托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1及其应用
阅读说明：本技术 托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1及其应用 (Tropine alkaloid transporter AbTAUP1 and application thereof ) 是由 廖志华 陈敏 杨春贤 曾俊岚 邱飞 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1及其应用,托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示,或SEQ ID NO.8所示序列经一个或几个氨基酸残基的取代、突变或缺失且编码具有相同功能的氨基酸序列；该蛋白在侧根中的表达量最高,在主根中表达量较低,且定位于细胞质膜,推测具有莨菪碱转运功能,通过酵母转运实验验证了其莨菪碱转运功能,并在颠茄植株中过表达AbTAUP1提高颠茄中的莨菪碱产量,因此可用于提供莨菪碱合成植物中莨菪碱转运能力,提高莨菪碱产量,对提高托品烷生物碱在植物种的含量具有重要意义。(The invention discloses tropine alkaloid transport protein AbTAUP1 and application thereof, wherein the amino acid sequence of tropine alkaloid transport protein AbTAUP1 is shown as SEQ ID NO.8, or the sequence shown as SEQ ID NO.8 is substituted, mutated or deleted by one or more amino acid residues and encodes an amino acid sequence with the same function; the protein has the highest expression level in lateral roots and lower expression level in main roots, is positioned at a cytoplasmic membrane, is supposed to have a hyoscyamine transport function, is verified to have the hyoscyamine transport function through a yeast transport experiment, and is overexpressed AbTAUP1 in a belladonna plant to improve the hyoscyamine yield in the belladonna, so that the protein can be used for providing the hyoscyamine transport capability in a hyoscyamine synthetic plant and improving the hyoscyamine yield, and has important significance for improving the content of tropane alkaloids in plant species.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1，还涉及托品烷生物碱转运蛋白的应用。
背景技术
托品烷生物碱(Tropane Alkaloid，TA)是一类作用于副交感神经的抗胆碱药物。其代表性药物莨菪碱、东莨菪碱及其衍生物已广泛用于麻醉剂、治疗帕金森、因平滑肌痉挛引起的多种脏器绞痛和哮喘等方面，市场需求巨大。目前托品烷生物碱仍完全依赖于从少数茄科药用植物中提取，包括颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stramonium)和莨菪(Hyoscyamus niger)。颠茄是《中国药典》收录并规定的用于生产莨菪碱和东莨菪碱的商业栽培药源植物。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02％～0.17％(干重)，东莨菪碱含量仅为干重的0.01％～0.08％。因此，培育托品烷生物碱高产药用植物一直是该行业长期追求的目标。随着基因工程技术的快速发展，基于靶向改造生物合成途径的代谢工程方法已成为提高药源植物中莨菪碱和东莨菪碱含量的重要手段。近年来，酵母工程化平台的建立和合成生物学的发展，为解决市场上托品烷生物碱资源短缺提供了一种可能的策略。但目前托品烷生物碱全合成酵母菌株中，莨菪碱产量最高仅为80μg.L-1，东莨菪碱产量最高仅为30μg.L-1，远低于商业生产需求。
