具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例一、昆虫细胞可溶性表达的PRRSV不同基因亚型毒株杂合GP5蛋白的分子设计

本研究通过4种基因亚型PRRSV代表性毒株(S1、BB0907、FJ1402和LV)GP5蛋白氨基酸序列比较，选取其同源性较高的氨基酸序列组合为杂合GP5蛋白(xGP5m蛋白)，按昆虫细胞偏嗜性优化密码子碱基进行人工合成，分别在xGP5m蛋白的N端添加三种穿膜肽序列(TAT、ppTG20、MPG)，克隆至昆虫杆状病毒表达系统的pFastBac^TMDual载体，再经过二次蓝白斑筛选得到重组Bacmids转染Sf9细胞，构建获得4株重组杆状病毒，Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明，TAT-xGP5m和ppTG20-xGP5m呈现可溶性表达，表达量高于xGP5m；TAT-xGP5m免疫小鼠ELISA抗体水平最高。说明TAT-xGP5m分子设计最佳。

细胞穿透肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)又称穿膜肽，是一类能够穿过细胞膜或组织屏障的短肽，可运载生物大分子进入细胞内发挥其功能，抗原与CPPs的融合可以增强抗原呈递细胞(APC)的抗原摄取、加工和呈递能力。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的GP5蛋白可诱导体液免疫和细胞免疫，并且GP5抗体水平与病毒中和作用关系密切，因而GP5蛋白是PRRSV亚单位疫苗研发的重要靶标。为了提高PRRSV疫苗免疫保护广谱性和GP5蛋白表达效力，本研究根据4种基因亚型PRRSV代表性毒株GP5基因序列，设计了杂合GP5基因(xGP5)，并在其前端分别添加三种细胞穿透肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)：TAT、ppTG20以及MPG基因序列，构建获得4株重组杆状病毒，获得了可溶性表达的GP5蛋白，小鼠免疫实验结果表明其具有较好抗原性和免疫原性。

1材料与方法

1.1质粒、菌株、细胞和主要试剂

pFastBac^TMDual载体、大肠杆菌DH5α、DH10Bac、Sf9和Marc145细胞，本实验室保存的本领域常规材料。Mini plasmid、DNA凝胶回收试剂盒、2×Taq Mix均购自南京诺唯赞。限制性核酸内切酶购自Thermo Fisher公司。His-tag购自翼飞雪生物科技有限公司。Lipofectamine 3000为Invitrogen公司产品。SPA-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP购自武汉博士德生物工程公司。Sf-900ⅢSFM无血清培养基为Gibco公司产品。其他常规试剂均为国产或进口分析纯。引物合成及基因测序均在南京金斯瑞生物科技有限公司进行。

1.2目的基因设计

选择PRRSV代表性流行毒株S1、BB0907、FJ1402和LV基因序列，比对分析GP5蛋白氨基酸序列，选取其共有的氨基酸组合为杂合GP5蛋白(xGP5m)(见图1)，并在C端引入6×His标签序列，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，再将其对应基因序列按昆虫细胞偏嗜性优化，连接在pFastBac^TMDual载体的PH启动子下，合成质粒命名为pF-xGP5m(该重组质粒由南京金斯瑞生物公司合成)，优化前后的密码子如图2所示，序列号为SEQ ID NO.3。分别在杂合ORF5基因的N端添加三种穿膜肽(TAT、ppTG20、MPG)基因序列，并在起始密码子前添加Kozak序列(GCCACC)以促进目的蛋白表达，之后使用Premier Primier5.0软件设计引物，引物名称及序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3重组质粒构建

1.3.1目的基因扩增

以pF-xGP5m质粒为模板及表中的引物分别扩增各个目的基因片段，分别获得TAT-xGP5m、ppTG20-xGP5m、MPG-xGP5m，PCR反应体系如下：2×Taq Mix 12.5μL，ddH₂O9.5μL，上下游引物各1μL，模板1μL，总共25μL。

PCR反应程序为：95℃预变性5min，98℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸45s进行35个循环，72℃延伸10min。

1.3.2 PCR产物的纯化

(1)将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带放入1.5mL EP管中，依据Bioflux凝胶回收试剂盒操作步骤回收目的片段；

(2)于1.5mL EP管中加入400μL Extraction Buffer，55℃水浴至完全融化；

(3)将融化后的液体转移至Spin column中，室温6,000g离心1min，弃滤液；

(4)于柱中加入600μL Extraction Buffer，室温10,000g离心1min，弃滤液；

(5)于柱中加入700μL Wash Buffer，室温10,000g离心1min，弃滤液；

(6)室温12,000g空离5min后，将柱子转移到新的1.5mL EP管中，于通风处开盖晾干5～10min，至酒精完全挥发；

(7)65℃提前预热双蒸水，于柱子中加入30μL预热的双蒸水，溶解2min后12,000g离心1min，并测定浓度。

1.3.3目的基因与载体质粒的双酶切与纯化

用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ对TAT-xGP5m、ppTG20-xGP5m、MPG-xGP5m及pFastBac^TMDual空载体于37℃水浴双酶切2h，酶切体系：目的基因25μL，ddH₂O17μL，10×Buffer 5μL，EcoRⅠ和HindⅢ各1.5μL，总计50μL；载体质粒10μL，ddH₂O32μL，10×Buffer 5μL，EcoRⅠ和HindⅢ各1.5μL，总计50μL。

1.3.4目的基因与载体质粒的连接

将双酶切后的载体进行1％琼脂糖核酸胶电泳并切胶回收纯化，方法同PCR产物纯化步骤一致，目的基因双酶切后直接进行纯化，将纯化后的目的基因与相应载体与23℃金属浴连接2h，连接体系：目的基因7μL，载体1μL，T4连接酶1μL，10×T4 Buffer 1μL，合计10μL。

1.3.5大肠杆菌DH5α感受态的制备与连接产物转化

(1)接种50μL DH5α甘油菌于3mL无抗的LB培养液中，37℃、200rpm培养12h，再吸取30μL菌液接种于3mL无抗的LB培养液中，待OD600nm在0.3～0.4时12000rpm离心1min，弃上清液；

(2)于沉淀中加入1mL 0.1M CaCl2重悬菌体，冰水浴30min后再次离心弃上清；

(3)再次用100μL 0.1M CaCl2重悬菌体，冰水浴15min后备用；

(4)将10μL连接产物加入到100μL制备好的DH5α感受态中，轻弹混匀后冰水浴30min；

(5)于42℃水浴热激90s，再立即冰水浴2min；

(6)加入800μL无抗的LB培养液，37℃、200rpm培养1h；

(7)12000rpm离心1min收集菌体，用100μL LB培养液重悬，均匀涂布于含Amp抗性的LB平板上，37℃温箱倒置培养10-14h。

1.3.6重组质粒的提取与鉴定

在均匀长有单菌落的平板上挑取5个单菌落接种于含Amp抗性的LB培养液中，37℃、200rpm震荡培养3h，取出1μL菌液作为模板进行菌液PCR验证(方法参照本章1.3.1)。选取强阳性菌液，吸取50μL接种于两支3mL Amp抗性的LB培养液中，37℃、200rpm震荡培养13-16h，用于提取质粒，按照OMEGA质粒小提试剂盒说明书操作，具体方法如下：

(1)将新鲜菌液转移至1.5mL EP管中，12000rpm离心1min弃去培养液，收集所有菌体；

(2)于菌体中加入250μL Buffer A1(添加RnaseA)重悬菌体沉淀；

(3)于EP管中加入250μL Buffer B1，上下翻转十次混匀，静置4min，至溶液变得清亮；

(4)于EP管中加入350μL Buffer N1，迅速颠倒混匀，4℃、12000rpm离心15min；

(5)将离心后的上清液加入DNA收集柱中，4℃、12000rpm离心1min，弃废液；

(6)加入500μL Buffer KB于DNA收集柱，12000rpm离心1min，弃废液；

(7)加入500μL DNAWash Buffer于DNA收集柱，12000rpm离心1min，弃废液；

(8)重复步骤“7”一次；

(9)将收集柱12000rpm空离10min；

(10)将收集柱转移至1.5mL EP管，于通风处开盖风干5-10min，促进酒精挥发；

(11)于收集柱中加入50μL提前预热的双蒸水，12000rpm离心1min洗脱DNA。NanoDrop 2000测定质粒浓度，-20℃保存备用。

1.3.7重组质粒的鉴定

双酶切鉴定重组质粒，将鉴定结果正确的质粒送通用公司测序，测序正确后将重组质粒分别命名为pF-xGP5m、pF-TAT-xGP5m、pF-ppTG20-xGP5m、pF-MPG-xGP5m。

1.4重组Bacmids的构建

1.4.1位点特异性转座

按照本实施例1.3.5的方法，制备DH10Bac感受态，并将重组质粒转化进DH10Bac感受态，于37℃、200rpm培养4h，使其充分转座。提前配制含有50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、7μg/ml庆大霉素的LB平板，取50μL转座后的菌液与40μL 20mg/ml的X-gal及10μL 1M/L的IPTG充分混匀，均匀涂布于三抗平板上，37℃温箱倒置培养24-36h，之后置于4℃，使蓝色菌落更明显。

