一种壳寡糖单体的制备方法
阅读说明：本技术 一种壳寡糖单体的制备方法 (Preparation method of chitosan oligosaccharide monomer ) 是由 王斌 汪玲 夏文水 姜启兴 许艳顺 于沛沛 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种壳寡糖单体的制备方法。本发明对壳寡糖溶液进行预处理,使高浓度的壳寡糖溶液在80～90％乙醇溶液中分级沉淀,高聚合度壳寡糖被沉淀下来,小聚合度壳寡糖留存在上清液中,沉淀进行第二次处理,两次得到的上清液合并,旋转蒸发浓缩,浓缩液冷冻干燥,得到聚合度1～5含量高的壳寡糖粗品。再进行阳离子交换色谱分离,采用阶段性等度洗脱,一个洗脱液浓度只洗脱一个聚合度壳寡糖,实现分离过程无需检测,得到壳寡糖单体的纯度达到90％以上,产量达到克级别。(The invention discloses a preparation method of a chitosan oligosaccharide monomer. The method comprises the steps of pretreating a chitosan oligosaccharide solution, carrying out fractional precipitation on the high-concentration chitosan oligosaccharide solution in an 80-90% ethanol solution, precipitating the high-polymerization degree chitosan oligosaccharide, retaining the low-polymerization degree chitosan oligosaccharide in a supernatant, carrying out secondary treatment on the precipitate, combining the supernatants obtained twice, carrying out rotary evaporation concentration, and freeze-drying a concentrated solution to obtain a crude product of the chitosan oligosaccharide with high polymerization degree of 1-5. And then performing cation exchange chromatography separation, and using stepwise isocratic elution, wherein chitosan oligosaccharide with only one polymerization degree is eluted by using the concentration of one eluent, so that the separation process is not required to be detected, the purity of the obtained chitosan oligosaccharide monomer reaches more than 90%, and the yield reaches the gram level.)
技术领域
本发明涉及一种壳寡糖单体的制备方法，属于壳寡糖制备技术领域。
背景技术
研究壳寡糖功能活性采用壳寡糖混合物作为实验原料，其聚合度分布无规律且分子量、脱乙酰度不固定，从而导致壳寡糖吸收形式、跨膜转运类型及特征和壳寡糖功能活性等颇具争议，某些研究结果甚至出现相悖的情况，极大限制其生理活性的深入研究。目前关于壳寡糖单体的制备常用的方法有凝胶色谱层析、固定金属亲和色谱层析和离子交换色谱层析三种。凝胶色谱层析受其分离原理的限制，上样量小、流速慢、分离纯度低；固定金属亲和层析需要自己设计合成色谱机制，一般采用铜离子与壳寡糖的氨基之间的相互作用，只能分离2、3、4糖，4糖以上形成的复合物稳定，不能脱离；离子交换色谱层析的上样量取决于柱体积、流速快、分离纯度高但是需要除酸除盐。因此制备高产量、高纯度壳寡糖单体是依旧是一大难点，也是进一步研究其吸收代谢机制、发挥功能活性机理的基础。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种壳寡糖单体的制备方法。本发明使用简单的乙醇分级沉淀的方法对市面上购买的分子量900Da的壳寡糖进行原料预处理，提高壳寡糖粗品中1～5糖的含量。使用阳离子交换色谱的基础上，采用阶段性等度洗脱，一个梯度洗脱液洗脱一个聚合度糖，可以最大程度的保证各个聚合度的回收率、纯度和产量。
