合均匀立即测量其420nm处的吸光度值，每2s记录一次，共记录60s。

实施例2：特异性检测精氨酸的检测试纸

(1)试纸的制备：将纯白色滤纸切成均匀的纸条并浸入DBAB的THF(四氢呋喃)溶液(0.169mM)。浸泡5分钟后，取出并在室温下放置于通风橱中干燥。

(2)试纸应用：在试纸上分别滴加等量的去离子水及20种氨基酸，分别观察其环境光和365nm紫外光下的颜色。

上述所得到特异性检测精氨酸的荧光检测剂及检测试纸的测试表明，该检测剂实现了较快的检测，将响应时间缩短到2s。通过将其应用到试纸上可实现便携、低成本和响应快速的实际应用潜力。