一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7及其编码基因与应用
阅读说明：本技术 一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7及其编码基因与应用 (Cinnamomum camphora tooth proboscis adult odor binding protein PtsuOBP7 and coding gene and application thereof ) 是由 陈宏健 陈聪 耿薏舒 李寿银 樊斌琦 张岳峰 王焱 韩阳阳 于 2021-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7及其编码基因与应用,属于分子生化技术领域。本发明提供的香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的蛋白和基因可用于反向验证寄主植物香樟挥发性信息化合物的活性组分鉴定；也为解析香樟齿喙象为害香樟的嗅觉分子机制奠定分子基础；同时也为开发以害虫嗅觉关键基因为靶点的害虫防控技术提供参考依据；本发明还通过荧光竞争性结合实验筛选获得与香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7结合力强的几种挥发性物质,可用于制备引诱剂以监测防治香樟齿喙象。(The invention discloses a cinnamomum camphora tooth proboscis imago odor binding protein PtsuOBP7 and a coding gene and application thereof, and belongs to the technical field of molecular biochemistry. The cinnamomum camphora tooth beak weevil adult odor binding protein PtsuOBP7 provided by the invention has an amino acid sequence shown as SEQ ID No.1, and a nucleotide sequence of a coding gene thereof is shown as SEQ ID No. 2. The protein and the gene provided by the invention can be used for reversely verifying the active component identification of the host plant cinnamomum camphora volatile information compound; also lays a molecular foundation for analyzing olfactory molecular mechanism of the cinnamomum camphora which is harmed by the ceratophylla tooth proboscis; meanwhile, a reference basis is provided for developing a pest prevention and control technology taking pest olfactory key genes as targets; the invention also screens and obtains a plurality of volatile substances with strong binding force with the adult odorant binding protein PtsuOBP7 of the cinnamomum camphora teeth through a fluorescence competitive binding experiment, and the volatile substances can be used for preparing an attractant to monitor and control the cinnamomum camphora teeth beak.)
技术领域
本发明属于分子生化技术领域，更具体地说，涉及一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7及其编码基因与应用。
背景技术
香樟齿喙象Pagiophloeus tsushimanus为鞘翅目Coleptera，象甲科Curculionidae，齿喙象属Pagiophloeus，是一种钻蛀为害香樟的中国新纪录种害虫。成虫主要取食1-2年生的嫩枝表皮，幼虫取食形成层，虫口密度较大时，导致香樟长势衰弱或整株枯死。目前，香樟齿喙象仅分布于中国上海市，1年发生1代，以幼虫和成虫越冬。目前，上海市各行政区的香樟林均有大面积受该虫危害，且存在向外蔓延的趋势。
