耐盐相关蛋白IbWRKY32及其编码基因与应用
阅读说明：本技术 耐盐相关蛋白IbWRKY32及其编码基因与应用 (Salt tolerance related protein IbWRKY32 and coding gene and application thereof ) 是由 翟红 刘庆昌 何绍贞 高少培 张欢 孙思凡 李思语 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蛋白质IbWRKY32在调控植物耐盐性中的应用。本发明首先公开了一种蛋白质在提高植物耐盐性中的应用；所述蛋白质为氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的蛋白质或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。本发明进一步公开了上述蛋白相关生物材料及其应用。本发明发现了IbWRKY32蛋白及其编码基因,并将IbWRKY蛋白的编码基因导入烟草中,得到转基因烟草植株。将转基因植株进行盐胁迫处理,其耐盐性增强,在植物耐盐的过程中起着重要的作用,在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。(The invention discloses an application of protein IbWRKY32 in regulation and control of plant salt tolerance. The invention firstly discloses the application of protein in improving the salt tolerance of plants; the protein is a protein with an amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1 or a fusion protein obtained by connecting protein labels to the N end or/and the C end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1. The invention further discloses the protein-related biomaterial and application thereof. The invention discovers IbWRKY32 protein and an encoding gene thereof, and introduces the encoding gene of the IbWRKY protein into tobacco to obtain a transgenic tobacco plant. The transgenic plant is subjected to salt stress treatment, the salt tolerance of the transgenic plant is enhanced, the transgenic plant plays an important role in the salt tolerance process of the plant, and the transgenic plant has wide application space and market prospect in the agricultural field.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及耐盐相关蛋白IbWRKY32及其编码基因与应用。
背景技术
自然界中，高温、高盐、低温、水涝、干旱以及病虫草害等逆境会影响植物的形态结构、生理生化过程进而使其正常生长发育停滞、品质下降、产量降低。其中干旱与盐碱是危害植物生长，对全球农作物产量影响程度最高的胁迫因素。目前，中国盐碱地与全球盐碱地面积分别达0.27×108hm2与9.5×108hm2，后者几乎占据了10％的世界地表面积。农作物种植在中等盐渍土上时会减产约95％，如黄淮海平原各地由于盐碱导致的减产平均约为25％，严重的甚至达到50％。因此，探究植物的抗逆机理对于挖掘抗逆基因，并用基因工程改良植物的抗逆性具有重要意义。甘薯虽然是耐旱作物，但缺水时，同其它作物一样，生长发育、生理和产量均会受到影响。通过对植物耐盐抗旱机理的深入研究，挖掘耐盐抗旱基因资源，培育耐盐抗旱甘薯新品种是利用盐碱地、干旱半干旱资源最经济、有效的措施之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何提高植物的耐盐性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用，所述应用可为蛋白质或调控所述蛋白质编码基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物耐盐性中的应用，所述蛋白质可以是IbWRKY32蛋白，所述IbWRKY32蛋白可以是如下任一种的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物耐盐性功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
进一步地，所述蛋白质可来源于甘薯。
其中，SEQ ID No.1由495个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本文中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
本文中，所述同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述调控所述蛋白质活性或含量的物质可为调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达可为提高或增加所述基因表达。
所述提高或增加所述基因表达的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
其中，B1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
进一步地，B1)所述核酸分子可为如下G1)或G2)所示的基因：
G1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
G2)编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