本发明的第一个目的是提供一种壳寡糖单体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将壳寡糖溶解后得到壳寡糖溶液，向壳寡糖溶液中加入乙醇进行分级沉淀处理，收集上清液，并将沉淀溶解后加入乙醇进行第二次分级沉淀处理，合并两次上清液，浓缩干燥得到壳寡糖粗品；
(2)将壳寡糖粗品加水溶解后，上样至阳离子交换树脂，使用不同浓度的盐酸溶液进行阶段性等度洗脱，依次得到壳1糖、壳2糖、壳3糖、壳4糖和壳5糖的洗脱液；其中，不同浓度的盐酸溶液依次为0.1～0.3mol/L HCl溶液、0.3～0.4mol/L HCl溶液、0.55～0.7mol/LHCl溶液、0.85～1.0mol/L HCl溶液和1.15～1.5mol/L HCl溶液；
(3)将洗脱液分别进行中和、脱盐后，干燥得到壳寡糖单体。
进一步地，步骤(1)中，壳寡糖溶液中壳寡糖质量分数为10～30％。
进一步地，步骤(1)中，所述乙醇为无水乙醇，与壳寡糖溶液的体积比为4～5:1。
进一步地，步骤(1)中，分级沉淀是在加入乙醇后，在0～4℃静置约1～15h，然后离心收集上清液。
进一步地，所述的离心是在8000～12000r/min离心10～30min。
进一步地，所述的阳离子交换树脂为大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，上样时，壳聚糖粗品溶液中壳聚糖的质量分数为0.5～2％。
进一步地，上样采用500～700mL/h的流速上样，用去离子水洗脱到pH为5～6。
进一步地，步骤(3)中，所述的中和是用4～6mol/L NaOH溶液调节pH为8～9。
进一步地，步骤(3)中，所述的脱盐是采用活性炭萃取脱盐，具体包括如下步骤：中和后加入活性炭，搅拌2h以上，抽滤，洗涤活性炭2～3次，洗涤后将活性炭放在pH为1～3的40～60％乙醇溶液中，搅拌12h以上，抽滤，得到含壳寡糖单体的乙醇溶液。
本发明的第二个目的是提供所述方法制备得到的壳寡糖单体。
本发明的有益效果是：
本发明对购买的商品化壳寡糖进行简单的醇沉预处理，可以将样品中1～5糖含量由59.36％提升到83.87％。再进行阳离子交换色谱分离，通过阶段性等度洗脱，一个洗脱液浓度洗脱一个聚合度糖，可以将所有的目标产物洗脱下来，中和之后，活性炭萃取脱盐，得到的四个壳寡糖单体壳2、壳3、壳4和壳5，纯度分别为93.44％、93.30％、91.48％和93.11％，单体回收率分别为53.43％、50.51％、57.95％和33.40％，回收率低的主要原因在于脱盐过程糖的损失。各聚合度单体产量可以达到克级别，分别为0.26g、1.05g、1.37g和0.53g。
附图说明
：图1壳寡糖粗品TLC图，样品1是购买的原料，样品2为90％乙醇处理上清液，样品3是90％乙醇处理沉淀；对应样品预处理的实施例1；
图2壳寡糖粗品TLC图，样品1是购买的原料，样品2为80％乙醇处理上清液；对应样品预处理的实施例2；
图3是梯度洗脱时洗脱液的薄层点样图；对应壳寡糖单体制备的实施例3；
图4和图8是阶段性等度洗脱时洗脱液的薄层点样图；对应壳寡糖单体制备的实施例4和实施例6；
图5、图6、图7和图9是色谱分离后得到的壳2～5糖的TLC纯度分析图；对应壳寡糖单体制备的实施例4、实施例5、实施例6和实施例7；
图10、11、12、13和14分别为标准品、壳2糖、壳3糖、壳4糖、壳5糖HPLC分析图；
图15、16为壳2糖标准品和制备样品的质谱图；
图17、18为壳3糖标准品和制备样品的质谱图；
图19、20为壳4糖标准品和制备样品的质谱图；
图21、22为壳5糖标准品和制备样品的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
TLC分析：壳寡糖洗脱液，用毛细吸管点样50次于高效硅胶板上，各点之间间距0.5cm，距底端距离为1.0cm，将点样好的硅胶板至于展开体系为异丙醇：氨水：水＝15：7.5：1的层析缸中，待上行展开后取出，用电吹风吹干。硅胶板上喷洒0.5％的茚三酮显色剂，置于电热板上加热显色，各种糖即呈现，显色点颜色为紫红色。制备的壳寡糖单体，配置为20mg/mL，统一用毛细吸管点样5次于高效硅胶板上，其它操作同上。