昆虫通过嗅觉系统感知外界环境中的气味物质调节其行为，基于昆虫嗅觉感受机制研发的调控昆虫行为的方法已经应用于农林害虫的防治。目前，许多昆虫的信息素都被用于了害虫的监测和防治，然而对害虫具有生理活性的气味分子的筛选过程需要花费大量的人力、物力和财力，这就严重制约了有生理活性的气味分子的筛选和推广应用。有鉴于此，一些研究者提出了“反向化学生态学(Reverse Chemical Ecology)”的概念，即以气味分子与嗅觉相关蛋白的结合力来筛选具有生物活性的挥发性化学物质，而不是用大量的气味分子逐一观察其引起的昆虫行为反应的传统方法，可以有效减少有生理活性气味分子筛选的工作量，显著提高工作效率。
气味结合蛋白(Odorant-Binding Proteins，OBPs)是昆虫嗅觉相关蛋白的主要种类之一，是由昆虫嗅觉感器内部的支持细胞分泌的，浸润于感器淋巴液中并分布在感觉神经元轴突周围的水溶性酸性蛋白。气味分子进入触角感器后最先接触的第一类嗅觉蛋白。OBPs是昆虫识别外界气味物质的必要载体蛋白，其主要功能是结合并转运外界的气味分子穿过触角感器的疏水性淋巴液至嗅觉受体处释放，从而完成将化学信号转变为电信号，因此，OBPs在昆虫的气味嗅觉识别过程中起决定性的作用，明确昆虫OBPs的功能对理解昆虫嗅觉感受系统至关重要。
荧光竞争性结合实验(Fluoresecence competitive binding assays)是研究昆虫OBPs与气味分子结合能力的主要方法之一，该方法已广泛应用于昆虫OBPs的功能研究中，如蟑螂Leucophaea maderae、华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita、樟巢螟Orthagaachatina、松墨天牛Monochamus alternatus、美国白蛾Hyphantria cunea与暗黑鳃金龟Holotrichia parallela等。
目前已有多种昆虫OBPs已被克隆和研究，但香樟齿喙象成虫气味结合蛋白OBPs尚未见于报道。研究香樟齿喙象成虫气味结合蛋白OBPs不但可以解析香樟齿喙象为害香樟的嗅觉分子机制奠定基础，而且可以为寄主植物香樟挥发性信息化合物的活性组分鉴定提供反向验证的方法，为进一步开发以昆虫嗅觉关键基因为靶点的害虫监测防控技术提供参考依据。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7。本发明所要解决的另一技术问题在于提供编码所述香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7基因。本发明还要解决的最后一个技术问题在于提供所述香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7及其编码基因的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述的香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
含有所述编码香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7基因的载体或重组质粒。
所述的含有编码香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7基因的载体或重组质粒在制备香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7中的应用。
所述的香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7在制备用于筛选香樟齿喙象气味引诱剂的试剂中的应用。
用于筛选香樟齿喙象气味引诱剂的试剂，是含有权利要求1所述的香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7。
所述的试剂在筛选香樟齿喙象气味引诱剂中的应用。
进一步地，所述的应用包括：向含有香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7的体系中加入1-NPN；分别使各种配体气味分子和1-NPN进行竞争结合香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7，计算获得各种配体气味分子的解离常数，将解离常数Ki＜20μM的配体气味分子作为香樟齿喙象气味引诱剂。
一种防治香樟齿喙象的引诱剂，是含有与所述的香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7结合力强的配体气味分子，其中，所述配体气味分子包括樟脑、β石竹烯、芳樟醇、α水芹烯或右旋龙脑中的一种或多种。
所述的引诱剂在监测和防治香樟齿喙象中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过克隆和原核表达的方法获得一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的蛋白和基因可用于反向验证寄主植物香樟挥发性信息化合物的活性组分鉴定，也为解析香樟齿喙象为害香樟的嗅觉分子机制奠定分子基础，同时为开发以昆虫嗅觉关键基因为靶点的害虫监测防控技术提供参考依据；