1.4.2蓝白斑二次筛选

在三抗平板上均匀涂布80μL 20mg/ml的X-gal及20μL 1M/L的IPTG，酒精灯外焰灼烧接种环，冷却后挑取蓝斑中心的白斑，划线接种于三抗平板上，37℃温箱倒置培养24-36h，当平板上全部为白色菌落时，挑取单个的白色菌落接种于含有三抗的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养3h，取出1μL菌液作为模板，以目的基因上游引物和M13通用下游引物进行菌液PCR验证(方法参照本实施例1.3.1)。选取强阳性菌液，吸取50μL接种于含三抗的LB培养液中，37℃、200rpm震荡培养16-18h，用于提取质粒。

1.4.3重组骨架质粒的提取

以碱裂解法提取重组骨架质粒，具体步骤如下：

(1)将新鲜菌液转移至1.5mL EP管中，12000rpm离心1min弃去培养液，收集所有菌体；

(2)于菌体中加入250μL Buffer A1(添加RnaseA)重悬菌体沉淀；

(3)于EP管中加入250μL Buffer B1，上下翻转十次混匀，静置4min，至溶液变得清亮；

(4)于EP管中加入350μL Buffer N1，迅速颠倒混匀，4℃、12000rpm离心15min；

(5)小心吸取上清转移至新的1.5mL EP管中，加入800μL酚氯仿，轻颠混匀，室温静置5min，12000rpm离心5min；

(6)再次吸取上清转移至新的1.5mL EP管中，加入700μL异丙醇，轻颠混匀，室温静置10min，12000rpm离心15min；

(7)弃去上清，于白色沉淀中加入700μL 70％乙醇洗涤，12000rpm离心10min；

(8)尽量完全吸去乙醇，于通风处开盖晾干10min，加入30μL提前预热的双蒸水，NanoDrop 2000测定浓度，4℃保存备用。

1.5重组杆状病毒的获得与鉴定

1.5.1重组骨架质粒转染Sf9细胞

脂质体介导法将重组Bacmids转染Sf9细胞，具体步骤如下：

(1)Sf9细胞铺24孔板，28℃培养至细胞汇合度达到80％-85％时转染；

(2)将5μL重组Bacmids与2μL P3000混合，加入纯Grace营养液补至25μL，充分混匀；

(3)将2μL Lip3000与23μL纯Grace营养液充分混合；

(4)将两种混合液充分混匀。室温静置5min；

(5)将混合液缓慢加入细胞板种，每孔50μL，以不转染的空细胞组作为对照。

(6)28℃温箱培养5-7天，若细胞孔液体不足，可适当补液。

1.5.2重组杆状病毒的获得

转染5-7天时，显微镜下观察细胞，可观察到细胞明显变大变圆、通透性增加、贴壁能力下降伴有明显漂浮。收集培养液，4℃、1000rpm离心5min即可获得F1病毒液。

将F1代病毒液按照1：10的比例接种于Sf9细胞，接毒4天左右待病变明显时，收集营养液离心即可获得F2病毒液，依此可获得连续传代的病毒液，可将病毒液于-80℃长期冻存。

1.5.3 Western blot鉴定重组蛋白

于T25细胞瓶中接种500μL病毒液，4天左右待病变明显时收集病毒液，并于细胞瓶中加入1mL PBS，冻融一次后将细胞全部吹下，超声破碎后分离超裂上清和沉淀，加入Loading Buffer后，100℃煮样10min，用于Western blot鉴定，方法如下：

(1)配置蛋白胶，上层浓缩胶丙烯酰胺浓度为5％，下层分离胶丙烯酰胺浓度为12.5％；

(2)将准备好的样品加入蛋白胶泳道中，25μL/孔；电压调节至80V直至样品进入分离胶再将电压调节至120V；

(3)转印：在转印仪上依此放置用转印缓冲液浸湿的海绵、NC膜、蛋白凝胶、海绵，23V恒压转印38min；

(4)封闭：将转印后的NC膜放置于5％脱脂乳中于37℃封闭2h，之后用PBST洗涤三次，每次10min；

(5)一抗孵育：将His-tag(1:1000)及PRRSV阳性猪血清(1:200)分别用PBST稀释，于37℃孵育NC膜2h，之后用PBST洗涤NC膜三次，每次10min；

(6)二抗孵育：将NC膜与PBST稀释的羊抗鼠IgG-HRP(1:1000)或HRP-SPA(1:10000)在37℃孵育1h，之后再用PBST洗涤NC膜三次，每次10min；

(7)曝光：提前将曝光仪打开预冷，于NC膜上滴加适量ECL化学发光液显色，曝光显色。

1.5.4间接免疫荧光鉴定重组杆状病毒

将重组杆状病毒以1:10比例接种于长满单层的Sf9细胞，接毒48h后弃营养液，使用灭菌PBS轻柔洗涤三次后，用-40℃预冷的无水乙醇于4℃固定细胞30min；弃去无水乙醇，再使用灭菌PBS洗涤三次并拍干；加入以灭菌PBS 1：200倍稀释的His-tag单克隆抗体，每孔100μL，于37℃温箱孵育1h，之后使用灭菌PBS洗涤三次并拍干；加入1:200稀释的FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗，于37℃温箱孵育30min后使用PBS洗涤3次后，在荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.5.5重组杆状病毒TCID50测定

Sf9细胞铺96孔细胞板，待细胞长满单层时准备接毒用于各重组杆状病毒TCID50的测定，方法如下：

(1)10倍比稀释各重组杆状病毒液，弃去96孔板中营养液，每孔加入各稀释度的病毒液100μL，每个稀释度设置8个重复；

(2)于28℃培养箱培养72h后进行间接免疫荧光试验，方法如1.5.4，细胞胞浆中出现绿色荧光则判定为阳性孔；

(3)Karber法计算各重组病毒TCID₅₀。

1.6小鼠免疫实验

1.6.1小鼠分组与免疫

将四种重组杆状病毒分别接种Sf9细胞(T75细胞瓶，500μl/瓶)，接毒96h病变明显后弃培养上清，每瓶细胞加入2mL PBS，冻融一次后，超声破碎收获2mL细胞破碎液，采用Wb半定量的方法将目的蛋白浓度调整一致(25μg/ml)，再分别与ISA206佐剂1:1混合充分乳化制备疫苗。将6周龄Balb/c雌鼠50只随机分为5组，每组10只，1-4组每只小鼠皮下免疫疫苗200μL，21d后加强免疫1次，第5组为空白对照组。

1.6.2 ELISA抗体效价检测

首免后21d及42d每组分别采血，4℃、5000rpm离心4min分离血清，测定血清ELISA抗体效价，以P/N大于2.1的最大血清稀释度作为血清的ELISA效价，具体步骤如下：

(1)包被：碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的PRRSV全病毒抗原稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板条，37℃包被2h；

(2)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入200μL PBST，震摇洗涤3次；

(3)封闭：每孔加入200μL 5％脱脂乳于37℃温箱封闭2h后洗涤；

(4)血清孵育：将分离的小鼠血清按照1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800依此2倍比稀释，每孔加入100μL稀释后的待测血清，并设置标准阴阳性血清对照，37℃孵育1h后洗涤；

(5)酶标抗体孵育：以PBST 1:1000倍稀释HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体作为二抗，100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤；

(6)底物显色：避光加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色10min；

(7)终止：每孔加入50μL终止液，酶标仪读取OD450nm，并计算P/N值。

2结果

2.1目的基因的扩增

PCR扩增四种xGP5m片段，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，条带与目的基因大小一致，xGP5m基因大小为642bp，TAT-xGP5m基因大小为675bp，ppTG20-xGP5m基因大小为702bp，MPG-xGP5m基因大小为723bp(如图3)。

2.2重组质粒鉴定

将PCR扩增得到的4种xGP5m基因片段分别连接至pFastBac^TMDual载体上的PH启动子的EcoR I和Hind III酶切位点下，引物如表1所示，获得重组质粒pF-xGP5m、pF-TAT-xGP5m、pF-ppTG20-xGP5m、pF-MPG-xGP5m。提取重组质粒并进行双酶切鉴定，酶切结果与目的基因条带一致(图4)，将酶切鉴定结果符合的重组质粒进行基因测序，测序结果均正确。

2.3重组杆状病毒鉴定

将碱裂解法提取的重组Bacmids转染Sf9细胞，培养5d后收获重组杆状病毒，连续传代后可观察到接毒的细胞明显变大变圆、通透性增加、贴壁能力下降并伴有明显漂浮，如图5A所示。获得4株重组杆状病毒rAc-xGP5m、rAc-TAT-xGP5m、rAc-ppTG20-xGP5m和rAc-MPG-xGP5m。重组病毒TCID₅₀分别为10^-8.5/ml、10^-9.0/ml、10^-8.5/ml和10^-8.75/ml。将接毒后培养72h的Sf9细胞，用His单抗进行间接免疫荧光试验，荧光显微镜下观察，重组杆状病毒感染细胞的胞浆中出现绿色荧光(图5B)。

