阅读说明：本技术 一种裸盖鱼***冷冻保存的方法 (Method for preserving sperm of naked-cap fish by freezing ) 是由 王伟 罗珺 张赛赛 李梦瑶 李雪洁 成智丽 于 2019-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种裸盖鱼精子冷冻保存的方法,包括精子的获取、培养液的制备、精子的冻存过程、精子的复苏与激活过程；针对性成熟的裸盖鱼,采用人工麻醉的方法获取精子；根据裸盖鱼的精子渗透压,制备精子培养液；将采集到的精液与培养液按1∶2的体积比混合制得混合液,然后加入混合液体积10％的二甲基亚砜制成精子冻存混合液；将混匀后的精子冻存混合液样品置于4℃冰箱中15min,接着于液氮罐瓶口处静置5min后向下移,液氮液面上方再置5min,液氮液面再置5min,然后浸入液氮中冷冻保存。本发明方法使裸盖鱼精子保存工作更加便捷有效,避免了裸盖鱼精子在体外快速失活和死亡,提高了精子的保存质量,延长了保存时间,使裸盖鱼精子在实际生产中随用随取。(The invention discloses a method for preserving sperm of a naked gesso by freezing, which comprises the steps of obtaining the sperm, preparing a culture solution, freezing the sperm, and recovering and activating the sperm; obtaining sperms of the sexually mature naked capers by adopting an artificial anesthesia method; preparing a sperm culture solution according to the sperm osmotic pressure of the bare cap fish; mixing the collected semen and the culture solution according to the volume ratio of 1: 2 to prepare a mixed solution, and then adding dimethyl sulfoxide with the volume of 10% of the mixed solution to prepare a sperm cryopreservation mixed solution; placing the mixed sperm frozen mixed solution sample in a refrigerator at 4 deg.C for 15min, standing at the bottle mouth of a liquid nitrogen tank for 5min, moving downwards, placing above the liquid level of the liquid nitrogen for 5min, placing the liquid level of the liquid nitrogen for 5min, and soaking in liquid nitrogen for freezing. The method of the invention leads the preservation work of the sperm of the naked caper to be more convenient and effective, avoids the rapid inactivation and death of the sperm of the naked caper in vitro, improves the preservation quality of the sperm, prolongs the preservation time and leads the sperm of the naked caper to be taken at any time in the actual production.)

一种裸盖鱼***冷冻保存的方法

技术领域

本发明涉及生物***保存领域，尤其涉及一种关于鱼类***保存方法。

背景技术

裸盖鱼隶属于辐鳍鱼纲、鲉形目、黑鲉科、裸盖鱼属，分布于北太平洋沿岸。作为深水底栖经济鱼类，裸盖鱼个体大、肉质白嫩、营养丰富，具有极高的经济价值。事实上早在1800年就有关于商业开发裸盖鱼的报道。目前，俄罗斯、日本、加拿大及美国均将裸盖鱼视为重要的渔业资源，并逐步对其基础生物学开展研究。据报道，裸盖鱼成鱼体长50～70cm，寿命可达100岁以上(已知最大为114岁)，其快速生长时间为5～7年，此时，约有50％的个体发育至性成熟，10～15年则全部发育至性成熟，并且生长趋于停滞。现在，美国、加拿大等国家的科研人员在资源分布、摄食习性、繁殖行为、营养需求、染色体核型、环境适应性及工厂化养殖等方面开展了裸盖鱼相关研究，初步掌握了该鱼的繁殖习性，突破了其人工繁育技术。2013年裸盖鱼被引入我国，并在北方沿海试养成功，为该鱼种质资源研究提供了很好的原材料，同时也为我国海水鱼类工厂化养殖提供了一个优良品种。

已知，国内对于裸盖鱼的***保存方法未见报道，没有合适的裸盖鱼***冷冻保存方法，这也是限制人工繁育裸盖鱼的技术瓶颈之一。

发明内容

本发明目的在于提供一种裸盖鱼***冷冻保存的方法，通过对裸盖鱼的***进行冷冻保存，并做激活、复苏处理，获得了优质的***，为进一步实施裸盖鱼的育种工作提供技术保障，解决裸盖鱼繁育过程中***保存困难的问题，突破裸盖鱼人工繁育的瓶颈。

为了解决上述技术问题，本发明所述方法主要包括***的获取、培养液的制备、***的冻存过程、***的复苏与激活过程；

具体步骤如下：

S1，针对性成熟的裸盖鱼，采用人工麻醉的方法获取***；

S2，根据裸盖鱼的***渗透压，制备***培养液；

S3，将采集到的***与培养液按1∶2的体积比混合制得混合液，然后加入混合液体积10％的二甲基亚砜制成***冻存混合液；

S4，将混匀后的***冻存混合液样品置于4℃冰箱中15min，接着于液氮罐瓶口处静置5min后向下移，液氮液面上方再置5min，液氮液面再置5min，然后浸入液氮中冷冻保存；

