具体实施方式

在为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。所使用的每个实施例或示例性语言(例如，“例如”)旨在解释本发明，而非以任何形式限制本发明。

除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”、“具有”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求要素对于本发明的实践是必不可少的。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。

I类包膜病毒，以冠状病毒为例，人冠状病毒病毒侵染靶细胞的过程：冠状病毒的包膜糖蛋白(S蛋白)可根据功能的不同分为S1亚单位和S2亚单位，S1亚基负责病毒与宿主细胞受体的结合。S2亚基包含三个功能域，融合肽(FP)和2个七肽重复序列区(HR)——HR1和HR2。当S1中的受体结合域(RBD)与受体结合后，S2亚基中的FP插入宿主细胞膜而改变构象，随后HR1和HR2区相互作用形成六螺旋结构(6-HB)，介导病毒膜与细胞膜融合，最终病毒的基因组通过融合孔进入靶细胞内，复制产生新的病毒颗粒。S蛋白的S2区域是一个重要的药物设计靶点，其中HR1区相对保守，且已有研究报道证明来源于HR2区的多肽可以与冠状病毒的HR1区相互作用形成异源6-HB，从而抑制了HR1和HR2结构域之间同源6-HB的形成，阻断病毒与宿主细胞的融合。目前已有衍生于病毒的HR2区的多肽被证实具有较好的抗病毒活性，且经过PEG或/和胆固醇或/和棕榈酸的修饰后，多肽活性大大提升。PEG修饰是目前常用的提高蛋白和多肽药物活性的手段，然而，有报道显示，服用PEG药物可能会引起患者体内产生抗PEG抗体，从而增加PEG药物使用的风险；最近，Sicence报道接种辉瑞和BioNTech公司生产的mRNA新冠疫苗后产生过敏反应，研究人员推测这可能与包装mRNA的脂质纳米颗粒含有PEG相关；此外，根据文献报道，在C末端经PEG修饰的多肽的酶耐受性会降低。所以，本发明旨在通过合理的创新设计(如图1所示)，获得新型的不含PEG的高稳定性抗包膜病毒多肽。

针对冠状病毒，尤其是当前爆发的SARS-CoV-2，目前尚未有获批的特效治疗药物，包括针对S2区域的多肽类抑制剂。本发明首先以序列比对软件MEGA和WebLogo 3(http：//weblogo.threeplusone.com)比较分析SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2和HCoV-OC43的HR2区C末端片段(HR2-CF)序列，比对结果发现这些冠状病毒的HR2-CF序列相对保守(如图2所示)；随后，本发明通过选取所设计的HR2-CF序列代替PEG连接设计了四条去PEG的多肽类抑制剂，进一步对多肽进行胆固醇或棕榈酸修饰，该组多肽的具体序列如表4所示，或详见于多肽序列表中。本发明的目的是提供一组广谱抗包膜病毒感染的多肽类进入抑制剂。所述的多肽类进入抑制剂就是与I型包膜病毒的HR1区域结合，干扰病毒自身六螺旋的形成过程，从而抑制病毒的膜融合感染过程。进行SARS-CoV-2的S蛋白介导的细胞融合和假病毒抑制实验结果筛选出的SEQ ID NO：2多肽(参见表4)可有效的抑制新冠病毒的膜融合及假病毒感染；此外，对SARS-CoV-2和HCoV-OC43及HIV-1等病毒体外抑制实验结果表明SEQ IDNO：2多肽可有效抑制SARS-CoV-2对Vero-E6的感染、HCoV-OC43对RD细胞的感染及HIV-1对MT-2细胞的感染。为进一步评估多肽活性，发明人在ACE2-转基因小鼠模型上研究发现，SEQID NO：2多肽滴鼻给药可有效保护小鼠感染SARS-CoV-2；同样的，SEQ ID NO：2多肽滴鼻给药，再感染HCoV-OC43，多肽在乳鼠体内产生了较好的保护效果。以上结果说明SEQ ID NO：2多肽有潜力开发成为高效的抗SARS-CoV-2特异性药物。同时，假病毒抑制实验还发现所设计的多肽不仅有效的抑制多种SARS-COV-2的突变株，例如抵抗靶向RBD的抗体的南非突变株N501Y/E484K/K417N(B.1.351lineage)，还可有效抑制多种人冠状病毒，例如SARS-CoV，以及来自蝙蝠的类SARS病毒，例如SARSR-HCOV-RS3367。因此，本发明可为目前仍在流行的冠状病毒和I型人类免疫缺陷病毒以及未来有可能爆发的新的冠状病毒提供了很好的预防和治疗的候选药物。

本发明的目的之一在于开发更高稳定性的去PEG抑制冠状病毒膜融合多肽。在本文中，稳定性可以是酶耐受性和热稳定性。酶耐受性的实验结果表明，在胰蛋白酶或蛋白酶K的相同处理条件下，本发明设计的多肽活性相对下降更少。此外，热稳定性实验结果表明，在相同温度下储存相同的时间，本发明设计的多肽与PEG多肽相比，活性相对降低更少。本发明提供了检测多肽热稳定性的方法，方法包括将多肽设定储存浓度，放置于4℃，室温，37℃，储存相同时间，最终检测假病毒抑制活性，检测方法技术是本领域技术人员公知的。