2.4 Western-blot检测重组蛋白表达

将重组杆状病毒接种长满单层的Sf9细胞，96h后收样分别用His-Tag单抗、PRRSV阳性血清作为一抗进行Western blot鉴定，结果(图6)显示在上清和沉淀中均可检测到特异性条带，与目的蛋白大小一致，并且目的蛋白获得了较好的糖基化修饰，表明四种重组蛋白均可以表达，且rAc-TAT-xGP5m表达量最高。

2.5重组蛋白免疫原性分析

小鼠首次免疫后21d和42d采集小鼠血清，采用纯化的PRRSV全病毒作为包被抗原，进行间接ELISA检测PRRSV抗体，结果见图7，rAc-TAT-xGP5m免疫组抗体水平明显高于其它3个免疫组(P<0.05)，表明融合TAT穿膜肽可有效增强xGP5m免疫效果，rAc-TAT-xGP5m重组蛋白具有良好的免疫原性。

3讨论

我国自1995年首次暴发PRRSV以来，先后出现高致病性PRRSV和NADC30-like毒株流行。当前呈现多种基因亚型PRRSV流行，而且不同基因亚型毒株之间基因重组频发，新的变异毒株不断增多，猪场经济损失十分严重。

目前临床最常使用的PRRS疫苗主要是灭活和弱毒疫苗，但是这两类疫苗的安全性和有效性存在着一些缺陷，存在毒力返强的风险且保存和运输较为困难。并且由于PRRSV的快速进化、重组以及变异株的不断出现，导致传统的疫苗已经不能满足需求，因此开发更安全、可靠、高效和针对性强的PRRS疫苗迫在眉睫。Plana等运用杆状病毒表达PRRSV的ORF2～ORF7基因，证明GP5蛋白可对免疫母猪提供部分保护。但PRRSV流行毒株GP5基因变异较大，不同毒株间交叉免疫保护作用不够理想。因此本研究比对了PRRSV主要流行毒株S1(经典型)、BB0907(高致病型)和FJ1402(NADC30-like毒株)和LV毒株的GP5蛋白氨基酸序列，选取其共有的氨基酸组合为杂合GP5序列，构建重组杆状病毒，实现了GP5与3种穿膜肽的融合表达，其中TAT-xGP5m重组杆状病毒感染细胞目的蛋白呈现可溶性表达，具有PRRSV抗原性和免疫原性，为PRRSV新型疫苗研制奠定了基础。

穿膜肽一般由碱性氨基酸组成，可携带大分子直接穿越磷脂双分子层实现跨膜转运，并且能通过提高免疫细胞的聚集来调控先天性和适应性免疫应答。Keogan等报道穿膜肽TAT能够抑制HIV-1复制。赵武等研究发现融合表达穿膜肽VP22与PRRSV GP5能增强GP5蛋白诱导的体液免疫和细胞免疫反应。

PRRSV GP5蛋白为糖基化跨膜蛋白，基因工程表达产物一般与细胞膜结合，表达效率较低。本研究将三种穿膜肽(TAT、ppTG20、MPG)序列添加至杂合GP5蛋白的N端，成功构建4种重组杆状病毒。其中TAT-xGP5m上清和沉淀的表达量均明显高于xGP5m、ppTG20-xGP5m和MPG-xGP5m，实现了GP5蛋白的高水平和可溶性表达。TAT-xGP5m重组杆状病毒感染细胞的裂解物免疫小鼠，其PRRSV抗体水平明显高于xGP5m免疫组，说明TAT能促进GP5蛋白可溶性表达，增强其小鼠体液免疫应答能力。

实施例二、高致病性PRRSV M/杂合GP5蛋白的重组杆状病毒的构建及免疫特性

将HP-PRRSV BB0907毒株ORF6基因N端添加穿膜肽TAT序列，克隆到昆虫杆状病毒表达系统pFastBac^TMDual载体的PH启动子下游，获得重组质粒pF-TAT-BM；在杂合GP5蛋白的A、B表位之间插入GP4蛋白抗原表位(23-50aa)基因序列，N端添加穿膜肽TAT序列，将其克隆至重组质粒pF-TAT-BM的P10启动子下游，获得重组转移质粒命名为pF-BMP541，再经过位点特异性转座以及蓝白斑筛选获得重组Bacmids，转染Sf9细胞收获共表达PRRSV GP5和M蛋白的重组杆状病毒，命名为BMP541；Western-blot和间接免疫荧光鉴定证明目的蛋白均可实现高水平可溶性表达。蔗糖梯度离心纯化目的蛋白，电镜观察其能够形成VLPs。将BMP541感染细胞表达蛋白产物与佐剂混合制备疫苗，免疫接种30～35日龄PRRSV和PCV2阴性健康仔猪，间隔21d，加强免疫。首次免疫后21天可检测到ELISA抗体，加强免疫后抗体水平进一步升高，但BMP541免疫组的抗体水平低于PRRSV TJM-F92活疫苗组。首免后42d采集血液进行淋巴细胞增殖试验，采用PRRSV BB0907毒株刺激，证明BMP541免疫组淋巴细胞增殖反应显著高于非免疫对照组(P<0.05)。首免后42d采用HP-PRRSV毒株攻击，BMP541疫苗组病毒血症和肺脏组织病毒载量显著低于非免疫攻毒对照组(P<0.05)，但高于PRRSV TJM-F92活疫苗免疫组。HP-PRRSV攻毒组仔猪出现体温升高，肺脏组织病变观察，出现明显间质性肺炎，而BMP541和TJM-F92免疫组仔猪个别出现体温升高，临床症状和肺脏组织病变明显减轻。首免后42d采用PRRSV类NADC30毒株FJ1402攻击，BMP541疫苗组仔猪临床症状、病毒血症和肺脏组织病毒载量与非免疫攻毒对照组无明显差异。上述结果表明，BMP541疫苗组对HP-PRRSV毒株有较好的免疫保护作用，但其免疫保护效力低于PRRSV TJM-F92活疫苗免疫组，对类NADC30毒株攻击的保护作用较低。

PRRSV基因容易变异，对生猪健康养殖造成极大危害，目前尚无理想疫苗。GP5是PRRSV变异最大的一个结构蛋白，含有A和B两个重要抗原表位，B表位高度保守，可能是诱发中和抗体的主要靶标，在B表位之前还有一个非中和性表位A，可能是一个“诱骗表位”，推迟机体产生针对表位B的中和抗体，本发明研究发现将A、B表位之间插入一段序列可诱导机体产生快速和高滴度的中和抗体。M蛋白分子量大小约为18～19KDa，在欧洲型和美洲型毒株之间，M蛋白是最为保守的，也是引起免疫应答的主要抗原。M蛋白和GP5蛋白可以二硫键的形式连接成异源二聚体存在于病毒粒子感染的细胞中，这个二聚体可能在病毒黏附宿土细胞以及病毒粒子装配的过程中起作用，并且M蛋白可增强GP5蛋白的免疫保护效力。GP4是由ORF4编码的非主要结构蛋白，分子量约为31KDa，研究表明GP4蛋白可诱导中和抗体的产生。目前，PRRSV基因工程疫苗靶向抗原主要选择GP5和M蛋白等。

本研究在杂合GP5蛋白的A、B表位之间插入GP4蛋白的23-50aa抗原表位，同时分别在杂合xGP5和M蛋白的N端添加穿膜肽TAT，然后将杂合xGP5和M蛋白分别克隆至pFastBac^TMDual载体的P10启动子和PH启动子下游，成功构建重组杆状病毒BMP541，实现了重组蛋白的可溶性表达，为PRRSV亚单位疫苗研制奠定了重要基础。

1材料与方法

1.1主要材料

PRRSV BB0907及FJ1402毒株，本实验室分离保存的常规毒株。PRRSV疫苗株TJM-F92由华威特生物工程有限公司惠赠。猪γ干扰素及猪白细胞介素4ELISAKit均购自博奥森生物技术公司。猪外周血淋巴细胞分离试剂盒为北京索莱宝科技有限公司产品。其他常规试剂均为国产或进口分析纯。引物合成及基因测序均在南京金斯瑞生物科技有限公司进行。

30～35日龄仔猪，PRRSV和PCV2核酸和抗体阴性，购自江苏省如皋县农户。

1.2重组杆状病毒构建

1.2.1目的基因设计与重组转移质粒构建

HP-PRRSV BB0907毒株ORF6基因N端添加穿膜肽TAT序列，C端引入Flag标签序列，并根据昆虫细胞密码子优化，优化后基因序列如SEQ ID NO.5所示，将其克隆到昆虫杆状病毒表达系统的pFastBac^TMDual载体上的PH启动子的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点下，获得重组质粒pF-TAT-BM(该重组质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。通过融合PCR在之前设计的杂合GP5的A表位和B表位基因序列之间插入GP4抗原表位(23-50aa)基因序列，N端添加穿膜肽TAT序列，所需引物如表2所示，将其克隆至重组质粒pF-TAT-BM的P10启动子的KpnⅠ和XhoⅠ两个酶切位点下，获得重组转移质粒pF-BMP541，PCR步骤及重组转移质粒构建步骤如实施例一1.3，之后进行基因测序，测序正确后用于重组病毒构建。