颠茄、曼陀罗和莨菪等托品烷生物碱药源植物全株富含莨菪碱，但已有研究表明，莨菪碱生物合成途径酶基因均在植物次生根中特异性表达。因此，莨菪碱虽然只在植物的次生根中特异性合成，但会被转运至地上部分进行储存。次生根是生物合成的“源”，而地上部分则为储存用的“库”。增强“源”至“库”的转运过程有利于拉动生物合成的代谢流。因此，托品烷生物碱转运蛋白对托品烷生物碱植物代谢工程和微生物合成生物学都具有非常重要的应用价值。但遗憾的是，至今仍未见由托品烷生物碱转运蛋白的相关报道。因此，急需对托品烷生物碱转运蛋白，以提高植株中莨菪碱产量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1；本发明的目的之二在于提供含有编码所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1基因的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供含有编码所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1基因的宿主；本发明的目的之四在于提供所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1在提高莨菪碱合成植物莨菪碱含量中的应用；本发明的目的之五在于提供所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1在提高莨菪碱合成植物中莨菪碱转运能力中的应用；本发明的目的之六在于提供提高莨菪碱合成植物中莨菪碱含量的方法。
为达到上述目的，首次发现了一个托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1，通过酵母转运实验验证了其莨菪碱转运功能，并在颠茄植株中过表达AbTAUP1提高颠茄中的莨菪碱产量，具体方案如下：
1、托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1，所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，或SEQ ID NO.8所示序列经一个或几个氨基酸残基的取代、突变或缺失且编码具有相同功能的氨基酸序列。
优选的，编码所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，或SEQ ID NO.7所示序列经一个或几个核苷酸的取代、突变或缺失且编码具有相同功能的核苷酸序列。
2、含有编码所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1基因的重组表达载体。
优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.7所示序列通过BamHI和SacI连入pBI121载体而得。
3、含有编码所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1基因的宿主。
优选的，所述宿主为颠茄。
4、所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1在提高莨菪碱合成宿主莨菪碱含量中的应用。
优选的，所述莨菪碱合成宿主为颠茄、曼陀罗、莨菪、三分三或酵母。
5、所述托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1在提高莨菪碱合成宿主中莨菪碱转运能力中的应用。
6、提高莨菪碱合成植物中莨菪碱含量的方法，构建含有编码托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1基因的重组表达载体，然后将重组表达载体在莨菪碱合成植物中表达，获得莨菪碱含量高的品种；所述编码托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示或SEQ ID NO.7所示序列经一个或几个核苷酸的取代、突变或缺失且编码具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的有益效果在于：本发明首次发现了一个托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1，该蛋白在侧根中的表达量最高，在主根中表达量较低，且定位于细胞质膜，推测具有莨菪碱转运功能，通过酵母转运实验验证了其莨菪碱转运功能，并在颠茄植株中过表达AbTAUP1提高颠茄中的莨菪碱产量，因此可用于提供莨菪碱合成植物中莨菪碱转运能力，提高莨菪碱产量，对提高托品烷生物碱在植物种的含量具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为AbTAUP1基因在颠茄各个组织中的表达谱分析；
图2为亚细胞定位结果；
图3为酵母检测细胞中的莨菪碱转运情况；
图4为野生型颠茄和AbTAUP1过表达颠茄根中AbTAUP1基因表达量检测结果；
图5为野生型颠茄和AbTAUP1过表达颠茄根中莨菪碱含量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、组织表达模式分析筛选潜在的托品烷生物碱转运蛋白
(1)转录组分析筛选潜在的托品烷生物碱转运蛋白
嘌呤碱基转运蛋白(Purine nucleobase transmembrane transporter，PUNUT)家族广泛存在于植物和真菌中，会参与细胞分裂素、咖啡因和尼古丁等植物代谢物的转运。Pfam数据库中对应的隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)登录号为PF16913.5，利用PF16913.5模型在颠茄转录组鉴定到19条候选基因，将以上候选基因与托品烷生物碱合成途径酶基因进行组织表达聚类分析，获得一个在根中高表达的PUNUT家族转运蛋白基因，与托品烷生物碱合成途径酶基因表达相关性较高，推测其有可能参与托品烷生物碱转运，命名为颠茄托品烷生物碱转运蛋白1(Tropane Alkaloid Uptake Permease 1，AbTAUP1)。