其中，SEQ ID No.2由1488个核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端起第1位-第1488位，编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白。
上述相关生物材料中，B2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质IbWRKY32的DNA，该DNA不但可包括启动IbWRKY32基因转录的启动子，还可包括终止IbWRKY32基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述相关生物材料中，B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.2所示的用于编码蛋白质IbWRKY32的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有所述IbWRKY32编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1300-35S、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用IbWRKY32构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
上述相关生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，B6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，B7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。
本发明还提供一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括向受体植物中导入上述蛋白质编码基因，得到耐盐性高于所述受体植物的目的植物。
进一步地，上述方法中所述编码基因为下述G1)或G2)：
G1)编码链的编码序列是如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子；
G2)编码链的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的cDNA分子或DNA分子。
上述方法中，所述蛋白质编码基因可通过携带有所述蛋白质编码基因的植物表达载体导入目的植物中。
携带有本发明所述蛋白质编码基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
在本发明具体的实施方式中，所述重组载体为重组质粒pCB-IbWRKY32。所述重组质粒pCB-IbWRKY32是利用限制性内切酶KpnI和XbaI将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入至载体pCAMBIA1300-35S的KpnI和XbaI酶切识别位点之间，且保持载体pCAMBIA1300-35S其它序列不变得到的重组载体。
重组质粒pCB-IbWRKY32中，启动IbWRKY32基因转录的启动子是位于载体pCAMBIA1300-35S的35S启动子。
上述植物可为双子叶植物，所述双子叶植物可为茄目植物。所述茄目植物可茄科植物。所述茄科植物可为烟草属植物。所述烟草属植物可为烟草。
上述蛋白质，和/或与蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明提供了IbWRKY32蛋白及其编码基因，并将IbWRKY32蛋白的编码基因导入烟草W38中，得到IbWRKY32的转基因烟草植株。将转基因植株进行盐胁迫处理，与对照相比，转基因株系耐盐性增强，具体体现在降低了H2O2含量。因此，本发明所提供的IbWRKY32基因及其所编码的蛋白在植物耐盐过程中起着重要的作用，在提高植物耐盐研究中具有重要的应用价值，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为转基因烟草植株的PCR检测检测结果；其中，M为Maker；W为水；P为阳性质粒；WT为野生型烟草W38植株；L1-L6为转基因植株。
图2为IbWRKY32在转基因烟草中的表达分析；其中，WT为野生型烟草W38植株；L1-L6为转基因植株。
图3A为过表达IbWRKY32转基因烟草植株和野生型W38植株耐盐鉴定实验中植株生长情况；其中，WT为野生型W38植株；L1、L2和L3为过表达IbWRKY32转基因烟草植株；对照表示在正常培养基中培养4周的长势和鲜重，盐胁迫表示在胁迫培养基中培养4周。
图3B为过表达IbWRKY32转基因烟草植株和野生型W38植株耐盐鉴定实验中的植株鲜重；其中，WT为野生型W38植株；L1、L2和L3为过表达IbWRKY32转基因烟草植株；对照表示在正常培养基中培养4周的长势和鲜重，盐胁迫表示在胁迫培养基中培养4周。
图4为过表达IbWRKY32转基因烟草植株和野生型对照植株的H2O2含量测定；其中，其中，WT为野生型W38植株；L1、L2和L3为过表达IbWRKY32转基因烟草植株。
具体实施方式
徐薯55-2在文献：“朱虹.甘薯干旱转录组分析及抗旱相关基因IbWRKY2、IbGATA24和IbSDT的克隆与功能鉴定，博士学位论文，中国农业大学，2018.”中公开，公众经作者同意后，可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
烟草品种W38在文献“Jiang T,Zhai H,Wang FB,Zhou HN,Si ZZ,He SZ,LiuQC.Cloning and haracterization of a Salt Tolerance-Associated Gene EncodingTrehalose-6-Phosphate Synthase in Sweetpotato,Journal of IntegrativeAgriculture 2014,13(8):1651-1661”中公开，公众经作者同意后，可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
载体pCAMBIA1300-35S购自武汉转导生物实验室有限公司，产品目录号为VT4004。
根癌农杆菌EHA105购自北京拜尔迪生物技术有限公司。
大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)
下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与提高甘薯耐盐相关蛋白质IbWRKY32及其编码基因的获得
1.1、甘薯(Ipomoea batatas)IbWRKY32基因cDNA的克隆
1.1.1、甘薯总RNA提取
实验材料：甘薯品系‘徐薯55-2’。