在本文中，多肽可以是包含SEQ ID NO：1或2的多肽或其变体。

例如，多肽可以包括以SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入1个以上，优选2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列。

氨基酸添加指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1或2的C末端或N末端添加氨基酸，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。

氨基酸取代指在氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1或2的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。

氨基酸插入指在氨基酸序列例如SEQ ID NO：1或2的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。

氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如SEQ ID NO：1或2的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要多肽具有针对冠状病毒的抑制活性。

在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列相比，有3个，优选2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。

在本发明的上下文中，保守取代可以根据以下三个表中的一个以上中反映的氨基酸类别内的取代来定义：

表1：保守取代的氨基酸残基类别

表2：备选保守氨基酸残基取代类别

表3：氨基酸残基的备选物理和功能分类

为了本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)测定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如在EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，TrendsGenet.16：276-277)，优选第5.0.0版以上的Needle程序中实施。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，如下进行计算：

(相同残基×100)/(比对长度-比对中的缺口总数)。

本发明还提供了包含本发明的多肽，例如SEQ ID NO：1或2的融合蛋白或缀合物，只要融合蛋白或缀合物不用想本发明的多肽的冠状病毒抑制活性。本领域技术人员完全知晓融合蛋白或缀合物的制备方法。例如，本发明的多肽可以直接或者通过接头间接与另一个功能性部分融合或缀合。另一个功能性部分可以是胆固醇部分、棕榈酸部分、载体蛋白、活性蛋白、标记蛋白等等。多肽可以进行豆蔻酰化修饰、或硬脂酸修饰、或棕榈酸修饰、或胆固醇修饰、酰胺化修饰或异戊二醇化修饰。

本发明的多肽可以是合成生成的或者本发明的多肽可以是细胞表达的。例如，可以通过化学手段合成本发明的多肽。或者，可以在重组细胞中表达本发明的多肽。细胞的类型不受限制，例如细胞可以是真核细胞或者原核细胞。真核细胞可以是真菌细胞，例如酵母细胞，或者昆虫细胞或哺乳动物细胞，例如小鼠细胞。原核细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。

本发明的多肽的核酸可以随使用的宿主细胞进行密码子优化。该核酸可以克隆到合适的表达载体中，然后将表达载体导入宿主细胞以进行表达。表达载体的类型不受限制，并且是本领域技术人员公知的。

本发明还提供了多肽或融合蛋白的制备方法。方法包括将表达载体导入宿主细胞中，然后在合适的培养基中进行培养，然后在上清液中收获或分离多肽或融合蛋白，或者在胞内表达的情况下可以收集宿主细胞，然后对细胞进行裂解，从而收集这些多肽或融合蛋白。当多肽或融合蛋白的情况下，多肽或融合蛋白可以与合适的信号肽连接。在收获后切割或不切割所述信号肽。这些技术对于本领域技术人员而言是公知的。

本发明的多肽可以制备成衍生物形式。例如，多肽可以进行棕榈酰化修饰或胆固醇修饰。棕榈酰化修饰或胆固醇修饰的方法是公知的。在一个实施方式中，棕榈酰化修饰或胆固醇修饰可以在多肽的C末端进行，使得多肽在C末端与棕榈酸或胆固醇部分连接。该连接可以是直接连接或者可以通过接头连接。

接头的种类和长度可以有所变化。例如，接头可以是(GSG)n或(GSGSG)n，其中n可以是任何整数，例如1、2、3、4、5、6等等。

如本文中使用，冠状病毒可以是任何种类的冠状病毒。优选地，冠状病毒是SARS-CoV-2/SARS-CoV/MERS-CoV/HCoV-OC43/HCoV-NL63/SARSr-CoV-Rs3367和/或SARSr-CoV-WIV1-CoV。

如本文中使用，人类免疫缺陷病毒可以是任何亚型的HIV病毒。优选地，病毒是HIV-1。

本发明的多肽或多肽衍生物可以单独使用或组合使用，或者结合其他具有抗冠状病毒活性或冠状病毒抑制活性的药剂组合使用。例如，这些药剂可以是现有报道对冠状病毒具有抑制活性或对冠状病毒疾病，例如冠状病毒肺炎具有治疗效果的药剂，例如法匹拉韦、奈非那韦、阿比朵尔、洛匹那韦、利托那韦、磷酸氯喹、达芦那韦或瑞德西韦等等。

在本文中，本发明的多肽或多肽衍生物可以制备成组合物形式进行应用。组合物可以包含合适的载体，例如药学可接受的载体。此类组合物可以是外用的，例如用作外用制剂，外用涂抹制剂，例如外用凝胶剂或外用浸润制剂。此类组合物可以涂覆在需要抑制病毒的物品上，例如但不限于口罩、纸巾、手套、衣物，例如防护服等上。或者，可以作为活性成分添加到洗手用品，例如洗手液、沐浴露等中。可以使用此类多肽或多肽衍生物在体外抑制冠状病毒以防止和/或减少病毒感染。