(2)qPCR验证其表达模式
分别取小份的新鲜野生颠茄主根、须根、茎和叶材料放入液氮中速冻，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。测定RNA的浓度，并按照天根FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA，建立颠茄主根、侧根、茎和叶的cDNA文库。以AbPGK为内参基因，AbTAUP1为目的基因进行荧光定量PCR。根据2-△△Ct方法计算各基因的相对表达量，具体引物序列如下：
qAbTAUP1-F：5’-gagtcacatgctatgcttca-3’(SEQ ID NO.1)；
qAbTAUP1-R：5’-tgagtcatctcagcttctgt-3’(SEQ ID NO.2)；
qAbPGK-F：5’-tcgctcttggagaaggttgac-3’(SEQ ID NO.3)；
qAbPGK-R：5’-cttgtcggcaatcactacatcag-3’(SEQ ID NO.4)；
根据qPCR结果分析AbTAUP1基因在颠茄各个组织中的表达情况，结果如图1所示。结果显示，AbTAUP1在根中表达量较高，在茎和叶片中表达量较低，与转录组表达分析结果一致，进一步说明转运蛋白AbTAUP1极有可能参与托品烷生物碱的转运。
(3)基因克隆
按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提颠茄无菌苗侧根总RNA，并按照天根FastKingcDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA。根据颠茄转录组筛选而获得的AbTAUP1基因核心序列进行分析，发现该基因5′端完整，只需设计3′端RACE特异性引物，通过RACE技术将3′端的序列补齐得到AbTAUP1的全长电子序列。根据电子拼接的全长序列设计该基因的特异性引物，基因编码区特异性引物如下：
AbTAUP1-F：5’-atggaatctcaaattgctag-3’(SEQ ID NO.5)；
AbTAUP1-R：5’-ttatattggaggggattgag-3’(SEQ ID NO.6)；
以颠茄cDNA为模板，使用基因编码区特异性引物进行PCR扩增，利用琼脂糖电泳检测确认PCR产物大小，回收目的条带后进行测序，最终成功获得AbTAUP1的cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
实施例2、AbTAUP1的亚细胞定位分析
(1)亚细胞定位载体的构建
对AbTAUP1蛋白的跨膜结构域进行预测发现该蛋白含有十个跨膜结构域，几乎整条蛋白贯穿膜结构，因此AbTAUP1蛋白很可能在细胞膜上发挥对底物的转运能力。为了验证AbTAUP1蛋白是跨膜蛋白，构建了亚细胞定位载体，对AbTAUP1进行亚细胞定位分析。购买的pm-ck/CD3-1001质粒(购买连接https://abrc.osu.edu/stocks/764634)，可表达融合了青色荧光蛋白CFP的质膜定位蛋白PM-CFP，作为质膜标记信号。转化农杆菌GV3101后，获得工程菌株GV3101-pCD3-1001。
通过分析AbTAUP1基因编码区限制性酶切位点，再结合pGD3G-YFP(https://doi.org/10.1046/j.1365-313X.2002.01360.x)载体的多克隆位点。最终选取XhoI和HindIII作为酶切位点设计上下游特异性引物。引物序列如下：
pGD3G-AbTAUP1-F:5’-cgc ctcgagatggaatctcaaattgctag-3’(SEQ ID NO.9)；
pGD3G-AbTAUP1-R:5’-cgc aagctttattggaggggattgagtca-3’(SEQ ID NO.10)。
PCR扩增后，将载体和PCR产物双酶切后进行连接，测序成功后获得重组质粒pGD3G-AbTAUP1-YFP。该质粒表达的AbTAUP1和黄色荧光蛋白YFP形成融合蛋白。将重组质粒和pGD3G-YFP转入农杆菌GV3101后，获得工程菌株GV3101-pGD3G-AbTAUP1-YFP和GV3101-YFP。
(2)亚细胞定位分析
将活化的GV3101-YFP、GV3101-pGD3G-AbTAUP1-YFP和GV3101-pCD3-1001工程菌分别在28℃，200rpm的条件下过夜培养。将阳性菌4500rpm离心6min，弃去培养基。用终浓度为10mM的MES、10mM的MgCl2和40mM的AS(乙酰丁香酮)混合液轻柔重悬菌体，调菌液OD600＝0.6，室温放置3h。用不同的菌液混合，设置两组实验。用不加针头的注射器将混合后的菌液注射进6～8周大的本氏烟草叶片中，弱光培养48h后，用纤维素酶和果胶酶裂解烟草叶片，获得原生质体，使用激光共聚焦显微镜Olympus FV1000拍照，结果如图2所示。结果显示，游离YFP黄色荧光信号与PM-CFP青色荧光信号不完全重合，这是因为单独的YFP荧光蛋白在烟草细胞中无特异的空间定位。AbTAUP1-YFP黄色荧光与质膜定位信号PM-CFP青色荧光几乎完全重合，仅在质膜上表达，表明AbTAUP1定位于细胞质膜。
实施例3、AbTAUP1在酵母中的应用
(1)酵母转运载体和工程菌株的构建