HPLC分析：色谱条件：E2695-Waters高效液相色谱仪；示差折光检测器；AsahipakNH2P-50 4E，Shodex(4.6mmID×250mm L)色谱柱；柱温：30℃；流动相为乙腈：水＝7:3；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；样品浓度：20mg/mL(标准品10mg/mL)
壳寡糖预处理
实施例1：
准确称取20g原料壳寡糖(Mw900Da，DD>95％)，加80mL水溶解，边震荡边加入900mL无水乙醇，4℃过夜放置，10000r/min离心20min，收集上清液；60℃旋转蒸发浓缩到80mL左右，冻干，得到壳寡糖粗品。对壳寡糖粗品进行TLC分析，结果如图1所示，由图1中点样原点处颜色的深浅可知，经过预处理以后聚合度高的壳寡糖含量变少。
实施例2：
准确称取40g原料壳寡糖(Mw900Da，DD>95％)，加160mL水溶解，边震荡边加入800mL无水乙醇，4℃过夜放置，10000r/min离心20min，收集上清液，沉淀加入100mL水溶解，加入400mL无水乙醇，4℃过夜放置，10000r/min离心20min，收集上清液；合并两次上清液，60℃旋转蒸发浓缩到200mL左右，冻干，得到壳寡糖粗品。对壳寡糖粗品进行TLC和HPLC分析，结果如图1及表1和表2所示，由图1中点样原点处颜色的深浅可知，经过预处理以后聚合度高的壳寡糖含量变少；通过HPLC测定计算，表2可知，通过预处理以后壳1～5糖的总含量从59.36％提高到83.87％，壳1的含量从1.43％提高到2.41％，壳2含量由3.66％提高到6.08％，壳3含量由17.35％提高到25.99％，壳4的含量由21.18％提高到29.55％，壳5的含量由15.73％提高到19.83％。
表1样1和样2中聚合度1～5的总含量
表2样2中聚合度1～5的含量
壳寡糖单体制备
实施例3：
准确称取8g壳寡糖粗品，配置为1％壳寡糖溶液，0.45μm膜，抽滤，600mL/h的流速上样，上样结束，去离子水洗脱到pH基本保持不变(约5～6)，然后换0.5～1.0mol/L HCl溶液2L，1.0～1.2mol/L HCl溶液2L，1.2～1.3mol/L HCl溶液2L，1.3～1.4mol/L HCl溶液2L，一共8L洗脱液进行梯度洗脱，每10min(100mL)收集一次。对各瓶洗脱液点样30次进行TLC分析，分析结果如图3所示，将TLC鉴定得到的单一的相同组分合并收集。将洗脱液用5mol/LNaOH溶液调节pH为8～9，加入活性炭，磁力搅拌2h以上，抽滤，用去离子水洗涤活性炭2～3次，将活性炭放在50％pH为2的50％乙醇溶液中，磁力搅拌12h以上，抽滤，得到壳寡糖单体的乙醇溶液，在45℃条件下旋转蒸发，体积减少一半以上后，冻干，得到纯净的壳寡糖单体粉末。
根据图3的结果显示，1～3瓶是单一的壳1洗脱液，4～7瓶是壳1和壳2混合洗脱液，8～12瓶是单一的壳2洗脱液，13～25瓶是壳2和壳3的混合洗脱液，26～30是壳2、壳3和壳4三个糖的混合洗脱液，31～60都是壳3和壳4的混合洗脱液，仅仅得到了单一的壳1和壳2，壳3以后的糖没有得到单一成分，但是从这个实验结果可以看出每个聚合度的糖都是从无到有然后再渐渐消失，证明了糖能够分离的趋势，只是需要更适合的条件。在两个糖同时出现的区域，该浓度的洗脱液对于小聚合度糖的一方偏大，如果可以在这之前用更低的浓度梯度将小聚合度糖全部洗脱干净，那么该浓度下就可以得到单一的大聚合度糖。为了实现这个设想，控制洗脱液浓度和体积，最后选择了等度洗脱。
实施例4：
准确称取8g壳寡糖粗品，配置为1％壳寡糖溶液，0.45μm膜，抽滤，600mL/h的流速上样，上样完成后，用去离子水洗脱到pH基本保持不变(约5～6)，然后采用不同浓度的盐酸溶液进行阶段性等度洗脱。0.3mol/L HCl溶液3L洗涤壳1糖，如图4中11-1和11-2所示，1～4瓶洗脱液中只有壳1糖，从第5瓶洗脱液中开始出现壳2糖，显示0.3mol/L洗脱壳1糖浓度偏高，需要降低洗脱液的浓度。0.4mol/L HCl溶液8L洗脱壳2糖，如图4中11-3～11-7所示，洗脱下来的为单一的壳2糖，11-7显示壳2糖基本洗脱干净。