(2)本发明还通过荧光竞争性结合实验筛选获得与香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7结合力强的几种挥发性物质，包括：樟脑、β石竹烯、芳樟醇、α水芹烯和右旋龙脑等，可作为候选组分用于制备引诱剂以监测防治香樟齿喙象。
附图说明
图1为PtsuOBP7基因在香樟齿喙象雌雄成虫组织的相对表达量图；
图2为PtsuOBP7原核表达条件的SDS-PAGE分析图，注：图中泳道M为Marker；1为15℃，IPTG 0.6mM诱导的上清液；2为20℃，IPTG 0.6mM诱导的上清液；3为25℃，IPTG 0.6mM诱导的上清液；4为20℃，IPTG 0mM诱导的上清液；5为20℃，IPTG 0.2mM诱导的上清液；6为20℃，IPTG 0.4mM诱导的上清液；7为20℃，IPTG 0.6mM诱导的上清液；8为20℃，IPTG0.8mM诱导的上清液；9为20℃，IPTG 1mM诱导的上清液；
图3为PtsuOBP7纯化的SDS-PAGE分析结果图，注：图中泳道M为Marker；1为纯化收集的目的蛋白PtsuOBP7；
图4为PtsuOBP7与1-NPN的结合曲线图(a)及Scatchard图(b)；
图5为PtsuOBP7与香樟挥发物的荧光竞争结合曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。
实施例1：PtsuOBP7基因的克隆
(一)香樟齿喙象的饲养
饲养时在饲养盒中间用纱网将香樟齿喙象雌雄成虫隔开，收集同批羽化的雌雄成虫(35日龄，正常取食但均未交配)用于转录组测序。雌雄成虫均分别设置3个独立的生物学重复，每个重复包含6头相同性别的成虫。所有样品同时采集并均用75％酒精清洗干净后，立即在液氮中迅速冷冻，冷冻后立即在-80℃下储存或直接进行总RNA提取。
(二)香樟齿喙象雌雄成虫RNA提取
选用TRIzol(宝生物工程(大连)有限公司TaKaRa，Japan)法提取香樟齿喙象雌雄成虫的总RNA，提取步骤如下：
(1)将收集的各样品置于无RNA酶的1.5mL EP管中，加入500μL TRIzol，用研磨棒充分研磨样品；
(2)充分研磨后向EP管中再次加入500μL TRIzol，室温下静置5min；
(3)4℃，12 000rmp离心10min后，将上清液转入新的无RNA酶的1.5mL EP管中；
(4)往新的EP管中加入200μL氯仿，盖紧离心管后剧烈震荡15sec，室温下静置3min；
(5)4℃，12 000rmp离心15min，此时混合物分为三层，用移液器少量多次取上层的无色水相(RNA溶在水相里)，转至新的无RNA酶的EP管中；
(6)加入与步骤(5)所得无色水相等体积的异丙醇，混匀，室温下放置30min，以充分沉淀RNA；
(7)4℃，12 000rmp离心10min后，去除上清液；
(8)往获得的RNA沉淀物种加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃，5 000rmp离心5min，小心去除上清液；
(9)然后重复步骤(8)三次；
(10)室温放置晾干5-10min后，加入20μL RNase Free ddH2O以充分溶解沉淀，即获得RNA溶液，置于-80℃贮存备用；
(11)选用Nanodrop 2 000检测RNA样品的浓度与纯度，OD260/280的值在1.8-2.1之间；1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测是否存在基因组残留或蛋白质污染，以及RNA条带的完整性。
(三)PtsuOBP7基因克隆
根据开放阅读框(Open Reading Frames，ORFs)预测网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/goff/gorf.html)分析PtsuOBP7基因的ORFs，利用PrimerPremier5.0软件设计PtsuOBP7基因的特异性引物扩增其ORF；
克隆引物如下：
F：5′-ATGTATCAAGTGTATAAGTTTACTG-3′，
R：5′-TTAAACAAAGAAATAATTCTCTGGA-3′。
反应体系为：
cDNA模板
1μL(750ng/μL)
PrimerSTAR Max Premix(2×)
25μL
Primer1(10μM)
1μL
Primer2(10μM)
1μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O
up to 50μL
轻弹混匀后低速短暂离心将反应液收集至管底，反应程序为：
(4)反应结束后，琼脂糖凝胶(2％)电泳检测PCR产物的条带与目的基因大小是否相同。
(5)用胶回收试剂盒对目的条带进行切胶回收。步骤如下：
①将琼脂糖凝胶置于紫外光环境下，切取含有目的片段的部分，尽量少，
②胶块转入2mL的EP管中，加入400μL Binding Solution，金属浴设置60℃对EP管中的胶块加热至胶块完全溶解，
③将混合液移入带有滤膜的吸附管中，室温条件下静置2min，6000rmp离心1min，
④重复步骤3)，去除收集管中残留液，
⑤向吸附管加入500μL WA，12000rmp离心1min，去除收集管中残留液，
⑥向吸附管加入500μL Wash Solution，12000rmp离心1min，去除收集管中残留液，
⑦重复步骤6)，去除收集管中残留液，