本发明的多肽或多肽衍生物也可以制备成药物或药物组合物。此类药物可以是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂。可以通过各种施用方式应用这些药物或药物组合物，例如注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等，腔道给药，如经直肠、阴道和舌下，呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药，或者表面给药，等等。

实施例

实验材料：

多肽：

发明人通过将人冠状病毒(SARS-CoV，MERS-CoV，SARS-CoV-2和HCoV-OC43)S蛋白中HR2-CF序列进行同源性对比，设计了四条衍生于HR2-CF区域的人工多肽，在这些多肽基础上进行胆固醇或棕榈酸修饰得到相应的脂肽。表1中显示了这些多肽的具体序列和结构。

表4：实施例中使用的多肽的具体序列

pAAV-IRES-EGFP-SARS-CoV-2-S中的SARS-CoV-2-S的氨基酸序列序列(插入酶切位点为BamHI和XhoI)如下：

MPMGSLQPLATLYLLGMLVASVLAQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTGGTETSQVAPA(SEQ ID NO：4)。

核苷酸序列如下：

GGATCCGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTGCTAGCCCAGTGCGTGAACCTGACCACAAGGACCCAGCTGCCCCCTGCCTATACCAATTCCTTCACACGGGGCGTGTACTATCCCGACAAGGTGTTTAGAAGCTCCGTGCTGCACTCTACACAGGATCTGTTTCTGCCTTTCTTTAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGAGCGGCACCAATGGCACAAAGCGGTTCGACAATCCAGTGCTGCCCTTTAACGATGGCGTGTACTTCGCCTCTACCGAGAAGAGCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTTGGCACCACACTGGACTCCAAGACACAGTCTCTGCTGATCGTGAACAATGCCACCAACGTCGTGATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTTTGTAATGATCCTTTCCTGGGCGTGTACTATCACAAGAACAATAAGAGCTGGATGGAGTCCGAGTTTCGCGTGTATTCTAGCGCCAACAATTGCACATTTGAGTACGTGTCCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAGGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGAGGGAGTTCGTGTTTAAGAATATCGATGGCTACTTCAAGATCTACTCTAAGCACACCCCAATCAACCTGGTGCGCGACCTGCCACAGGGCTTCAGCGCCCTGGAGCCACTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGACTCCTCTAGCGGATGGACCGCAGGAGCTGCCGCCTACTATGTGGGCTATCTGCAGCCAAGGACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAATGGCACCATCACAGACGCAGTGGATTGCGCACTGGACCCCCTGAGCGAGACCAAGTGTACACTGAAGTCCTTTACCGTGGAGAAGGGCATCTATCAGACATCCAATTTCAGGGTGCAGCCCACCGAGTCTATCGTGCGCTTTCCCAATATCACAAACCTGTGCCCTTTTGGCGAGGTGTTCAACGCAACCAGGTTCGCAAGCGTGTACGCATGGAATAGGAAGCGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTATAGCGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGCTATGGCGTGTCCCCCACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTGTACGCCGATTCTTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCACCAGGACAGACAGGCAAGATCGCAGACTACAATTATAAGCTGCCTGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAATCTGGATTCCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCATTCGAGAGGGACATCTCTACAGAGATCTACCAGGCAGGCAGCACCCCATGCAATGGAGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCAACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCCTACCGCGTGGTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCACGCACCTGCAACAGTGTGCGGACCAAAGAAGTCCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGACTGACCGGCACAGGCGTGCTGACCGAGTCCAACAAGAAGTTCCTGCCCTTTCAGCAGTTCGGCAGGGACATCGCAGATACCACAGACGCCGTGCGCGACCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACACCATGCTCTTTCGGCGGCGTGAGCGTGATCACACCTGGCACCAATACAAGCAACCAGGTGGCCGTGCTGTATCAGGACGTGAATTGTACCGAGGTGCCCGTGGCAATCCACGCAGATCAGCTGACCCCTACATGGCGGGTGTACAGCACCGGCTCCAACGTGTTCCAGACAAGAGCCGGATGCCTGATCGGAGCAGAGCACGTGAACAATTCCTATGAGTGCGACATCCCTATCGGCGCCGGCATCTGTGCCTCTTACCAGACCCAGACAAACTCTCCAAGGAGAGCCCGGAGCGTGGCATCCCAGTCTATCATCGCCTATACAATGAGCCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCTAACAATAGCATCGCCATCCCTACCAACTTCACAATCTCCGTGACCACAGAGATCCTGCCAGTGTCCATGACCAAGACATCTGTGGACTGCACAATGTATATCTGTGGCGATTCTACCGAGTGCAGCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTTTGTACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGCATCGCCGTGGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTGTTCGCCCAGGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCACCCATCAAGGACTTTGGCGGCTTCAATTTTTCCCAGATCCTGCCCGATCCTTCCAAGCCTTCTAAGCGGAGCTTTATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGATGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGCCTGGGCGACATCGCCGCCAGAGACCTGATCTGTGCCCAGAAGTTTAATGGCCTGACCGTGCTGCCTCCACTGCTGACAGATGAGATGATCGCACAGTACACAAGCGCCCTGCTGGCAGGCACCATCACATCCGGATGGACCTTCGGCGCAGGAGCCGCCCTGCAGATCCCCTTCGCTATGCAGATGGCCTATCGGTTCAACGGCATCGGCGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAATCAGTTTAACTCCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGTCCTCTACAGCCTCCGCCCTGGGCAAGCTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACCCTGGTGAAGCAGCTGAGCTCCAACTTCGGCGCCATCTCTAGCGTGCTGAATGACATCCTGAGCCGGCTGGACAAGGTGGAGGCAGAGGTGCAGATCGACCGGCTGATCACAGGCAGACTGCAGTCTCTGCAGACCTACGTGACACAGCAGCTGATCAGGGCAGCAGAGATCAGGGCAAGCGCCAATCTGGCAGCAACCAAGATGTCCGAGTGCGTGCTGGGCCAGTCTAAGAGAGTGGACTTTTGTGGCAAGGGCTATCACCTGATGTCCTTCCCACAGTCTGCCCCTCACGGAGTGGTGTTTCTGCACGTGACCTACGTGCCAGCCCAGGAGAAGAACTTCACCACAGCACCAGCAATCTGCCACGATGGCAAGGCACACTTTCCCAGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAACGGCACCCACTGGTTTGTGACACAGCGCAATTTCTACGAGCCTCAGATCATCACCACAGACAATACATTCGTGTCCGGCAACTGTGACGTGGTCATCGGCATCGTGAACAATACCGTGTATGATCCTCTGCAGCCAGAGCTGGACAGCTTTAAGGAGGAGCTGGATAAGTACTTCAAGAATCACACCTCCCCAGACGTGGATCTGGGCGACATCAGCGGCATCAATGCCTCCGTGGTGAACATCCAGAAGGAGATCGACAGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAGGAGCTGGGCAAGTATGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTATATCTGGCTGGGCTTCATCGCCGGCCTGATCGCTATCGTGATGGTGACCATCATGCTGTGCTGTATGACATCCTGCTGTTCTTGCCTGAAGGGCTGCTGTAGCTGTGGCTCCTGCTGTAAGTTTGATGAGGACGATTCCGAGCCAGTGCTGAAGGGCGTGAAGCTGCACTACACCGGCGGCACCGAGACATCTCAGGTGGCCCCCGCCTAACTCGAG(SEQ ID NO：5)