SEQ ID NO.5

TACGGTCGTAAGAAGCGCCGTCAGAGGAGACGCATGGGTTCCAGCCTGGACGACTTCTGCAACGACTCCACCGCTCCCCAGAAGGTGCTGCTGGCCTTCAGCATCACCTACACTCCTGTGATGATCTACGCTCTGAAGGTCTCCAGAGGACGCCTGCTGGGTCTGCTGCACCTGCTGATCTTCCTGAACTGCGCCTTCACCTTCGGTTACATGACTTTCGTGCACTTCGAGAGCACCAACAGAGTCGCTCTGACTATGGGTGCTGTGGTGGCTCTGCTGTGGGGCGTGTACTCTGCCATCGAAACCTGGAAGTTCATCACTTCACGTTGCAGGCTGTGCCTGCTGGGCCGCAAGTACATCCTCGCTCCAGCTCACCACGTGGAGTCTGCTGCCGGATTCCACCCTATCGCTGCCAACGACAACCACGCTTTCGTGGTCCGTAGGCCTGGTTCTACCACTGTGAACGGCACTCTGGTCCCCGGACTGAAGTCACTGGTGCTGGGTGGCAGGAAGGCTGTCAAGCAGGGCGTGGTCAACCTGGTCAAGTACGCCAAGGATTACAAGGACGACGATGACAAGTAA

表2 PCR引物序列

1.2.2重组杆状病毒的构建

按照实施例一中1.4及1.5的步骤构建重组杆状病毒，将其命名为rAc-BMP541。将获得的重组病毒于Sf9细胞上扩增至第三代，-80℃冻存。

1.2.3 Western-blot检测重组蛋白表达

将重组杆状病毒接种长满单层的Sf9细胞，96h后收样，灭菌PBS收集细胞，-40℃冻融一次后进行超声破碎，4℃、12000RPM离心5min分离上清沉淀，沉淀再用相同体积的PBS重悬，分别加入适量loading buffer，100℃煮样10min，进行Western blot鉴定，分别用His-Tag单克隆抗体、Flag单抗，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体，最后用ECL化学发光显色。

1.2.4间接免疫荧光鉴定重组杆状病毒

将重组杆状病毒接种长满单层的Sf9细胞，待出现病变后弃营养液，灭菌PBS洗涤三次后用预冷的无水乙醇于4℃固定30min，弃去无水乙醇，灭菌PBS洗涤三次，加入以灭菌PBS 1：200倍稀释的His-tag单抗、Flag单抗，37℃孵育1h，灭菌PBS洗涤三次，加入1:200稀释的FITC标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min后用PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察结果。

1.2.5病毒样颗粒的电镜观察

悬浮培养Sf9细胞，将重组杆状病毒以1:50的体积比接种Sf9细胞，4天后离心收集细胞，进行10倍浓缩，PBS重悬后进行超声破碎，裂解细胞释放目的蛋白，蔗糖梯度离心对目的蛋白进行纯化，步骤如下：

(1)将可溶性目的蛋白在4℃、12000rpm离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；

(2)用0.45μm的滤器过滤离心后的上清液以除去大颗粒杂蛋白；

(3)将滤液在4℃、40000rpm超离2h，使用1/10原体积的无菌PBS重悬沉淀；

(4)4℃过夜重悬蛋白样；

(5)分别将2.5mL的60％、50％、40％、30％的蔗糖溶液(0.45μm的滤器过滤)缓慢加入超速离心管的底部，用以制备蔗糖梯度；

(6)将2.5mL浓缩后的蛋白液缓慢加入到铺好的蔗糖梯度上，4℃、40000rpm超速离心2h；

(7)将不同蔗糖梯度间的白色的纯化蛋白条带吸出，各使用10mL无菌PBS重悬；

(8)4℃、40000rpm超速离心2h以除去蔗糖，再用100μL无菌PBS重悬沉淀。

将收集到的纯化样品进行Western blot鉴定，收取30％～40％蔗糖密度之间的目的蛋白层，脱糖后用1/100原体积的PBS重悬，取样用磷钨酸负染，在电镜下观察是否存在VLPs。

1.3猪体免疫保护实验

1.3.1疫苗制备与动物分组

取细胞破碎液与GEL02佐剂9:1充分混合，并添加免疫增强剂VSP(250μg/头)按比例混合制备疫苗，将30～35日龄仔猪25只随机分为5组(如表3)，每组5只，第1、3组每只颈部肌肉免疫BMP541细胞破碎液2mL，第2组为阳性对照组，每只颈部肌肉免疫弱毒苗TJM-F92病毒液2mL，第4、5组为非免疫攻毒对照组，颈部肌肉注射无菌0.01mol/LPBS溶液，21d后加强免疫1次。第1、2、4组首免后42d人工感染PRRSV BB0907病毒液(105.5TCID50/mL)，颈部肌肉注射2mL，滴鼻2mL。第3、5组人工感染PRRSV NADC30样毒株FJ1402病毒液(105.5TCID50/mL)，颈部肌肉注射2mL，滴鼻2mL。隔离饲养，每天上午固定时间测量体温，观察猪体状态并记录。第0、3、7、10、14d采血并分离血清，用于病毒血症检测。攻毒后第14d扑杀所有猪，观察各组织病理变化。

表3实验分组及疫苗配比

1.3.2 PRRSV特异性ELISA抗体

首免后21d及42d每组分别采血测定血清ELISA抗体水平,以纯化后的PRRSV全病毒作为包被抗原进行间接ELISA分别检测首免后21d及42d猪血清抗体水平。具体操作步骤如下：

(1)包被：碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的PRRSV全病毒抗原稀释至2μg/mL，100μL/孔加入酶标板条，37℃包被2h；

(2)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入200μL PBST，震摇洗涤3次；

(3)封闭：每孔加入200μL 5％脱脂乳于37℃温箱封闭2h后洗涤；

(4)血清孵育：将分离的猪血清用PBST以1:100比例稀释，每孔加入100μL稀释后的待测血清，并设置标准阴阳性血清对照，37℃孵育1h后洗涤；

(5)酶标抗体孵育：以PBST 1:10000倍稀释HRP-SPA作为二抗，100μL/孔，37℃孵育30min后洗涤；

(6)底物显色：避光加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色10min；

(7)终止：每孔加入50μL终止液，酶标仪读取OD450nm，并计算P/N值。

1.3.3 PRRSV中和抗体的测定

待检血清56℃30min灭活处理，0.22μm滤器过滤除菌，取360μL血清加入到360μL含4％FCS的DMEM培养液中依次做二倍比稀释。将已知滴度的BB0907和FJ1402稀释成200TCID50/100μL，在稀释好的血清中加入等体积的病毒液，混匀，37℃共孵育1h。将孵育过的血清病毒混合液按100μL/孔，加入长满单层Marc-145细胞的96孔培养板中，每组3个重复，同时设定：空细胞对照、只接毒对照、阴性血清及病毒-阴性血清对照。置于37℃，5％CO2恒温培养箱培养，48h后进行IFA试验，判定标准为：阴性血清和空细胞对照孔没有特异性荧光，与阳性孔相比，能抑制50％PRRSV感染的血清最大稀释度为中和效价。

1.3.4淋巴细胞增殖实验

首次免疫后第42d，从颈静脉采血5mL并加入1％肝素抗凝剂，按照索莱宝猪外周血淋巴细胞分离试剂盒操作说明书分离淋巴细胞。将分离的淋巴细胞调整密度至5×106个/mL，于96孔细胞板中分别加入100μL淋巴细胞，而后分别加入100μL的Con A(终浓度为5μg/mL),100μL的PRRSV BB0907病毒液，100μL的PRRSV FJ1402病毒液(1M.O.I、1640稀释)及100μL1640作为非特异性刺激组、特异性刺激组及空白对照组，每个样本做三个重复孔。将96孔细胞培养板置于恒温培养箱37℃、5％CO2培养48h后每孔避光加20μL cck-8，37℃培养4h后测各孔OD450，并计算刺激指数SI＝刺激孔OD值/未刺激孔OD值。

1.3.5病理学观察

攻毒后第14d扑杀所有猪，观察器官肉眼病理变化，并采集肺脏组织，一部分4％甲醛固定，用于制作病理切片、进行HE染色并进行显微镜观察；一部分冻存，用于RNA提取检测肺脏病毒载量。病理切片的制备步骤如下：

(1)固定：取1cm×2cm2的肺脏组织小块，使用4％多聚甲醛中固定24h以上。

(2)修块：将组织块修整成更小块的组织，保持切面平整，放入包埋盒。再次将组织块固定8h。为了去除残留甲醛，使用流水连续冲洗组织块12h以上。

(3)脱水：对组织块进行梯度酒精脱水，依次放入70％酒精、80％酒精、90％酒精，各2h，捞出放入95％酒精1h，最后使用无水乙醇对组织块进行最终脱水。

(4)透明及浸蜡：脱水完成后使用二甲苯对组织块进行透明，此步骤要根据不同器官组织特性决定透明的时间。提前打开温箱融化液体石蜡，夹取透明好的组织块放入融化的石蜡中，65℃浸蜡3h。