通过构建酵母转运载体来研究AbTAUP1基因是否具有转运托品烷生物碱的能力。根据酵母表达载体pDR196的多克隆位点，设计带有PstI和XhoI限制性内切酶切割位点的上下游引物。具体引物如下：
pDR-AbTAUP1-F：5’-ggg ctgcagatggaatctcaaattgctag-3’(SEQ ID NO.11)；
pDR-AbTAUP1-F：5’-ccc ctcgagttatattggaggggattgag-3’(SEQ ID NO.12)。
进行PCR扩增后，将pDR196质粒和PCR产物双酶切回收后进行连接，最终成功获得重组质粒pDR196-AbTAUP1。
采用化学法转化酵母细胞，将pDR196-AbTAUP1重组质粒转入酿酒酵母突变株系ADR8中，该突变株系缺少了8个酵母内源性膜转运蛋白，被广泛应用于研究转运蛋白的功能。同时将转化了pDR196空载的ADR8突变体酵母菌株作为对照，使用上述转基因酵母进行后续饲喂实验。
(2)莨菪碱饲喂工程酵母
将转基因工程酵母按0.05％接种量接种于50mL尿嘧啶缺陷型液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养至OD600＝1，每组设置3个生物学重复。离心菌体，弃上清，再次加入50mL1/2尿嘧啶缺陷型培养基，同时分别向培养基中加入0.5mM的莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱，30℃，220rpm摇床培养。3小时候取样，离心收集菌体，加预冷的ddH2O洗涤三次。加入100μL提取液(含50％乙醇、49.5％甲醇和0.05％的乙酸，体积比)，然后加入100μL体积的玻璃珠，涡旋震荡仪震荡破碎15min，离心取上清，待HPLC分析。
(3)HPLC测定酵母细胞中的莨菪碱的含量
利用日本岛津Shimadzu高效液相色谱仪测定酵母细胞中的莨菪碱的含量。具体仪器参数如下：
色谱仪：日本岛津Shimadzu高效液相色谱仪(系统控制器：CBM-20Alite，泵：LC-20AD)；
柱温箱：CTO-20A，检测器：SPD-M20A，自动进样器：SIL-20A)；
色谱柱：PHenomenex Gemini 5 u C18 110A液相色谱柱(250×4.6mm，5micron)；
流动相：乙腈:乙酸铵缓冲液(含20mM乙酸胺，0.1％甲酸，pH＝4.0)＝11:89；
流速：1mL/min；
检测波长：226nm；
柱温：40℃；
进样量：20μL；
检测结果如图3所示。HPLC结果分析表明，对照组pDR196酵母菌株对莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱均无转运能力；而pDR196-AbTAUP1的转化酵母菌株只对莨菪碱有明显的转运能力，对东莨菪碱和山莨菪碱无转运能力。该结果表明，AbTAUP1是一个定位于质膜的莨菪碱特异性转运蛋白。
实施例4、AbTAUP1在植物代谢工程中的应用
(1)过表达载体构建
为了评估在植物体内过表达AbTAUP1是否影响颠茄中托品烷生物碱的转运和含量变化，本研究通过构建过表达载体，利用颠茄植株开展植物代谢工程。选择植物表达载体pBI121作为颠茄植株的过表达载体，根据上文得到的AbTAUP1编码区序列，分析序列包含的酶切位点，结合过表达载体pBI121的克隆位点携带的酶切位点。设计上游引入的酶切位点为BamHI，下游引入的酶切位点为SacI。具体引物序列如下：
pBI121-AbTAUP1-F:5’-cgc ggatccatggaatctcaaattgctag-3’(SEQ ID NO.13)；
pBI121-AbTAUP1-R:5’-cgc gagctcttatattggaggggattgag-3’(SEQ ID NO.14)；
利用上述引物进行PCR扩增后，将pBI121质粒和PCR产物双酶切回收后进行连接，最终成功获得过表达重组质粒pBI121-AbTAUP1。
(2)颠茄植株的遗传转化
将上述构建的植物过表达载体pBI121-AbTAUP1采用冻融法转化农杆菌EHA105，经过PCR阳性鉴定，成功获得工程菌株用于后续的遗传转化。
颠茄种子用赤霉素溶液浸泡过夜，隔夜再用自来水冲洗1天后进行消毒处理。分别用75％的乙醇消毒1min和50％的NaClO溶液消毒20min，期间充分震荡，以保证消毒充分。最后用无菌水清洗5～6次。将消毒后的颠茄种子用镊子放置到无菌的吸水纸上将多余水分吸干，再接种到MS+200mg/LCef的固体培养基上25℃，16h/8h(光照/黑暗)光照条件，培养15天左右)，将出芽的颠茄野生型幼苗移入MS固体培养基的玻璃瓶中备用。
将活化好的工程菌用灭菌的加了AS的MS液体培养基轻柔重悬菌体，调OD600到0.3～0.5左右。在超净工作台中剪下颠茄叶片，加入到重悬好的农杆菌菌液中，侵染5～8min左右。将其平铺于MS固体共培养培养基(MS+AS+6-BA 1.0mg/L+NAA1.0mg/L)上，28℃暗培养2天。2天后将其转至不同抗生素的分化固体培基上，过表达载体的筛选培养基为(MS+NAA1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+Cef 200mg/L+Kan 8mg/L)，每隔一周更换一次筛选培养基，直至长出丛生芽。将丛生芽剪下，转到生根培养基(1/2MS+0.05g/L NAA)上诱导生根。将再生植株从罐子中取出，清洗干净根部的培养基，种在栽培基质(蛭石：草炭土：珍珠岩＝6：3：1)中，在25℃、16h/8h(光照/黑暗)的人工气候室培养。通过基因组PCR检测筛选到阳性的AbTAUP1过表达转基因颠茄植株。取野生型颠茄和AbTAUP1过表达颠茄根进行实时荧光定量PCR分析AbTAUP1基因表达量，方法同前面一样。如图4结果显示，过表达株系中AbTAUP1表达量是野生型对照的10-26倍，说明已成功获得AbTAUP1基因被过量表达的颠茄植株。