S5，冷冻保存24h后，将***冻存液样品从液氮中取出，置于室温解冻 15min，再置于10℃水中解冻15min，用培养液与冻存***2∶1的体积比的量来激活***，再用台盼蓝染色液与激活后的***按体积比1∶9将***染色，放于显微镜下观察、评价***活力，用血球计数板进行计数。

进一步的，所述培养液的配方为：氯化钠0.8～1.7g、碳酸氢钠0.06～0.07g、无水氯化钙0.064～0.069g、葡萄糖1.4～1.7g、Tris碱0.04～0.06g、胎牛血清0.4～0.5g、谷胱甘肽0.12～0.13g。

与现有技术相比，本发明方法的有益效果：

1、使裸盖鱼***保存工作更加便捷有效，适宜的保存方法避免了裸盖鱼***在体外快速失活和死亡，提高了***的保存质量，延长了保存时间，使裸盖鱼***在实际生产中随用随取。进一步完善和促进了裸盖鱼的繁育工作，为渔业产量、生物多样性和可持续发展提供基础保障。

2、***长期冻存对其种质的保存具有决定性的影响。经过多重保存液配方的筛选，选择出的保存液配方使冷冻复苏后的***成活率达60％。

3、为保护裸盖鱼的种质资源，对其***长期冷冻保存技术进行探索和研究，不仅对进一步理解基本的生命进程具有重要意义，同时对于裸盖鱼的人工繁育也具有重要的意义。

具体实施方式

下面对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

本发明所述方法主要包括***的获取、培养液的制备、***的冻存过程、***的复苏与激活过程；

实施例1：

S1，针对性成熟的裸盖鱼，采用人工麻醉的方法获取***；

S2，根据裸盖鱼的***渗透压，制备***培养液；所述培养液的配方为：氯化钠0.8g、碳酸氢钠0.06g、无水氯化钙0.064g、葡萄糖1.4g、Tris碱0.04g、胎牛血清0.4g、谷胱甘肽0.12g。

S3，将采集到的***与培养液按1∶2的体积比混合制得混合液，然后加入混合液体积10％的二甲基亚砜制成***冻存混合液；

S4，将混匀后的***冻存混合液样品置于4℃冰箱中15min，接着于液氮罐瓶口处静置5min后向下移，液氮液面上方再置5min，液氮液面再置5min，然后浸入液氮中冷冻保存；

S5，冷冻保存24h后，将***冻存液样品从液氮中取出，置于室温解冻 15min，再置于10℃水中解冻15min，用培养液与冻存***2∶1的体积比的量来激活***，再用台盼蓝染色液与激活后的***按体积比1∶9将***染色，放于显微镜下观察、评价***活力，用血球计数板进行计数。

实施例2：

S1，针对性成熟的裸盖鱼，采用人工麻醉的方法获取***；

S2，根据裸盖鱼的***渗透压，制备***培养液；所述培养液的配方为：氯化钠1.7g、碳酸氢钠0.07g、无水氯化钙0.069g、葡萄糖1.7g、Tris碱0.06g、胎牛血清0.5g、谷胱甘肽0.13g。

S3，将采集到的***与培养液按1∶2的体积比混合制得混合液，然后加入混合液体积10％的二甲基亚砜制成***冻存混合液；

S4，将混匀后的***冻存混合液样品置于4℃冰箱中15min，接着于液氮罐瓶口处静置5min后向下移，液氮液面上方再置5min，液氮液面再置5min，然后浸入液氮中冷冻保存；

S5，冷冻保存24h后，将***冻存液样品从液氮中取出，置于室温解冻15min，再置于10℃水中解冻15min，用培养液与冻存***2∶1的体积比的量来激活***，再用台盼蓝染色液与激活后的***按体积比1∶9将***染色，放于显微镜下观察、评价***活力，用血球计数板进行计数。

实施例3：

S1，针对性成熟的裸盖鱼，采用人工麻醉的方法获取***；

S2，根据裸盖鱼的***渗透压，制备***培养液；所述培养液的配方为：氯化钠1.4g、碳酸氢钠0.065g、无水氯化钙0.067g、葡萄糖1.5g、Tris碱0.05g、胎牛血清0.45g、谷胱甘肽0.125g。

S3，将采集到的***与培养液按1∶2的体积比混合制得混合液，然后加入混合液体积10％的二甲基亚砜制成***冻存混合液；

S4，将混匀后的***冻存混合液样品置于4℃冰箱中15min，接着于液氮罐瓶口处静置5min后向下移，液氮液面上方再置5min，液氮液面再置5min，然后浸入液氮中冷冻保存；

S5，冷冻保存24h后，将***冻存液样品从液氮中取出，置于室温解冻 15min，再置于10℃水中解冻15min，用培养液与冻存***2∶1的体积比的量来激活***，再用台盼蓝染色液与激活后的***按体积比1∶9将***染色，放于显微镜下观察、评价***活力，用血球计数板进行计数。

本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。