(5)包埋：包埋前将温箱温度调高至70℃，先将融化的石蜡倒入包埋框中，再整齐摆入组织块，石蜡凝固进行修块。

(6)切片：切片前将组织块在-20℃冰箱冷冻1h，切片机调至3mm厚度，匀速转动切片机，直至切出理想的组织蜡片，用蘸有60％酒精的载玻片将组织片转移入45℃温水中充分展开，取一块新的载玻片轻轻贴附在组织块表面将其从水中取出，将载玻片置37℃温箱中烤片过夜。

(7)苏木精-伊红染色：首先将切片浸泡入二甲苯20min脱去石蜡，依次放入酒精/二甲苯、无水乙醇、95％酒精、85％酒精、75％酒精以及蒸馏水中，分别浸泡4min，在苏木精染液中染色6min后用流水洗去多余染液，将玻片放入1％盐酸酒精5s后用流水冲洗5～10min，放入90％酒精，迅速取出并放入1％伊红染色4s，染色结束后，经无水乙醇脱水，再次放入二甲苯中浸泡20min。

(8)封片：组织处滴加中性树脂，盖上盖玻片，切记不要产生气泡，制作完成后玻片置室温烘干。

1.3.6 RT-PCR检测PRRSV载量

将血清和肺脏样品进行预处理后，按照RNA Kit I提取试剂盒操作步骤提取病毒RNA，并进行反转录，SYBR Green实时PCR检测血清和肺脏中PRRSV核酸含量。按照OMEGARNA Kit I提取试剂盒操作步骤提取病毒RNA，具体如下：

(1)样品预处理，血清：采集攻毒后第4、7、10、14天的猪前腔静脉血，4℃、4,000g，离心5min，收集上清液。肺脏：秤取1g新鲜肺脏组织于5ml离心管中，用灭菌剪刀剪碎，加入3ml预冷的灭菌PBS，使用匀浆机得到组织匀浆，匀浆后冻融三次，离心后收集上清液。

(2)取200μL血清及肺脏匀浆上清于EP管中，加入350μL TRK Lysis Buffer，涡旋仪震荡混匀后加入RNA Homogenizer Spin Column，12,000rpm离心2min。

(3)收集管中加入700μL70％无水乙醇，震荡混匀，转移入MiniColumn，10,000g，离心1min，弃液，重复此步骤将混合液全都离心过柱。

(4)吸取500μL RNA Wash BufferⅠ加入到Mini Column，10,000ɡ离心1min，弃液。

(5)向柱中加入500μL RNA Wash BufferⅡ，10,000g离心1min，弃液。

(6)重复步骤(5)。

(7)将Mini Column柱转移到新的EP管中，通风处开盖晾干3min，促进乙醇挥发。

(8)向柱中加入30μL 70℃预热的DEPC水，静置2min，13,000rpm离心1min收集洗脱液，即为提取的RNA。

(9)反转录：在PCR管中加入提取的RNA模板8μL，5×qRT Super Mix 2μL，混合均匀后离心。反应程序：50℃，15min；85℃，5s，产物即为病毒cDNA。

之后取实验室保存的重组质粒制备标准品，测定质粒浓度并转化成拷贝数，dd水进行10倍比稀释至10²～10⁸copies/μL作为阳性标准品备用。质粒拷贝数＝6.02×1023×[质粒浓度(ng/μL)×10^-9]/(质粒全长×660)。通过实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)对血清、肺脏中PRRSV的mRNA含量进行测定，反应体系：SBYR Green Master Mix 10μL，ddH2O7.8μL，cDNA1μL，ROX2 0.4μL，上下游引物各0.4μL，总计20μL。

Real-Time PCR引物序列见表4：

表4荧光定量引物

按照95℃5min，95℃10s，60℃31s，40个循环的反应程序。每组样品设3个重复，同时设立标准品以及阴性对照。最后根据标准品Ct值绘制标准曲线，带入每个样品的Ct值计算相应的病毒拷贝数。

1.4数据分析

利用GraphPadPrism7软件对实验数据处理分析，比较组别间差异性。(P>0.05无差异、^*P＜0.05、^**P＜0.01)

2结果

2.1重组杆状病毒的构建

2.1.2重组转移质粒的鉴定

融合PCR方法将BB0907毒株ORF4的67-150位碱基插入TAT-xGP5m片段的A、B表位之间，克隆至重组质粒pF-TAT-BM的P10启动子下，获得重组质粒pF-BMP541(见图8)，TAT-xGP54m基因大小为777bp，双酶切鉴定及测序结果均正确。

2.1.2重组杆状病毒构建

将重组转移载体转化入DH10Bac，获得重组Bacmids，以pUC/M13引物对重组Bacmids进行PCR鉴定。鉴定正确后将重组Bacmids转染Sf9细胞，5d后收获重组杆状病毒，将病毒连续传代两次后可观察到细胞明显变大变圆、通透性增加、贴壁能力下降伴有明显漂浮(见图9A)。将重组杆状病毒接种长满单层的Sf9细胞，出现病变后进行间接免疫荧光试验，荧光显微镜下可观察到绿色荧光阳性细胞(见图9B)。

2.1.3 Western-blot检测重组蛋白表达

将重组杆状病毒接种长满单层的Sf9细胞，96h后收样分别用His-Tag单抗、Flag单抗作为一抗进行Western blot鉴定，结果(见图10)显示，细胞裂解物离心上清液和沉淀物中均可检测到特异性条带，与目的蛋白大小一致，表明目的蛋白GP5和M均可以可溶性表达。

2.1.4病毒样颗粒的电镜观察

将rAc-BMP541病毒接种Sf9细胞培养96h，收获细胞，制备细胞裂解液，离心后取100mL上清液，使用0.22m滤膜过滤去除细菌及大颗粒杂蛋白后，超速离心进行10倍浓缩，再经过蔗糖密度梯度离心纯化，目的蛋白主要分布于30％-40％蔗糖层之间，进行电镜观察，可见重组杆状病毒表达产物形成的VLPs，直径20～30nm(见图11)。

2.2猪体免疫接种后免疫应答检测结果

2.2.1 PRRSV ELISA抗体与中和抗体水平

PRRSV ELISA抗体以血清稀释100倍时的S/N值表示(见图12)。可见首免后21d，BMP541和TJM-F92免疫组PRRSV特异性抗体水平均显著高于PBS组(P<0.001)；首免后42d，各组抗体水平进一步提高，TJM-F92免疫组抗体水平高于BMP541免疫组，均显著高于PBS组(P<0.001)。

首免后42d采集猪血清，采用PRRSV BB0907毒株分别测定各组PRRSV中和抗体效价，结果如表5所示。BMP541组平均中和抗体效价为1:8.8，TJM-F92平均中和抗体效价为1:6.4，PBS攻毒对照组未检测到中和抗体。

表5各组猪血清PRRSV中和抗体效价

2.2.2 PRRSV特异性淋巴细胞增殖

首免42d后进行淋巴细胞增殖实验，计算刺激指数SI，结果如图13所示，可以检测到显著的淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。

2.3 HP-PRRSV BB0907毒株攻毒试验结果

临床症状：攻毒BB0907后各组仔猪体温变化如图14A所示：BMP541免疫组攻毒后体温升高，第6-7d有三头猪体温在40℃以上，第八天以后逐渐恢复正常，有两头猪呼吸急促，其余猪无明显异常。TJM-F92免疫组体温略有升高，临床表现无明显异常。PBS非免疫攻毒对照组体温上升明显，第4-9d体温普遍在40℃以上，体表发红、被毛粗乱、呼吸急促。

病理学变化：PBS非免疫攻毒对照组出现肺脏瘀血、肿胀、表面有散在虾肉样实变，肺泡壁增厚明显，间质增宽，并伴有炎性细胞浸润。TJM-F92免疫攻毒组肺间质稍有增宽，BMP541免疫攻毒组肺部有散在实变，肺间质稍有增宽(见图14D)。

病毒血症：荧光定量PCR检测结果如图14B，攻毒第7-10d，BMP541免疫组病毒血症低于PBS非免疫攻毒对照组(P<0.05)，TJM-F92组病毒血症显著低于PBS攻毒组(P<0.001)；攻毒后第14d，BMP541免疫组显著低于PBS攻毒组(P<0.01)。

肺脏病毒载量：荧光定量PCR检测结果如图14C，免疫组肺脏病毒载量均显著低于PBS攻毒组(P<0.05)，且BMP541免疫组的肺脏病毒载量最低。

2.4 PRRSV类NADC30毒株FJ1402攻毒试验结果

攻毒FJ1402后，BMP541免疫组体温升高，第6-8d有两头猪体温在40℃以上。PBS攻毒对照组体温上升明显，第5-9d体温普遍40℃以上，并伴有体表发红、呼吸急促、精神不振(见图15A)。