(3)HPLC分析颠茄中莨菪碱的含量
将在培养室里生长3个月的阳性颠茄苗的根和叶分别收集于干净的信封中，40℃烘干，研磨成粉，提取生物碱。具体方法是称取0.1g左右干粉转移至50mL EP管中，加入10mL生物碱提取液，超声破碎1h，后静置过夜；过夜萃取后，再超声1h萃取，静置1h以上；用滤纸过滤上述提取液，用5mL氯仿洗涤残渣，滤液和洗涤液全部收集于50mL烧杯中，40℃烘箱烘干；挥干的残渣用5mL氯仿和2mL 1M H2SO4混合液超声溶解，充分混匀后转移至10mL EP管中，4000rpm离心10min；弃去下层有机废液，向EP管中加入1.5mL氨水使溶液碱化，后用3mL氯仿萃取生物碱，收集氯仿相于50mL烧杯中；再用2mL氯仿萃取一次，合并两次氯仿相；40℃烘干氯仿，用1mL甲醇溶解生物碱；用滤头过滤生物碱，HPLC检测。HPLC具体仪器参数如上所述，结果如图5所示。HPLC结果分析表明，野生型颠茄叶片中莨菪碱的含量为1.54mg/g，而根中莨菪碱为1.34mg/g。在过表达AbTAUP1颠茄植株的叶片和根中莨菪碱含量均极显著提高，叶片中莨菪碱含量为2.36-3.01mg/g，是野生型的153％-195％；根中莨菪碱含量为1.81-2.44mg/g，是野生型的135％-182％。该结果说明，过表达AbTAUP1有利于增强颠茄中莨菪碱从“源”至“库”的转运，并拉动了合成代谢流，最终有效地提高了莨菪碱的积累。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 托品烷生物碱转运蛋白AbTAUP1及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtcacatg ctatgcttca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagtcatct cagcttctgt 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgctcttgg agaaggttga c 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttgtcggca atcactacat cag 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggaatctc aaattgctag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttatattgga ggggattgag 20
<210> 7
<211> 1059
<212> DNA
<213> 颠茄(Atropa belladonna)
<400> 7
atggaatctc aaattgctag tcccactatg aaaaaattcc tcatcctgat aaactctatt 60
cttctcttca ctagcaattg cgctggccct ttaattattc gcctctattt catccgtggt 120
ggatcaagaa tatggctatc atgttctcta ataaccggtg gcttcccttt tactctcttc 180
ctcctcatca tagcctattt ccatcgtcga aaatccaatg gaccggacaa tagtactaag 240
atactgctca tgactcgtaa attatttata gcttgcttaa tttctggctt agtcactggc 300
atggttgatt atttctacgc ttttggttca gccaaattac ccgtctccac atcctctctc 360
cttacttcaa ctcaactagt ttttacagcg attttcgctt tcctaattgt caagcaaaaa 420
ttcacatcgt attcgattaa tgctgtggtt gtattaactc ttggagctgg aattttggcc 480
cttggtgcaa gtagtgatag gccagcaggg gagtcaagta aggcatatat tgtagggttt 540
attatgacac tgcttgctgc attattttat ggatttgttc tggcattcaa cgaagtaagt 600
tttaggaaaa caaagaaggt tattgccttt acattggttt tggagtttca gatgatgatg 660
tgtttctttg ctactgcttt ttgtgtcacg gggatgctta ttaacaagga tattcaggca 720
attccaaggg aggcaaaaca atttgagtta ggtgaaggca aatattacat gcttatagta 780
ttgagtgccc tcatatggca aattttcttt gttggagcca ttggagtcac atgctatgct 840
tcagcattac tctctggaat tttgatagct gcttcacttt cagttacaga agtgttggct 900