pAAV-IRES-EGFP质粒图谱见图13。pAAV-IRES-EGFP购自美国agilenttechnologies公司。

pcDNA3.1-SARS-CoV-S质粒，pcDNA3.1-SARS-2-S质粒，pcDNA3.1-MERS-S质粒，pcDNA3.1-NL63-S质粒，pcDNA3.1-OC43-S质粒，pcDNA3.1-Rs3367-CoV-S质粒，pcDNA3.1-WIV1-CoV-S质粒，及SARS-CoV-2突变株S质粒储存于发明人实验室；pNL4-3.luc.RE质粒由美国纽约血液中心杜兰英博士惠赠。SARS-CoV-2-S插入pcDNA3.1的酶切位点为BamHI和XhoI。

表达人感染冠状病毒的受体的靶细胞有Huh-7细胞，293T/ACE2细胞；Caco-2细胞；RD细胞；VeroE6细胞；ACE2/A549细胞：购自美国模式培养物集存库(ATCC)；

实施例1：SARS-CoV-2(包括其突变株)、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-NL63、SARSr-CoV-Rs3367、SARSr-CoV-WIV1-CoV假病毒的制备

实验方法：

1.转染前24h将293T细胞铺板于10cm的组织培养皿中(2×106/dish)；用含10％FBS的DMEM培养12h；

2.转染前2h给细胞更换预温的新鲜DMEM培养基(含10％FBS)；

3.转染时用两个1.5mL的EP管，其中EP管1中加入500μL0.9％NaCl溶液，其中含有均为20μg的pcDNA3.1-SARS-2-S质粒或pcDNA3.1-SARS-S质粒或pcDNA3.1-MERS-S质粒或pcDNA3.1-NL63-S质粒或pcDNA3.1-OC43-S质粒或pcDNA3.1-WIV1-S质粒或pcDNA3.1-Rs3367-S质粒或pcDNA3.1-SARS-S突变株质粒和pNL4-3.luc.RE质粒。相关信息也可以参见文献Xia，S.^#，Yan，L.^#，Xu，W.^#，Agrawal，A.S.，Alsaissi，A.，Tseng，C.T.K.，Wang，Q.，Du，L.，Tan，W.，Wilson，I.A.*，Jiang，S.*，Yang，B.*，Lu，L.*(2019).A pan-coronavirusFusion Inhibitor Targeting the HR1 Domain of Human Coronavirus Spike.ScienceAdvances.2019Apr 10；5(4)：eaav4580)；EP管2中也加入500μL0.9％NaCl，再加入染试剂vigofect10μL，均静置5分钟；