荧光定量PCR检测攻毒FJ1402后病毒血症和肺脏病毒载量，结果显示：BMP541组与PBS组无差异，血液和肺脏中病毒载量均很高(见图15B、C)。

BMP541免疫攻毒组和PBS非免疫攻毒对照组均出现肺脏瘀血、肿胀、表面出现虾肉样实变，肺泡壁增厚，间质增宽，并伴有炎性细胞浸润(见图15D)。

3讨论

自1995年我国首次出现PRRSV爆发以来，先后出现HP-PRRSV和NADC30-like毒株来的广泛流行，同时病毒亚群之间的重组频发，新的变异毒株不断被分离，增加了猪场的防控难度。虽然现有的PRRS灭活苗和弱毒苗有一定的免疫保护效果，但它们无法应对当前PRRSV毒株复杂的变异情况。因此，国内外仍致力于研制更安全、免疫保护力高的新型疫苗，如基因疫苗、活载体疫苗和亚单位疫苗等。

基因工程亚单位疫苗安全性高，但免疫原性较低。为了提高PRRSV亚单位疫苗免疫效果，一般需要制备获得病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)重组蛋白。VLPs是某种病毒的一个或多个蛋白装配而成的空心颗粒，它既有类似天然病毒的稳定性、免疫原性和生物学活性，又不含有病毒核酸，没有感染性和细胞毒性，还具备携带外源多肽或蛋白的潜能。已有研究报道GP5可与M蛋白形成VLPs。Binjawadagi等利用杆状病毒表达GP5-GP4-GP3-GP2-GP2a-M和GP5-M构建了PRRS病毒样颗粒(PRRS-VLP)，并将PRRS-VLP包裹在PLGA纳米颗粒中鼻腔给药，能使猪体产生高水平的IgG和IFN-γ，并降低攻毒后的肺脏病毒载量。本研究在杆状病毒的PH和P10启动子下实现PRRS病毒M蛋白、GP5蛋白以及GP4蛋白部分抗原表位的共表达，通过在N端添加穿膜肽TAT，实现了目的蛋白的高水平可溶性表达，蔗糖梯度离心纯化目的蛋白后进行电镜观察，结果显示能够形成大量VLPs。

免疫佐剂是提高亚单位疫苗免疫保护效率的关键因子，可通过非特异性方式，改变或强化特异性免疫应答，是研发兽用疫苗的热点。目前已发现有多种佐剂能增强PRRS疫苗的特异性免疫反应，比如Toll样受体(TLR)激动剂、人参皂苷等。Sandra等研究表明使用Toll样受体激动剂(CpG ODN)作为PRRSV灭活苗的佐剂，能有效提升猪体IFN-γ水平，并降低病毒血症。Zhu等研究发现西洋参总皂苷能增强和改善PRRSV弱毒苗和灭活苗的免疫应答能力，并且激活Th1/Th2和Tc1/Tc2应答，是PRRSV疫苗的候选佐剂。GEL02佐剂是水溶性聚合物佐剂，能很好的诱发体液和细胞免疫应答。VSP免疫增强剂是一种皂苷佐剂，是来源于植物的甾烷类化合物的糖苷，能显著增加Th1/Th2型免疫应答能力，对于抗病毒、抗肿瘤疫苗有着良好的免疫增强效果，可有效防治动物传染病。本研究使用GEL02和VSP免疫增强剂作为佐剂与BMP541充分混合制备疫苗进行猪体免疫保护实验，结果显示GEL02和VSP联合使用能够协助GP5/M蛋白产生较好免疫应答。但相对PRRSV TJM-F92活疫苗，BMP541免疫保护效力还不够理想，可能与疫苗保护抗原分子设计和免疫剂量有一定关系。

综上所述，本研究成功构建表达HP-PRRSV的GP5和M蛋白重组杆状病毒BMP541，与VSP70佐剂混合制备亚单位疫苗，结果显示，该疫苗免疫组能诱导猪体产生高水平的细胞免疫及体液免疫，并且能显著降低HP-PRRSV感染组的病毒血症以及肺脏病毒载量，证明其对PRRSV有较好免疫保护作用，为PRRSV亚单位疫苗的研制奠定了重要基础。但遗憾的是，BMP541免疫仔猪不能充分抵抗NADC30样变异株感染及其致病作用，如何提高该疫苗交叉免疫保护作用尚需要进一步研究。

实施例三、PRRSV类NADC30毒株M和杂合GP5蛋白重组杆状病毒的构建及免疫特性

本研究将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的ORF6基因克隆于pFastBac^TMDual载体的PH启动子下，在xGP5m蛋白A、B表位基因序列之间插入GP4蛋白抗原表位(1-9aa，23-50aa)基因序列，克隆至P10启动子下，同时分别在GP5和M蛋白的N端添加穿膜肽TAT序列，构建获得重组杆状病毒FMP542，Western-blot和间接免疫荧光鉴定证明目的蛋白获得可溶性表达。将表达产物与佐剂混合制备疫苗，两次免疫接种30～35日龄PRRSV和PCV2阴性健康仔猪，间隔21d。首次免疫后21天可检测到ELISA抗体，加强免疫后抗体水平进一步升高，且BMP541+FMP542免疫组抗体水平最高，首免后42d进行淋巴细胞增殖实验，采用BB0907和FJ1402病毒抗原刺激，BMP541+FMP542免疫组淋巴细胞增殖反应显著提高。首免后42d攻毒，BMP541+FMP542疫苗组对HP-PRRSV毒株和PRRSV类NADC30毒株均有较好的免疫保护作用，能有效降低病毒血症和肺脏病毒载量并减轻临床症状，为PRRSV新型疫苗研究奠定了重要基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因容易变异，新型流行毒株不断增多，防控难度加大。2013年以来我国部分省份出现一种新的毒株，这些分离毒株在Nsp2处均存在131个氨基酸的不连续缺失，且与2008年美国报道的PRRSV NADC30的核苷酸相似度极高，因此将其命名为NADC30-like毒株，近年来这一毒株逐渐成为了局部地域的优势毒株，商品化弱毒苗和灭活苗对该毒株的免疫保护效果降低。

2014年本实验室从福建省发病仔猪病料中分离获得PRRSV FJ1402毒株，基因组序列分析表明该毒株由北美NADC30菌株与我国高致病性PRRSV(HP-PRRSV)重组产生，隶属于类NADC30毒株。本研究利用杆状病毒表达系统，构建了表达M、GP5及GP4蛋白抗原表位的重组杆状病毒FMP542株，通过在目的蛋白N端添加穿膜肽TAT，实现了目的蛋白的可溶性表达。将表达产物与免疫佐剂充分混合制备疫苗，猪体试验结果表明，该重组病毒蛋白具有良好的免疫保护作用。

1材料与方法

1.1主要材料

皂苷免疫增强剂为萨恩化学技术(上海)有限公司产品。30～35日龄仔猪30头，PRRSV和PCV2核酸和抗体均为阴性，购自江苏省如皋县农户。

1.2重组杆状病毒构建

1.2.1目的基因设计与重组转移质粒构建

PRRSV NADC30样毒株FJ1402的ORF6基因N端添加穿膜肽TAT序列，C端引入Flag标签序列，并根据昆虫细胞密码子优化(如图16)，优化后基因序列如SEQ ID NO.6所示，将其克隆到昆虫杆状病毒表达系统的pFastBac^TMDual载体上的PH启动子的EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点下，获得重组质粒pF-TAT-FM(该重组质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。采用融合PCR在之前构建的杂合GP5蛋白的A表位和B表位基因序列之间插入GP4抗原表位(1-9aa，23-50aa)基因序列，N端添加穿膜肽TAT序列，所需引物如表6所示，将其克隆至重组质粒pF-TAT-FM的P10启动子的KpnⅠ和XhoⅠ两个酶切位点下，获得重组转移质粒pF-FMP542，PCR步骤及重组转移质粒构建步骤如实施例一1.3，之后进行基因测序，测序正确后用于重组病毒构建。

SEQ ID NO.6

ATGTACGGGCGCAAAAAGCGTAGGCAGCGGCGTAGGATGGGAAGTTCGATAGATGATTTTTGTAACGATAGTACGGCTGTGCAGAAGGTCTTGCTGGCATTTTCAATTACATATACCCCCATTATGATATACGCGCTCAAAGTATCACGGGGTCGGCTACTTGGTTTACTACATCTACTTATATTCTTGAATTGCGCTTTCACATTCGGCTATATGACCTTTGTCCATTTCCAAAGCACAAACAAAGTTGCGCTTACGCTCGGGGCTGTGGTTGCGCTCCTGTGGGGCGTTTATTCTGCCCTTGAGACTTGGCGATTTATCACTAGCCGATGCAGGTTATGTCTCTTAGGTCGCAAATACATCTTGGCCCCCGCACACCACGTCGAATCGGCCGCGGGGTTTCACCCGATTACCGCCTCCGACAACCATGCATTCGTAGTACGTCGCCCTGGCTCTACTACGGTGAATGGCACATTAGTTCCTGGACTAAAATCCCTGGTGTTGGGTGGACGAAGAGCAGTAAAGAGAGGGGTTGTCAATTTAGTTAAATACGCTAAGGACTATAAGGATGACGATGACAAGTGA