取0.1g甘薯幼嫩叶片在液氮中研磨成粉状，加入2mL离心管，用TIANGEN的RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(目录号：DP432)提取甘薯总RNA，试剂盒中包括：裂解液RL，去蛋白液RW1，漂洗液RW，RNase-Free ddH2O，RNase-Free吸附柱CR3，RNase-Free过滤柱CS，DNase I，缓冲液RDD，RNase-Free离心管，RNase-Free收集管。取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260nm)和纯度(OD260nm/OD280nm)，提取的徐薯55-2总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5-2︰1，表明总RNA没有降解，所得mRNA符合实验要求，可用于IbWRKY32蛋白cDNA全长的克隆。
1.1.2、IbWRKY32基因cDNA序列的克隆
设计引物进行IbWRKY32 cDNA序列的克隆。
引物序列如下：
引物1:5′-ATGGATGACACAGGAGAAGCG-3'
引物2：5′-TCAACAAGGCTTGATTTCGAAT-3'
以上述步骤1提取的总RNA经QuantScript RT Kit(TIANGEN，Beijing)反转录为模板，用高保真的LA酶，进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1488bp长度的扩增片段。
经过测序，该PCR产物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，将该序列所示的基因命名为IbWRKY32基因，该基因的编码区为SEQ ID No.2自5′端第1-1488位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为IbWRKY32蛋白或蛋白质IbWRKY32，氨基酸序列为SEQ ID No.1，由495个氨基酸残基组成。
1.2、植物表达载体的构建
根据甘薯IbWRKY32基因cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物(引物3和引物4)分别引入Kpn I和XbaI酶切位点，引物序列如下：
引物3：5'–ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGATGACACAGGAGAAGCG-3'(下划线部分为Kpn I酶切位点序列)，
引物4：5'–GCTCACCATGTCGACTCTAGAACAAGGCTTGATTTCGAATCC-3'(下划线部分为XbaI酶切位点)。
以人工合成的SEQ ID No.2为模板，PCR扩增，收获PCR产物备用。
用Kpn I和XbaI酶切载体pCAMBIA1300-35S(购自武汉转导生物实验室，产品目录号为VT4001)，回收载体大片段，同时，用Kpn I和XbaI酶切上述PCR产物，回收约1.5kb中间片段，将回收的载体大片段与约1.5kb中间片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCAMBIA1300-35S的KpnI和XbaI酶切识别位点间插入了SEQ ID No.2自5′端第1位-第1488位所示的序列，且载体pCAMBIA1300-35S的其他核苷酸序列保持不变，说明重组载体构建正确，将重组载体命名为pCB-IbWRKY32。
1.3、植物表达载体转化农杆菌
(1)从-80℃低温冰箱中取出200μL EHA105感受态细胞(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pCAMBIA1300-IbWRKY32，混匀。
(2)液氮冷冻1min，37℃温育5min。
(3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h。
(4)取100μL菌液至LB固体培养基上(含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d。
(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落，接种到含有100μg/mL Rif、25μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到导入pCAMBIA1300-IbWRKY32的农杆菌菌液(含目的基因的农杆菌菌液)。
实施例2、烟草的遗传转化及再生
用农杆菌介导的方法将IbWRKY32 cDNA的编码序列导入到烟草品种Wisconsin38(W38)中。具体方法如下：
选取培养基中生长4周左右的W38烟草叶片于灭过菌的玻璃培养皿中。切去主脉和叶边缘，切取1×1cm的烟草叶盘。将烟草叶盘正面朝上放置于预培养培养基(1.0mg/L6-BA、0.1mg/L NAA的MS)上，28℃，在黑暗条件下生长2-3d。将预培养后的烟草叶盘浸泡在上述步骤2制备好的、OD600nm为0.4-0.6的农杆菌中侵染浸泡5-10min。吸干烟草叶盘上多余的菌液，正面放置在共培养培养基上，28℃，在黑暗条件下共培养2-3d。在液体MS培养基中分别加入150、300、600mg/L CS(给出全称或者中文名称)，按浓度从高到低清洗3次共培养后的烟草叶盘。用高温高压灭菌处理过的干净滤纸吸干叶盘上多余的液体，将其放置在再生培养基(15mg/L潮霉素、400mg/L CS、1.0mg/L6-BA和0.1mg/L NAA的MS)上，3000lux光照，28℃培养30d，至分化出芽。切下1cm的再生芽，继代于生根培养基上(1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、400mg/L头孢氨苄、15mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基)上，至长成完整植株，获得拟转基因植株。
转基因植株的鉴定使用PCR检测和qRT-PCR检测相结合的方法。
A、PCR检测
用CTAB法提取拟转基因植株和野生型烟草植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的IbWRKY32基因引物为：
引物5：5'-TCCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3'
引物6：5'-TCAACAAGGCTTGATTTCGAAT-3'。
在0.2ml Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μl、4dNTP(10mol/L)1μl、引物(10μmol/l)均为1μl、模板DNA(50ng/ul)2μl、Taq DNA聚合酶1ul，加H2O至总体积20μl。反应程序为94℃变性4min，57℃复性1.5min，72℃延伸1min30s，共35个循环。使用pCAMBIA1300-IbWRKY32载体质粒为阳性对照，水和野生型烟草植株为阴性对照，然后进行电泳检测。