4.将EP管2中的混合溶液逐滴加入EP管1中，边加入边用枪头混匀，室温静置15min；

5.将上述1mL混合液体逐滴、均匀地加入到先前铺好的293T细胞培养皿中；

6.转染6～8h后，更换10mL含10％FBS的新鲜DMEM培养液；

7. 48h后收集含有假病毒的上清液；

8. 3000rpm离心10min去除细胞碎片，0.45μm无菌过滤器过滤，分装并储存在-80℃备用。

实施例2：抑制SARS-CoV-2的S蛋白介导的细胞-细胞融合实验(cell-cellfusion)

实验方法：

1.用编码SARS-CoV-2的S蛋白的质粒(pAAV-IRES-GFP-SARS-CoV-2-S)转染293T细胞后培养36-48h，得到经转染的细胞，作为效应细胞，称为293T/2019/EGFP细胞。

2.将293T/2019/EGFP细胞使用0.02％EDTA消化，离心，使用新鲜的10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至2×10⁵个/mL，取出50μL加入到梯度稀释的各种测试多肽药物(50μL)中，在37℃，孵育30min。不添加药物者用作阳性对照细胞。

3.取100μL细胞/药物混合液加入到已经铺板在96孔板的靶细胞Huh-7上。5％CO₂、37℃培养2-4小时，用荧光显微镜的绿色荧光通道观察并记录细胞的融合情况。

抑制活性的计算公式：抑制率＝(阳性孔融合细胞数-药物孔融合数)/(阳性孔融合细胞数-阴性孔融合数)*100

结果与分析：

如图3所示，本发明设计的多肽对SARS-CoV-2的S蛋白所介导的细胞-细胞融合有很好的抑制效果，从而显示了这些多肽可抑制SARS-CoV-2。对于SARS-CoV-2的S蛋白所介导的细胞-细胞融合，与其他设计多肽相比，CFL1C具备相当的抑制活性，并且高于CF1数十倍，初步显示CFL1C具有较好的抗病毒活性。

实施例3：多肽对SARS-CoV-2假病毒的抑制活性测定

实验方法：

1.使用DMSO溶解测试多肽药物并测定多肽浓度。

2.制备表达人感染冠状病毒受体的靶细胞Huh-7、Caco-2、ACE2/293T细胞悬液，调整细胞浓度为每孔中加入10⁴个细胞，培养12h。

3.在96孔板中使用含10％FBS的DMEM培养液4倍梯度稀释多肽药物，每孔50μL。

4.将一定滴度的SARS-CoV-2假病毒加入药物稀释板中50μL/每孔加入。37℃作用30min，使药物与病毒充分作用。每孔中加入药物与病毒混合液100μL加入到去除上清的靶细胞中，37℃培养12h后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基。

5. 48h后测定luciferase，计算制作抑制率曲线，计算药物的半数抑制浓度(IC50)。

抑制活性的计算公式：抑制率＝(病毒对照孔数值-药物孔数值)/(病毒对照孔数值-细胞孔数值)*100％；其中病毒对照孔为不添加药物的孔，细胞孔为不添加病毒的孔。

结果与分析：

在SARS-CoV-2假病毒系统上再次检测CFL1系列多肽的抗病毒活性。结果如图4所示，与其他设计的多肽相比，CFL1C多肽分别在不同的靶细胞上展现出更好的抗病毒活性。并且，CFL1C多肽抑制活性要明显优于CF1多肽，高达约数十倍，这与融合抑制的结果较为一致。

实施例4：多肽对SARS-CoV-2的突变株及其他冠状病毒假病毒的抑制活性测定

实验方法：

1.包装相应的冠状病毒假病毒(如实施例1)。

2.制备表达人感染冠状病毒受体的靶细胞细胞悬液(HCoV-OC43使用靶细胞为RD细胞；类SARS冠状病毒使用A549/ACE2靶细胞；其他冠状病毒使用Huh-7靶细胞)，调整细胞浓度后每孔中加入10 ⁴个细胞。

3. 96孔板中使用含10％FBS的DMEM培养液3倍梯度稀释多肽药物，每孔50μL。

4.将一定滴度的SARS-CoV-2突变株或SARS-CoV或MERS-CoV或HCoV-OC43或HCoV-NL63或SARSr-CoV-Rs3367和/或SARSr-CoV-WIV1-CoV假病毒加入药物稀释板中50μL/每孔加入。37℃作用30min，使药物与病毒充分作用。每孔中加入药物与病毒混合液100μL加入到去除上清的靶细胞中，37℃培养12h后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基。

5. 48h后测定luciferase，计算制作抑制率曲线，并计算药物的半数抑制浓度(IC50)。

抑制活性的计算公式：抑制率＝(病毒对照孔数值-药物孔数值)/(病毒对照孔数值-细胞孔数值)*100％；其中病毒对照孔为不添加药物的孔，细胞孔为不添加病毒的孔。

结果与分析：

在SARS-CoV-2突变株或其他冠状病毒假病毒系统上再次检测CFL1C多肽的抗病毒活性。结果如图5-6所示，CFL1C多肽同样展现出较好的抗病毒活性。并且在其他冠状病毒的抑制结果比较可发现多肽CFL1C抑制活性要明显优于CF1多肽，高达约数十倍。CFL1C可有效的抑制多种SARS-CoV-2突变株假病毒，其IC50均低于0.15μM。这些数据显示CFL1C具有广谱抑制SARS-CoV-2及其多种突变株，以及多种人感染冠状病毒的潜力。