表6 PCR引物序列

1.2.2重组杆状病毒的构建

方法同前。

1.2.3Western-blot检测重组蛋白表达

方法同前。

1.2.4间接免疫荧光鉴定重组杆状病毒

方法同前。

1.3猪体免疫保护实验

1.3.1疫苗制备与动物分组

取重组杆状病毒感染细胞裂解蛋白液1.7mL(含GP5蛋白约15μg/ml)、GEL佐剂0.2mL、皂苷免疫增强剂0.1mL充分混合制备疫苗，4℃保存备用。

取30～35日龄仔猪30头，随机分为6组，每组5头，第1组每只颈部肌肉注射BMP541疫苗2mL，第2组每头颈部肌肉注射FMP542疫苗2mL，第3、4组每头颈部肌肉注射BMP541+FMP542混合疫苗2mL(BMP541+FMP542混合抗原中，单一抗原含量与单苗抗原含量相同)。第5、6组为非免疫攻毒对照组，肌肉注射无菌0.01mol/L PBS溶液，21d后加强免疫1次。第1、3、5组首免后42d感染HP-PRRSV BB0907病毒液(10^-5.5TCID₅₀/mL)，颈部肌肉注射2mL，滴鼻2mL。第2、4、6组感染PRRSV FJ1402病毒液(10^-5.5TCID₅₀/mL)，颈部肌肉注射2mL，滴鼻2mL。隔离饲养，每天上午测量体温，观察猪体状态并记录。第0、3、7、10、14d采血并分离血清，用于病毒血症检测。攻毒后第14d扑杀所有猪，观察各组织病理变化。

1.3.2 PRRSV特异性ELISA抗体

首免后21d及42d每组分别采血测定血清ELISA抗体水平，以纯化后的PRRSV全病毒作为包被抗原进行间接ELISA分别检测首免后21d及42d猪血清抗体水平。

ELISA具体步骤见实施例二中的1.3.2

1.3.3 PRRSV中和抗体的测定

方法同前。

1.3.4淋巴细胞增殖实验

首免后42d，从颈静脉采抗凝血5mL，分离淋巴细胞并调整密度至5×106个/mL，于96孔细胞板中分别加入100μL淋巴细胞，而后分别加入100μL的PRRSV BB0907病毒液，100μL的PRRSV FJ1402病毒液(1M.O.I、1640稀释)及100μL1640作为特异性刺激组及空白对照组，每个样本做三个重复孔。将96孔细胞培养板置于恒温培养箱37℃、5％CO₂培养48h后每孔避光加20μL cck-8，37℃培养4h后测各孔OD₄₅₀，并计算刺激指数SI＝刺激孔OD值/未刺激孔OD值。

1.3.5病理学观察

方法同前。

1.3.6 RT-PCR检测PRRSV载量

方法同前。

1.4数据分析

利用GraphPadPrism7软件对实验数据处理分析，比较组别间差异性。(P>0.05无差异、^*P＜0.05、^**P＜0.01)

2结果

2.1重组杆状病毒的构建

2.1.1重组转移质粒的鉴定

采用融合PCR方法将FJ1402株ORF4的1-27、67-150位碱基插入TAT-xGP5m片段的A、B表位之间，克隆至重组质粒pF-TAT-FM的P10启动子下，获得重组质粒pF-FMP542(见图17)，TAT-xGP54m2基因大小为804bp，双酶切鉴定及测序结果均正确。

2.1.2重组杆状病毒构建

将重组转移载体转化入DH10Bac，获得重组Bacmids。鉴定正确后将重组Bacmids转染Sf9细胞，5d后收获细胞培养液，并连续传代两次后接毒96h可观察到细胞明显变大变圆、通透性增加并伴有明显漂浮(见图18A)，获得重组杆状病毒rAc-FMP542。将其接种长满单层的Sf9细胞，出现病变后进行间接免疫荧光试验，荧光显微镜下可观察到绿色荧光阳性细胞(见图18B)。

2.1.3 Western-blot检测重组蛋白表达

将重组杆状病毒接种长满单层的Sf9细胞，96h后收样分别用His-Tag单抗、Flag单抗作为一抗进行Western-blot鉴定，结果(图19)显示，细胞裂解物离心上清液和沉淀物中均可检测到特异性条带，与目的蛋白大小一致，表明目的蛋白TAT-xGP54m2和TAT-FM均可以可溶性表达。

2.2猪体免疫接种后免疫应答检测结果

2.2.1 PRRSV抗体水平

免疫猪PRRSV ELISA抗体水平以血清稀释100倍时的S/N值表示。结果见图20。首免后21d，BMP541、FMP542和BMP541+FMP542免疫组PRRSV特异性抗体水平均显著高于PBS组(P<0.001)；加强免疫后，免疫组抗体水平进一步提高，其中BMP541+FMP542组最高，各免疫组均显著高于PBS组(P<0.001)。

首免后42d采集猪血清，采用PRRSV FJ1402毒株分别测定各组PRRSV中和抗体效价，结果如表6所示。BMP541组平均中和抗体效价为1:6.4，FMP542免疫组平均中和抗体效价为1:7.2，BMP541+FMP542免疫组平均中和抗体效价为1:10.4，PBS攻毒对照组未检测到中和抗体。

表6各组猪血清PRRSV中和抗体效价

2.2.2 PRRSV特异性淋巴细胞增殖

首免42d后进行淋巴细胞增殖实验，计算刺激指数SI，结果如图21所示，BB0907和FJ1402病毒刺激均可以使BMP541+FMP542免疫组产生显著的淋巴细胞增殖反应(P<0.01)。

2.3 HP-PRRSV BB0907毒株攻毒试验结果

临床症状：攻毒BB0907后各组仔猪体温变化如图22A所示：BMP541免疫组攻毒后体温逐渐升高，第7d有两头猪体温在41℃以上，第6-7d体温升到最高，第8d以后逐渐恢复正常，高热猪呼吸音明显，其余猪无明显异常。BMP541+FMP542免疫组在攻毒后5-8d体温略有升高，临床表现无明显异常。PBS非免疫攻毒对照组体温上升明显，第5-9d体温普遍在40℃以上，第6-7d有三头猪体温在41℃以上，并伴有体表发红、被毛粗乱、呼吸急促，食欲欠佳。

病毒血症：荧光定量PCR检测结果如图22B，免疫组病毒血症降低明显，攻毒第3-10d，BMP541和BMP541+FMP542免疫组病毒血症均显著低于PBS非免疫攻毒对照组(P<0.01)，攻毒后第14d，BMP541和BMP541+FMP542免疫组病毒血症低于PBS攻毒组(P<0.05)。

肺脏病毒载量：荧光定量PCR检测结果如图22C，免疫组肺脏病毒载量均显著低于PBS攻毒组(P<0.05)。

病理学变化：PBS非免疫攻毒对照组出现肺脏瘀血、肿胀、表面有散在出血点和虾肉样实变，病理切片HE染色后显微镜检显示肺泡壁增厚明显，间质增宽，并伴有炎性细胞浸润。BMP541免疫攻毒组肺泡间隔稍有增宽，少量炎性细胞浸润。BMP541+FMP542免疫攻毒组肺间质稍有增宽，肺泡结构较为完整。BMP541免疫攻毒组肺部有散在实变，肺泡间隔稍有增宽(见图22D)。

2.4 PRRSV类NADC30毒株FJ1402攻毒试验结果

临床症状：攻毒FJ1402后各组仔猪体温变化如图23A所示：FMP542免疫组攻毒后体温稍有升高，第10d以后逐渐恢复正常，发热猪只呼吸急促，其余猪无明显异常。BMP541+FMP542免疫组在攻毒后无明显发热，临床表现也无明显异常。PBS非免疫攻毒对照组体温上升明显，第4-7d体温普遍在40℃以上，并伴有体表发红、被毛粗乱、呼吸急促，食欲欠佳。实验结果表明BMP541+FMP542免疫组能抵抗FJ1402毒株攻击。

病毒血症：荧光定量PCR检测结果如图23B，免疫组病毒血症降低明显，攻毒第3-14d，FMP542和BMP541+FMP542免疫组病毒血症均显著低于PBS非免疫攻毒对照组(P<0.01)。

肺脏病毒载量：荧光定量PCR检测结果如图23C，FMP542免疫组肺脏病毒载量低于PBS攻毒组(P<0.05)，BMP541+FMP542免疫组肺脏病毒载量显著低于PBS非免疫攻毒对照组(P<0.01)。

病理学变化：PBS非免疫攻毒对照组肺脏出现瘀血、水肿、局部有出血点和虾肉样实变，病理切片HE染色后显微镜检显示肺泡壁增厚明显、间质增宽、炎性细胞浸润等间质性肺炎的症状。FMP542免疫攻毒组肺泡间隔增宽。BMP541+FMP542免疫攻毒组肺间质稍有增宽，肺泡结构较为完整。FMP542免疫攻毒组肺部有散在实变，肺泡间隔稍有增宽(见图23D)。