结果见图1，从图中可见，拟转基因植株L1-L6和阳性对照扩增出1500bp的目标条带，表明IbWRKY32基因已经整合到烟草的基因组中，并证明这些植株为转基因植株；水和野生型烟草植株没有扩增出目标条带。
B、qRT-PCR
提取转基因烟草阳性植株的RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以野生型W38植株为对照。
以烟草肌动蛋白(Actin)基因为内参，引物序列为：
NtActin-F：5'-GAGGAATGCAGATCTTCGTG-3'
NtActin-R：5'-TCCTTGTCCTGGATCTTAGC-3'
IbWRKY32引物序列为：
引物7：5'-GATGAGCCTAGTGGAGCGAC-3'
引物8：5'-GTATGGAAGGCGAGTCCACC-3'
qRT-PCR结果如图2所示，结果表明IbWRKY32基因在转基因植株中得到不同程度的表达。选取转基因烟草植株L1、L2、L3扩繁进行后续试验。
实施例3、转基因植株的耐盐性鉴定
3.1、表型鉴定
过表达IbWRKY32转基因烟草株系L1、L2、L3和野生型W38植株分别培养于MS培养基(对照培养基)、含有NaCl(浓度为200mM)的MS培养基(盐胁迫培养基)，每个株系每种培养基各3株植株。培养条件均为27±1℃，每天13h、3000lux光照，胁迫培养4周后，对其生长情况进行观察。
结果如图3A和图3B所示，野生型W38烟草植株(图中以“WT”表示)在NaCl(浓度为200mM)的MS培养基上长势较弱，生根困难；3个过表达IbWRKY32转基因烟草株系L1、L2、L3的生长状态不同程度优于野生型W38烟草。MS培养基培养条件下(对照)，转基因烟草植株和野生型烟草植株的鲜重无显著差异，盐胁迫条件下3个过表达IbWRKY32转基因烟草株系L1、L2、L3的鲜重显著高于野生型W38烟草。
以上结果说明过表达IbWRKY32提高了转基因烟草植株的耐盐性。
3.2、H2O2含量测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
过氧化氢(H2O2)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：H2O2-2-Y)来检测烟草植株的H2O2积累量。烟草植株为采用上述步骤3中对照组处理4周的烟草植株和上述步骤3中盐胁迫处理4周的烟草植株。烟草植株包括为过表达IbWRKY32转基因烟草植株L1、L2、L3与野生型烟草植株(WT)的株系。实验需重复三次，结果取平均值。
过表达IbWRKY32转基因烟草株系L1、L2、L3的植株和野生型对照植株的H2O2含量测定结果见图4，结果显示，在含有氯化钠(浓度为200mM)的MS培养基上3个转基因株系的H2O2含量均显著低于野生型甘薯植株。
上述转基因烟草植株H2O2含量的测定结果表明，同野生型烟草植株相比，过表达IbWRKY32的转基因植株的耐盐性显著提高，说明蛋白质IbWRKY32及其编码基因可用来调控植物抗逆性，尤其是提高植物耐盐性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 耐盐相关蛋白IbWRKY32及其编码基因与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 495
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 1
Met Asp Asp Thr Gly Glu Ala Ser Lys Pro Ser Leu Gln Leu Gln Asn
1 5 10 15
Thr Cys Ala Asp Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Glu Pro Ser
20 25 30
Gly Ala Thr Thr Gly Thr Glu Thr Ser Glu Glu Ala Gln Val Gly Gly
35 40 45
Ser Asp Ser Glu Glu Thr Leu Asp Thr Val Asp Ser Pro Ser Ile Gln
50 55 60
Leu Asp Lys Ser Ala Ser Arg Pro Asp Ser Leu Ala Thr Ser Ser Ser
65 70 75 80
His Val Leu Ser Glu Val Pro Ile Glu Tyr Ser Leu His Pro Ser Glu
85 90 95
Phe Leu Lys Glu Ile Lys Asp Glu Val Gly Ile Ser Asn Gln Lys Ala
100 105 110
Ser Thr Val Gln Ala Gln Arg Arg Asn Gln Leu Gln Ser Ala Asp Asp
115 120 125
Pro Ser Val Leu Glu Leu Ser Pro Thr Ser Val Thr Gln Ser Ile Ser
130 135 140
Ser Ile Pro Ser Pro Thr Pro Gly Glu Arg Arg Leu Ser Pro Leu Glu
145 150 155 160
Asn Arg Asn Gly Ala Cys Ile Gln Glu Val Asp Asn Gln Asn Ser Ser
165 170 175
Asn Ser Lys Ala Leu Ser Leu Val Pro Val Leu Lys Ile Gln Ala Pro
180 185 190
Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Ser Pro
195 200 205
Gln Gly Ser Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr Tyr Ser Asp Cys Cys Ala
210 215 220
Lys Lys Ile Glu Cys Ser Asp His Thr Asn Arg Val Thr Glu Ile Val
225 230 235 240
Tyr Arg Ser Pro His Asn His Glu Pro Pro Arg Lys Val Asn Thr Pro
245 250 255
Lys Val Asn Lys Leu Ala Ile Ser Ser Met Pro Arg Ser Gln Asp Ser
260 265 270
Lys Val Ala Arg Leu Asn Ser Asn Ala Asp Glu Thr Val Pro Ser Thr