实施例5：多肽对SARS-CoV-2活病毒感染的体外抑制活性的测定

实验方法：

1.本研究在复旦大学上海医学院生物安全三级实验室开展，具体方法为：96孔板铺VERO-E6密度为10000个/孔，培养12h。

2.对CFL1C、CFL1活性的检测对SARS-CoV-2活病毒的病毒载量用Qpcr法进行检测。不同浓度的上述各多肽与SARS-CoV-2活病毒(病毒滴度为0.1MOI)先孵育30分钟，然后将它们加入到单层的VERO-E6细胞上。

3.在37℃下培养48h后，吸取细胞上清，提取RNA，使用Takara一步法试剂盒进行Qpcr分析，引物序列如下：

SARS-CoV-2-ORF1ab-F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA，

SARS-CoV-2-ORF1ab-R：ACGATTGTGCATCAGCTGA，

SARS-CoV-2-ORF1ab-probe：5′-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTA

TGG-BHQ1-3′。

相关信息，参见参考文献Liu Z.^#，Xu W.^#，Xia S.^#，Gu C.^#，Wang X，Wang Q，JieZ.，Yanling W.，Xia C.，Di Q.，Tianlei Y.，Youhua X.，Lu L.*，Zhenghong Y*，Shibo J*.(2020)RBD-Fc-based COVID-19vaccine candidate induces highly potent SARS-CoV-2neutralizing antibody response.Signal Transduct Target Ther.2020Nov 27；5：282。

结果与分析：

在SARS-CoV-2活病毒体外系统上检测CFL1C、CFL1多肽的抗病毒活性。结果如图7所示，CFL1C、CFL1多肽均展现出抗SARS-CoV-2活病毒的活性。并且，CFL1C多肽抑制活性要明显优于CFL1多肽约469倍。具体地，在SARS-CoV-2活病毒体外系统上，CFL1C的IC50为0.003μM，CFL1的IC50为1.407μM。

实施例6：多肽对HCoV-OC43活病毒感染的体外抑制活性的测定

实验方法：

1.RD细胞铺于96孔板(10000个/孔)，培养12h。

2.将多肽(CFL1C、CFL1)梯度稀释后与HCoV-OC43(100TCID₅₀)共同孵育30分钟。

3.将上述混合液加入去除上清的细胞中，37℃培养72h。

4.观察细胞病变，吸除上清，加入CCK8(日本同仁化学)测定细胞活力。

结果与分析：

在HCoV-OC43活病毒体外系统上检测CFL1C、CFL1多肽的抗病毒活性。结果如图8，CFL1C可有效抑制HCoV-OC43在RD细胞上的复制，IC50为0.281μM，高于CFL1(IC50＝20.29μM)多肽约71倍。

实施例7：多肽对SARS-CoV-2活病毒感染的体内抑制活性的测定

检测多肽对SARS-CoV-2体内抑制活性，本发明研究选用ACE2转基因小鼠作为动物模型，相关信息见参考文献

Liu Z.^#，Xu W.^#，Xia S.^#，Gu C.^#，Wang X.，Wang Q.，Jie Z.，Yanling W.，XiaC.，Di Q.，Tianlei Y.，Youhua X.，Lu L.*，Zhenghong Y.*，Shibo J.*.(2020)RBD-Fc-based COVID-19vaccine candidate induces highly potent SARS-CoV-2neutralizingantibody response.Signal Transduct Target Ther.2020Nov 27；5：282.

Bao，L.^#，Deng，W.^#，Huang，B.^#，Gao，H.^#，Liu，J.，Ren，L.，Wei，Q.，Yu，P.，Xu，Y.，Qi，F.，Qu，Y.，Li，F.，Lv，Q.，Wang，W.，Xue，J.，Gong，S.，Liu，M.，Wang，G.，Wang，S.，Song，Z.，…Qin，C.*.(2020)The pathogenicity of SARS-CoV-2in hACE2 transgenicmice.Nature.2020Jul；583(7818)：830–833.

实验方法：

1.本研究在复旦大学上海医学院生物安全三级实验室开展，将15只转基因小鼠随机平均分为三组：预防组、病毒对照组、治疗组。

2.攻毒前0.5h多肽CFL1C(1.5mg/kg)滴鼻处理预防组小鼠。

3.分别感染三组小鼠相同剂量的SARS-CoV-2(10⁵TCID50)。

4.攻毒后0.5h多肽CFL1C(1.5mg/kg)滴鼻处理治疗组小鼠。

5.在攻毒4天后，安乐死小鼠，收集肺组织，提取RNA，进行Qpcr分析如实施例4。

结果与分析：

在ACE2转基因小鼠SARS-COV-2感染模型上，通过滴鼻CFL1C多肽进行预防和治疗研究，结果如图9所示：与病毒对照组相比，CFL1C处理的预防组和治疗组的小鼠肺病毒载量明显减少，存在显著性差异，其P值分别小于0.001和0.0001，CFL1C表现出很好的预防保护效果和治疗保护效果。