换0.6mol/L HCl溶液5L洗脱壳3糖，如图4中11-8和11-9所示，薄层点颜色浅，浓度比较低，适当的调高洗脱液浓度，采用0.7mol/L HCl溶液11L洗脱液洗脱壳3糖，如11-10～11-14所示，11-14显示壳3糖基本洗脱干净。换0.9mol/L HCl溶液4L洗脱壳4糖，11-15和11-16薄层板显示浓度很低，适当调高洗脱液浓度为1.0mol/L HCl溶液12.5L洗脱壳4糖，如图11-17～11-20所示，显示为单一的壳4糖。最后换1.3mol/L HCl溶液10.5L和1.5mol/L HCl溶液7L共17.5L洗脱壳5糖。将洗脱液用5mol/L NaOH溶液调节pH为8～9，加入活性炭，磁力搅拌2h以上，抽滤，用去离子水洗涤活性炭2～3次，将活性炭放在50％pH为2的50％乙醇溶液中，磁力搅拌12h以上，抽滤，得到壳寡糖单体的乙醇溶液，在45℃条件下旋转蒸发，体积减少一半以上后，冻干，得到纯净的壳寡糖单体粉末。图5为本次制备得到的壳2～5糖的薄层图。
实施例5：
准确称取8g壳寡糖粗品，配置为1％壳寡糖溶液，0.45μm膜，抽滤，600mL/h的流速上样，上样结束，去离子水洗脱到pH基本保持不变(约5～6)，然后换0.1mol/L HCl溶液4L洗脱壳1糖，0.4mol/L HCl溶液10L洗脱壳2糖，0.7mol/L HCl溶液8L和0.6mol/L HCl溶液12L共20L洗脱液洗脱壳3糖，0.9mol/L HCl溶液12L和1.0mol/L HCl溶液22L共34L洗脱液洗脱壳4糖，1.2mol/L HCl溶液8L和1.3mol/L HCl溶液10L共18L洗脱液洗脱壳5糖。将洗脱液用5mol/L NaOH溶液调节pH为8～9，加入活性炭，磁力搅拌2h以上，抽滤，用去离子水洗涤活性炭2～3次，将活性炭放在50％pH为2的50％乙醇溶液中，磁力搅拌12h以上，抽滤，得到壳寡糖单体的乙醇溶液，在45℃条件下旋转蒸发，体积减少一半以上后，冻干，得到纯净的壳寡糖单体粉末。图6为本次制备得到的壳2～5糖的薄层图。
实施例6：
准确称取8g壳寡糖粗品，配置为1％壳寡糖溶液，0.45μm膜，抽滤，600mL/h的流速上样，上样结束，去离子水洗脱到pH基本保持不变(约5～6)，然后换0.1mol/L HCl溶液4L洗脱壳1糖，0.4mol/L HCl溶液10L洗脱壳2糖，0.6mol/L HCl溶液20L洗脱壳3糖，0.9mol/LHCl溶液40L洗脱壳4糖，1.2mol/L HCl溶液20L洗脱壳5糖。图8为收集到的各瓶洗脱液的薄层板图，薄层图显示分离过程中基本得到单一的壳1～5糖。将洗脱液用5mol/L NaOH溶液调节pH为8～9，加入活性炭，磁力搅拌2h以上，抽滤，用去离子水洗涤活性炭2～3次，将活性炭放在50％pH为2的50％乙醇溶液中，磁力搅拌12h以上，抽滤，得到壳寡糖单体的乙醇溶液，在45℃条件下旋转蒸发，体积减少一半以上后，冻干，得到纯净的壳寡糖单体粉末。图7为本次制备得到的壳2～5糖的薄层图。
表3制备壳寡糖单体聚合度2～5得量和回收率
实施例7：
准确称取8g壳寡糖粗品，配置为1％壳寡糖溶液，0.45μm膜，抽滤，600mL/h的流速上样，上样结束，去离子水洗脱到pH基本保持不变(约5～6)，然后换0.1mol/L HCl溶液4L洗脱壳1糖，0.3mol/LHCl溶液12L洗脱壳2糖，0.55mol/L HCl溶液24L洗脱壳3糖，0.85mol/LHCl溶液46L洗脱壳4糖，1.15mol/L HCl溶液28L洗脱壳5糖。将洗脱液用5mol/L NaOH溶液调节pH为8～9，加入活性炭，磁力搅拌2h以上，抽滤，用去离子水洗涤活性炭2～3次，将活性炭放在50％pH为2的50％乙醇溶液中，磁力搅拌12h以上，抽滤，得到壳寡糖单体的乙醇溶液，在45℃条件下旋转蒸发，体积减少一半以上后，冻干，得到纯净的壳寡糖单体粉末。图9为本次制备得到的壳2～5糖的薄层图。图11～14分别为壳2～5糖液相图，通过归一法计算壳2～5糖的纯度如表3所示，纯度均在90％以上。图15、16为壳2糖标准品和制备样品的质谱图，图17、18为壳3糖标准品和制备样品的质谱图，图19、20为壳4糖标准品和制备样品的质谱图，图21、22为壳4糖标准品和制备样品的质谱图，标准品和制备样品的质谱峰能对应上，侧面印证制备壳2～5糖为全脱乙酰壳2～5糖。
表4制备壳寡糖单体聚合度2～5HPLC纯度鉴定
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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