gttattttct ttcatgaaaa aattggaggt gaaaagggat tctcacttgc cctctctctt 960
tggggatttg tttcttattt ttatggtgag atcaaacaaa ccaataaaaa gaagaattta 1020
actacagaag ctgagatgac tcaatcccct ccaatataa 1059
<210> 9
<211> 352
<212> PRT
<213> 颠茄(Atropa belladonna)
<400> 9
Met Glu Ser Gln Ile Ala Ser Pro Thr Met Lys Lys Phe Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Asn Ser Ile Leu Leu Phe Thr Ser Asn Cys Ala Gly Pro Leu Ile
20 25 30
Ile Arg Leu Tyr Phe Ile Arg Gly Gly Ser Arg Ile Trp Leu Ser Cys
35 40 45
Ser Leu Ile Thr Gly Gly Phe Pro Phe Thr Leu Phe Leu Leu Ile Ile
50 55 60
Ala Tyr Phe His Arg Arg Lys Ser Asn Gly Pro Asp Asn Ser Thr Lys
65 70 75 80
Ile Leu Leu Met Thr Arg Lys Leu Phe Ile Ala Cys Leu Ile Ser Gly
85 90 95
Leu Val Thr Gly Met Val Asp Tyr Phe Tyr Ala Phe Gly Ser Ala Lys
100 105 110
Leu Pro Val Ser Thr Ser Ser Leu Leu Thr Ser Thr Gln Leu Val Phe
115 120 125
Thr Ala Ile Phe Ala Phe Leu Ile Val Lys Gln Lys Phe Thr Ser Tyr
130 135 140
Ser Ile Asn Ala Val Val Val Leu Thr Leu Gly Ala Gly Ile Leu Ala
145 150 155 160
Leu Gly Ala Ser Ser Asp Arg Pro Ala Gly Glu Ser Ser Lys Ala Tyr
165 170 175
Ile Val Gly Phe Ile Met Thr Leu Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Gly Phe
180 185 190
Val Leu Ala Phe Asn Glu Val Ser Phe Arg Lys Thr Lys Lys Val Ile
195 200 205
Ala Phe Thr Leu Val Leu Glu Phe Gln Met Met Met Cys Phe Phe Ala
210 215 220
Thr Ala Phe Cys Val Thr Gly Met Leu Ile Asn Lys Asp Ile Gln Ala
225 230 235 240
Ile Pro Arg Glu Ala Lys Gln Phe Glu Leu Gly Glu Gly Lys Tyr Tyr
245 250 255
Met Leu Ile Val Leu Ser Ala Leu Ile Trp Gln Ile Phe Phe Val Gly
260 265 270
Ala Ile Gly Val Thr Cys Tyr Ala Ser Ala Leu Leu Ser Gly Ile Leu
275 280 285
Ile Ala Ala Ser Leu Ser Val Thr Glu Val Leu Ala Val Ile Phe Phe
290 295 300
His Glu Lys Ile Gly Gly Glu Lys Gly Phe Ser Leu Ala Leu Ser Leu
305 310 315 320
Trp Gly Phe Val Ser Tyr Phe Tyr Gly Glu Ile Lys Gln Thr Asn Lys
325 330 335
Lys Lys Asn Leu Thr Thr Glu Ala Glu Met Thr Gln Ser Pro Pro Ile
340 345 350
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcctcgaga tggaatctca aattgctag 29
<210> 11
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 12
<211> 29
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<210> 13
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<210> 14
<211> 29
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<210> 15
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cgcgagctct tatattggag gggattgag 29