实施例8：多肽对HCoV-OC43活病毒感染的体内抑制活性的测定

本发明研究采用乳鼠模型测定多肽对HCoV-OC43活病毒感染的体内抑制活性；相关信息也可以参见文献Xia，S.^#，Yan，L.^#，Xu，W.^#，Agrawal，A.S.，Alsaissi，A.，Tseng，C.T.K.，Wang，Q.，Du，L.，Tan，W.，Wilson，I.A.*，Jiang，S.*，Yang，B.*，Lu，L.*(2019).Apan-coronavirus Fusion Inhibitor Targeting the HR1 Domain of HumanCoronavirus Spike.Science Advances.2019Apr 10；5(4)：eaav4580)。

实验方法：

1.将18只新生乳鼠随机平均分为三组：预防组、病毒对照组、治疗组。

2.攻毒前0.5h多肽CFL1C(4mg/kg)滴鼻处理预防组小鼠。

3.分别感染三组小鼠相同剂量的HCoV-OC43(10²TCID50)。

4.攻毒后0.5h多肽CFL1C(4mg/kg)滴鼻处理治疗组小鼠。

5.在攻毒7天后，收集乳鼠肺组织，提取RNA，进行Qpcr分析。

结果与分析：

在乳鼠HCoV-OC43感染模型上，通过滴鼻CFL1C多肽进行预防和治疗研究，结果如图10所示：与病毒对照组相比，CFL1C处理的预防组和治疗组的小鼠肺病毒载量分别减少100倍和10倍，存在显著性差异，其P值分别小于0.001，说明CFL1C可有效预防和治疗HCoV-OC43感染。

实施例9：多肽对蛋白酶的耐受性分析

实验方法：

多肽对胰蛋白酶的耐受性

1.将去PEG脂肽CFL1C和PEG脂肽EK1C4分别设定为其相应的IC90浓度。

2.将CFL1C和EK1C4分别与胰蛋白酶(Sigma)(20μg/ml)在37℃孵育0、15、30、60、120、180分钟取出，加入相应体积的10％FBS终止胰蛋白酶作用，并在金属浴56℃，30min，灭活胰酶，将混合液冻存于-20℃待用。

3.将所有胰蛋白酶作用后的多肽取出后，通过假病毒抑制实验(如实施例3)检测多肽活性受胰酶作用影响。

多肽对蛋白酶K的耐受性

1.将去PEG脂肽CFL1C和PEG脂肽EK1C4分别设定为其相应的IC90浓度。

2.将CFL1C和EK1C4分别与蛋白酶K(Sigma)(1microunit/ml)在37℃孵育0、6、15、30、60、240分钟取出。

3.在取出后立即250g立新5min，吸取上清。将吸出的混合液冻存于-20℃待用。

4.将所有蛋白酶K作用后的多肽取出后，通过假病毒抑制实验(如实施例3)检测多肽活性受胰酶作用影响。

结果与分析：

1.胰蛋白酶处理后的脂肽活性相对于最初活性都有所下降，结果如图11a所示。在胰酶处理后，PEG脂肽EK1C4的活性下降相对于本发明的去PEG脂肽CFL1C更加显著。

2.结果如图11b所示在蛋白酶K处理相同的时间后，CFL1C和EK1C4的活性都逐渐下降，但EK1C4的活性下降相对于CFL1C更明显，具有显著性差异。

这提示本发明的去PEG脂肽CFL1C与PEG脂肽EK1C4相比具有更高的蛋白酶耐受性。

实施例10：多肽热稳定性分析

实验方法：

1.将脂肽CFL1C和EK1C4的储存浓度设置为600μM，分别储存于4℃、室温(RT)、37℃。

2.在不同的时间点(15、30、60、100、120天)取出多肽冻存于-80℃。

3.统一测SARS-CoV-2假病毒抑制，检测多肽抑制活性。

结果与分析：

热稳定性检测结果如图12所示：在4℃储存120天后EK1C4活性降低44倍，而CFL1C降低20倍；在RT储存120天后EK1C4活性降低58倍，而CFL1C降低26倍；在120℃储存120天后EK1C4活性降低92倍，而CFL1C降低48倍；所以，在相同的温度下储存相同的时间，本发明去PEG脂肽CFL1C比PEG脂肽活性降低更少。证明CFL1C的热稳定性更高。