275 280 285
Ser Lys Lys His Val Lys Glu Thr Ile Pro Ile Ser Glu Thr Lys Gln
290 295 300
Gln Asp Phe Phe Gly Leu Asp Asp Asn Ala Glu Thr Asn Val Lys Arg
305 310 315 320
Glu Asp Cys Asp Glu Pro Thr Gln Lys Lys Arg Leu Lys Lys Cys Ser
325 330 335
Ser Ser Pro Glu Ser Leu Pro Lys Pro Gly Lys Lys Ala Lys Leu Val
340 345 350
Val His Ala Gly Gly Asp Val Gly Ile Ser Ser Asp Gly Tyr Arg Trp
355 360 365
Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Met Val Lys Gly Asn Pro His Pro Arg Asn
370 375 380
Tyr Tyr Arg Cys Thr Ser Ala Gly Cys Pro Val Arg Lys His Ile Glu
385 390 395 400
Arg Ala Val Asp Asn Thr Thr Ala Val Ile Ile Thr Tyr Lys Gly Val
405 410 415
His Asp His Gly Met Pro Val Pro Lys Lys Arg Tyr Gly Gln Pro Ser
420 425 430
Ala Pro Leu Val Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ser Met Thr Asp Ser Gln
435 440 445
Thr Lys Lys Ser Glu Pro Thr Thr Gln Trp Ser Val Asp Lys Glu Gly
450 455 460
Ala Leu Thr Gly Glu Thr Leu Glu His Glu Gly Glu Lys Thr Val Glu
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Ser Ala Lys Thr Leu Leu Ser Ile Gly Phe Glu Ile Lys Pro Cys
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<211> 1488
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 2
atggatgaca caggagaagc gtctaagcca tctctgcagc tccaaaatac atgcgccgac 60
atcggcggcg gaggtggcgg tggtgatgag cctagtggag cgacgactgg aactgagact 120
tcagaagaag ctcaagtggg aggttctgac tccgaagaaa ccctagatac ggtggactcg 180
ccttccatac agttggataa gagtgctagc cgaccggatt cccttgctac ctcctcctcg 240
cacgtgctct ctgaagttcc aatcgagtat agcttgcacc cgtccgaatt cctgaaggaa 300
atcaaggatg aggttggcat ttctaaccag aaagcctcaa ctgttcaagc tcaaaggcgg 360
aaccaactgc agtctgctga tgatccatct gtgttggaat tatctccaac ttctgttaca 420
cagtccatat catccattcc cagcccaact ccaggagagc gaagattgtc tccattagag 480
aacagaaatg gcgcatgcat ccaagaagta gataaccaga attcttccaa ctccaaagct 540
ttatctcttg ttcctgtctt aaagatacaa gcacctgatg ggtacaattg gcggaaatat 600
ggtcaaaagc aagtgaagag tcctcaaggt tctcggagct attacagatg cacatattct 660
gactgctgtg caaaaaagat tgagtgttct gaccacacta accgtgttac agagattgtt 720
tatagaagtc ctcacaatca cgagccaccc cgaaaagtaa atacccctaa agtaaacaag 780
cttgcaatct catctatgcc tcgtagtcag gatagcaaag tagctcgcct aaatagtaat 840
gctgatgaga cagtgccatc cacttcaaag aaacatgtta aagaaacaat accaatatca 900
gagacaaagc agcaggattt ctttggattg gatgacaatg ctgaaactaa tgttaaacgg 960
gaggattgtg atgaacctac acagaagaaa agattgaaga aatgttcctc aagtcctgag 1020
tctcttccta aacctggcaa gaaagcaaaa ttggttgttc acgctggtgg tgatgtggga 1080
atctccagtg atggctatag gtggcgcaag tatggacaaa aaatggtgaa gggtaacccc 1140
catcccagga actattatcg gtgcacttcg gctggatgtc ctgttcggaa acacattgag 1200
agggctgtag acaacacgac tgctgtcatt ataacctata agggggttca tgatcatggc 1260
atgccagtac ctaagaaacg ttatggccaa cctagtgctc ccctagttgc cgcgactgcc 1320
tccgcttcca tgactgattc gcagactaag aaatctgaac caaccaccca gtggtcagta 1380
gacaaagaag gtgcattaac aggcgagaca ttggagcatg aaggagagaa aactgtggaa 1440
tcagctaaaa ctctattgag tattggattc gaaatcaagc cttgttga 1488
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