3讨论

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是世界重要的经济动物疾病之一，如我国出现的HP-PRRSV，仅在2006年造成超过100万头猪死亡。PRRSV毒株具有多样性并且极易变异，其不同基因组之间的差异导致异源毒株存在致病性差异且交叉免疫保护效果弱。2013年，我国出现与美国NADC30毒株高度同源的类NADC30毒株，相关研究表明，NADC30毒株具有极强的遗传变异能力，与国内流行的经典PRRSV、HP-PRRSV以及PRRSV弱毒疫苗都可发生重组，产生不同的类NADC30毒株在仔猪致病力上表现出明显差异，给我国PRRSV防控带来巨大挑战。研究人员在免疫了PRRSV弱毒疫苗的猪场也发现了类NADC30毒株的流行，这表明现有疫苗不足以抵抗类NADC30毒株的感染。因此，研制更广谱的PRRSV疫苗至关重要。

本研究以TAT-xGP5m基因为基础，在GP5蛋白A、B表位之间插入GP4 T细胞抗原表位(1-9aa，23-50aa)的基因序列，组合成TAT-xGP54m2，结果证明，GP4蛋白1-9aa和23-50aa表位能引起明显的淋巴细胞增殖反应。再将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的ORF6基因的N端添加穿膜肽TAT序列，并根据昆虫细胞的密码子偏嗜性进行优化，将TAT-xGP54m2和TAT-FM分别连接在杆状病毒的P10和PH启动子下，成功构建重组杆状病毒FMP542。Western blot证明，感染细胞中M、GP5及GP4蛋白部分抗原表位呈现可溶性表达。将表达产物与免疫佐剂充分混合制备亚单位疫苗，进行猪体免疫保护实验，结果显示，BMP541与FMP542疫苗联用时能诱导猪体产生高水平的细胞免疫及体液免疫，并且能显著降低HP-PRRSV感染组与PRRSV类NADC30感染组的病毒血症以及肺脏病毒载量，减轻由病毒感染引起的临床症状和病理变化，证明其对PRRSV的两种流行毒株均具有较好免疫保护作用，但是，该重组亚单位疫苗免疫效果尚需要与商品化疫苗进一步比较测定。

综上所述，本研究成功构建了表达PRRSV类NADC30毒株M蛋白和GP5的重组杆状病毒，制备的BMP541与FMP542亚单位疫苗可诱导猪体产生高水平的免疫应答，并且能有效抵御HP-PRRSV毒株与PRRSV类NADC30毒株的攻击，为PRRSV亚单位疫苗的研制奠定了重要基础。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫保护蛋白杂合基因、重组杆状病毒及疫苗

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Cys Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser

20 25 30

Ser Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly

65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile

145 150 155 160

Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu His His His His His His

195 200 205

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Leu Gly Lys

1 5 10 15

Cys Leu Thr Ala Cys Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe Leu Trp Cys Ile

20 25 30

Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser Ser Asn Ser Ser

35 40 45

Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly

50 55 60

Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val Glu Thr Phe Val

65 70 75 80

Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly Ala Leu Thr Thr

85 90 95

Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Gly

100 105 110

Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr Ala Val Cys Ala

115 120 125

Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met

130 135 140

Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr

145 150 155 160

Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu Lys Gly

165 170 175

Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val

180 185 190

Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val Ser Ala Glu Gln

195 200 205

Trp Gly Arg Leu His His His His His His

210 215

<210> 3

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttgggga agtgcttgac cgcgtgctgt tgctcgcaat tgcttttttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgccaac gccagcagca acagcagctc tcatttacag 120

ttgatttata acttaacgct atgtgagctg aatggcacag attggctggc aaataaattt 180

gactgggcag tggagacttt tgtcatcttc cccgtgttga ctcacattgt ttcctatgga 240

gcactcacca ccagccattt ccttgacaca gttggtctag ttactgtgtc caccgccgga 300

tattatcacg ggcggtatgt cttgagtagc atttacgcag tctgtgctct ggctgcgctg 360

acttgctttg tcattaggct tgcgaagaac tgcatgtcct ggcgctactc ttgtaccaga 420

tataccaact tccttctgga cactaagggc aaactctatc gttggcggtc acccgtcatt 480

attgagaaag ggggtaaggt tgaggtcgaa ggtcacctga tcgacctcaa gagagttgtg 540

cttgatggtt ccgcggcaac ccctttaacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtctc 600

catcatcacc atcaccatta a 621

<210> 4

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtatggca ggaagaagcg gagacagcga cgaagaatgt tggggaagtg cttgaccgcg 60

tgctgctgct cccagctgct gttcctgtgg tgcatcgtcc cattctgctt cgccgtgctg 120

gctaacgcct ccagcaactc ttcatcccac ctgcagctga tctacaacct gaccctgtgc 180

gagctgaacg gtactgactg gctggctaac aagttcgact gggccgtgga aaccttcgtc 240

atcttccctg tgctgactca catcgtcagc tacggcgctc tgaccacttc tcacttcctg 300

gacactgtgg gactggtgac cgtcagcact gccggatact accacggacg ttacgtcctg 360

agctctatct acgctgtgtg cgctctggct gctctgacct gcttcgtcat cagactggct 420

aagaactgca tgtcatggag gtactcctgc accagataca ctaacttcct gctggacact 480

aagggaaagc tgtaccgctg gcgttctcct gtcatcatcg agaagggtgg caaggtggag 540

gtcgaaggtc acctgatcga cctgaagcgt gtggtcctgg acggatcagc tgctacccct 600

ctgactcgcg tgtccgcgga acaatggggt cgtctccatc atcaccatca ccattaa 657

<210> 5

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacggtcgta agaagcgccg tcagaggaga cgcatgggtt ccagcctgga cgacttctgc 60

aacgactcca ccgctcccca gaaggtgctg ctggccttca gcatcaccta cactcctgtg 120

atgatctacg ctctgaaggt ctccagagga cgcctgctgg gtctgctgca cctgctgatc 180

ttcctgaact gcgccttcac cttcggttac atgactttcg tgcacttcga gagcaccaac 240

agagtcgctc tgactatggg tgctgtggtg gctctgctgt ggggcgtgta ctctgccatc 300

gaaacctgga agttcatcac ttcacgttgc aggctgtgcc tgctgggccg caagtacatc 360

ctcgctccag ctcaccacgt ggagtctgct gccggattcc accctatcgc tgccaacgac 420

aaccacgctt tcgtggtccg taggcctggt tctaccactg tgaacggcac tctggtcccc 480

ggactgaagt cactggtgct gggtggcagg aaggctgtca agcagggcgt ggtcaacctg 540

gtcaagtacg ccaaggatta caaggacgac gatgacaagt aa 582

<210> 6

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtacgggc gcaaaaagcg taggcagcgg cgtaggatgg gaagttcgat agatgatttt 60

tgtaacgata gtacggctgt gcagaaggtc ttgctggcat tttcaattac atataccccc 120

attatgatat acgcgctcaa agtatcacgg ggtcggctac ttggtttact acatctactt 180

atattcttga attgcgcttt cacattcggc tatatgacct ttgtccattt ccaaagcaca 240

aacaaagttg cgcttacgct cggggctgtg gttgcgctcc tgtggggcgt ttattctgcc 300

cttgagactt ggcgatttat cactagccga tgcaggttat gtctcttagg tcgcaaatac 360

atcttggccc ccgcacacca cgtcgaatcg gccgcggggt ttcacccgat taccgcctcc 420

gacaaccatg cattcgtagt acgtcgccct ggctctacta cggtgaatgg cacattagtt 480

cctggactaa aatccctggt gttgggtgga cgaagagcag taaagagagg ggttgtcaat 540

ttagttaaat acgctaagga ctataaggat gacgatgaca agtga 585

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atagaattcg ccaccatgct gggcaagtgc ctgaccgctt gctgctgct 49

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgaagcttt tagtggtggt ggtggtggtg cagacgaccc cactgttca 49

<210> 9

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atagaattcg ccaccatgta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag aatgttgggg 60

aagtgcttga ccg 73

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgaagcttt tagtggtggt ggtggtggtg cagacgaccc cactgttca 49

<210> 11

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaattcgc caccatgggt ctgttccgag cactgctgcg actgctgcga tctctgtggc 60

gactgctgct gcgagcaatg 80

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcgaagcttt tagtggtggt ggtggtggtg cagacgaccc cactgttca 49

<210> 13

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggaattcgc caccatggga gctcttttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta 60

tgggcgcatg gtctcagcct aaaaa 85

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcgaagcttt tagtggtggt ggtggtggtg cagacgaccc cactgttca 49

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atagaattcg ccaccatgta tggcaggaag aagcggagac agcgacga 48

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgaactgaaa catggcttgc aagatccaga gttgctggag gcgttagc 48

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctaacgcct ccagcaactc tggatcttgc aagccatgtt tcagttcg 48

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gatcagctgc aggtgggatg aagatccgat gtcctggagg acaatgaa 48

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttcattgtcc tccaggacat cggatcttca tcccacctgc agctgatc 48

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcgaagcttt taatggtgat ggtgatgatg cagacgaccc cactgttc 48

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaaccagtcc agaggcaagg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcagtcgcaa gagggaaatg 20

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccgctcgagg ccaccatgta tggcaggaag 30

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaggaaaaga aaggacgcag ccatagatcc agagttgctg ga 42

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gctgcgtcct ttcttttcct cctgtgcaag ccatgtttca gt 42

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cggggtacct taatggtgat ggtgatgatg 30