实施例11：多肽对HIV-1的抑制活性

实验方法：

1. 96孔平底板稀释待测多肽，四倍梯度稀释，每种化合物做三个重复孔，对照为不加化合物或多肽。

2.每孔悬空加50μL(＝100TCID50)HIV-IIIB，37℃孵育半小时。

3.处理细胞，将细胞吹匀重悬计数，稀释成3×105/ml，每孔悬空加入100μl MT-2细胞，在含有10％血清的RPMI 1640培养基中37℃培养过夜。

4.12-16h后，移除上清，并换150μl新鲜培养基，37℃继续培养。

5.在感染后第四天观察细胞病毒合胞体情况，并收集50μl/孔上清与等量5％Triton X-100混合裂解病毒，待病毒裂解后(37℃2小时或4℃过夜)。

6.ELISA检测细胞上清中P24抗原含量。

结果与分析：

抗HIV-1IIIB抑制实验结果显示如图13，多肽对HIV-1IIIB都具有抑制效果，其中CFL1C具有最好的抗I型人类免疫缺陷病毒活性，IC50约为2nM。

讨论

发明人通过比较冠状病毒(SARS-CoV-2/SARS-CoV/MERS-CoV/HCoV-OC43)的HR2-CF段氨基酸序列，如图2所示，发现这几个冠状病毒的HR2-CF相对保守，因此发明人提出创新的思路，在HR2区设计了不同长度的多肽(包含口袋结合区)，目的是在胆固醇将多肽N末端锚定细胞膜上的基础上，以HR2-CF段延伸氨基酸代替PEG连接的作用的策略，使多肽的主要结合部位能与病毒的HR1结合。由此设计出CFL1系列去PEG多肽如表所示。发明人通过由SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞融合系统来检测CFL1系列多肽对病毒融合过程的抑制活性，如图3所示，结果显示SEQ ID NO：2多肽CFL1C的活性相对最好。通过SARS-CoV-2的假病毒系统筛选，发现SEQ ID NO：2多肽CFL1C同样具有最好的抗病毒活性，结果与融合抑制结果一致。

在本发明中，还发现本发明的多肽(CFL1C)对其他冠状病毒(SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-NL63、SARSr-CoV-Rs3367和SARSr-CoV-WIV1-CoV)均具有很好的活性，证明CFL1C具有广谱抗冠状病毒活性。同时，发明人成功构建多种SARS-COV-2突变株假病毒，包括目前产生了对一些抗体有抵抗力的南非株(K417N-E484K-N501Y)(B.1.1.7lineage)和英国株(B.1.351lineage)等，本发明的多肽(CFL1C)对这些突变株具有较好的抑制活性IC50均小于0.15μM。进一步，发明人分别在SARS-CoV-2活病毒和HCoV-OC43活病毒的体内和体外系统，检测本发明多肽的抗冠状病毒活性。如图7-8，在体外，CFL1C多肽显示出对活病毒较好的抑制效果，并且CFL1C多肽抑制活性要明显优于CFL1多肽，活性高达数十倍，在SARS-CoV-2活病毒中CFL1C的IC50为1nM，优于CFL1上千倍；在动物体内模型中，将本发明的多肽通过滴鼻给药的方式，结果显示多肽对SARS-CoV-2活病毒和HCoV-OC43活病毒都有有效的预防和治疗效果(图9-10)，其中预防给药效果更好，具有很好的临床用药指导意义。以上结果表明本发明的多肽具有较好的广谱抗HCoVs的活性；此外，发明人检测上述CFL1系列多肽，对HIV-1的抑制活性，结果如图13所示，发现CFL1系列多肽对HIV-1也具有较好的抑制感染效果，且CFL1C多肽活性达到IC50为2nM，活性优于其他多肽，这证明CFL1C多肽具有抗HIV-1活性。

进一步，发明人对多肽的稳定性进行了分析。比较本发明的多肽CFL1C和PEG脂肽EK1C4的对蛋白酶(胰蛋白酶和蛋白酶K)的敏感性，如图11所示，在相同的处理方式下，与酶孵育相同的时间，EK1C4的活性下降多于CFL1C，具有统计学差异。说明本发明的多肽具有更好的酶耐受性。由于有些冠状病毒的爆发具有不确定性，突发性的特点，需要长期储备药物，尤其是热带地区，因此对药物的热稳定性具有较高的要求。本发明建立了检测多肽热稳定性的方法，将CFL1C和EK1C4在不同的温度下(4℃、RT、37℃)储存不同时间(15、30、60、100、120天)，最后检测多肽对SARS-CoV-2的抑制活性，结果如图12所示，在不同温度下储存，多肽的活性都有所下降，但在相同的时间下储存相同的时间，EK1C4的活性下降更多，这提示本发明的多肽具有更高的热稳定性。

综上表明，本发明设计的去PEG新型多肽对多种冠状病毒及HIV-1的感染有很好的抑制活性。并且CFL1C多肽具有较好的稳定性，克服了PEG修饰的一些限制性，本发明的研究为进一步优化广谱抗冠状病毒多肽和去PEG策略提供了思路，本发明的多肽有望进一步开发成为目前仍在流行的SARS-CoV-2以及未来有可能爆发的类SARS病毒的预防和治疗的候选药物，且可以发展作为预防和治疗HIV-1的药物。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。例如，将一个实施例描述的部分特征与另一个实施例进行结合以产生又一个实施例；将一个或多个要素进行替换或组合以得到新的要素。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

本文提及的所有专利文献和非专利文献均通过引用被并入本文，达到如同每个参考文献被单独且具体指出的程度，以在本文中被完整地阐述。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 多肽、其制备方法和用途

<130> CN017-21010PICN

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Asn Val Thr Phe Leu Asp Leu Glu Tyr Glu Met Lys Lys Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ala Ile Lys Lys Leu Glu Glu Ser Tyr Ile Asp Leu Lys Glu Leu Gly

20 25 30

Thr Tyr Glu Tyr

35