⑧随后12000rmp离心2min，将吸附管转移至新的1.5mL EP管中，室温条件下放置10min，
⑨向吸附管中间的滤膜上滴加20μL RNase Free ddH2O，室温条件下放置3min，12000rmp离心2min，即获得胶回收的产物，
⑩琼脂糖凝胶(2％)电泳及Nano Drop 2000检测回收产物的纯度与浓度。
(6)将切胶回收并纯化后的产物与载体TA/Blunt-Zero连接，连接反应体系为：
胶回收产物
1-4μL
5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix
1μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O
up to 5μL
(7)将(6)得到的重组质粒导入感受态细胞DH5α中，克隆筛选与纯化，具体步骤如下：
①将感受态细胞DH5α放置于冰水混合物中解冻，
②待完全解冻时，分装成每管50μL的感受态细胞，分别加入5μL的(6)得到的重组质粒，轻弹管底使之混匀，静置于冰水混合物中30min，
③静置结束后取出离心管在42℃条件下热激45sec，迅速取出转置于冰水混合物中静置2min，
④在③反应后的混合液中加入900μL液体LB培养基，放置于摇床37℃，200rpm中摇培1h，以复苏感受态细胞。
⑤摇培1h后2500rmp离心3min，用移液器取出900μL上清液并去除，重悬菌体后，均匀涂布在含有氨苄抗性的LB平板上，
⑥平板转入37℃培养箱中数分钟至菌液吹干后，将平板倒置并过夜培养，
⑦分别挑选3个单克隆，转入1mL LB液体培养基中，摇床上摇培4h，将菌液划线于LB平板上培养，再分别挑选6个单克隆，同样的方法摇培4h，
⑧用M13引物对纯化后的单克隆菌液进行PCR验证，最终选择6个阳性克隆，测序以获得序列并验证序列的准确性。
测序获得PtsuOBP7的准确ORF序列如SEQ ID NO.2所示，其表达蛋白如SEQ IDNO.1所示。
(四)PtsuOBP7蛋白的生物信息学分析
ExPasy软件表明，PtsuOBP7蛋白由142个氨基酸编码，其氨基酸序列如所示；含有信号肽19aa；蛋白质分子质量为13.74kDa；等电点为4.73。
实施例2：PtsuOBP7基因在香樟齿喙象雌雄成虫组织的相对表达量
(一)香樟齿喙象饲养与样品收集
香樟齿喙象的野外采集与饲养同实施例1。饲养时在饲养盒中间用纱网将雌雄成虫隔开，收集同批羽化的雌雄成虫(35日龄，正常取食但均未交配)用于解剖。雌雄成虫均分别设置3个独立的生物学重复，每个重复包含30头相同性别的成虫。所有样品同时采集并均用75％酒精清洗干净后，立即在冰上解剖分别获取触角、头(不含触角)、胸、腹部末端、翅与足等组织，并迅速置于液氮中冷冻，冷冻后立即在-80℃下储存或直接进行总RNA提取.
(二)各样品的总RNA提取
方法及步骤同实施例1。
(三)qRT-PCR引物设计及其扩增效率计算
根据测序验证的PtsuOBP7基因的ORF，利用在线程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计PtsuOBP7基因的qRT-PCR引物。克隆引物如下：
F：5′-TCTCCAGTAGTGAAGGGTGA-3′，
R：5′-CCTTCCAAAGCAATCCAATACCA-3′。
将样品的cDNA模板浓度稀释成500ng/μL，再逐次稀释10倍，共稀释4次，最终共得到5个浓度的cDNA模板，分别为500ng/μL、10-1(50ng/μL)、10-2(5ng/μL)、10-3(0.5ng/μL)与10-4(0.05ng/μL)。qRT-PCR的反应体系为：
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix
10μL
Template cDNA
2μL
引物(F/R)
1+1μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O
6μL
低速短暂离心将反应液收集至管底，qRT-PCR的反应程序为：
每个处理包含3个生物学重复并分别进行3次技术重复，扩增标准曲线，得到标准曲线方程的相关系数R2及斜率slope，根据公式：扩增效率E＝(10^[-1/slope]-1)×100分别计算各引物的扩增效率。
反应后显示PtsuOBP7基因qRT-PCR引物的溶解曲线为单峰，表明该引物具有特异性，不存在引物二聚体。此外，PtsuOBP7基因qRT-PCR引物的扩增特征如下表：
引物扩增效率为93.949％，在80％-120％之间，表示引物特异性扩增良好。基因PtsuOBP7在雌雄成虫的触角组织中相对表达量最高且显著高于其它组织；在雌雄成虫的翅中的相对表达量次之；在雌成虫触角组织中的相对表达量显著高于雄成虫，而在雄成虫的翅中的相对表达量显著高于雌成虫(图1)。
实施例3：PtsuOBP7的原核表达与纯化
(一)基于同源重组原理的原核表达载体构建
(1)将PtsuOBP7的信号肽序列去除，根据不含信号肽的序列及原核表达载体pET28a(+)的序列利用引物设计软件CE Design(http://www.vazyme.com，诺唯赞官网)设计含有线性化载体两端的同源序列目的片段引物；PtsuOBP7原核表达载体构建引物如下：
F：5′-cgcggatccgaattcgagctcAAATTGGACGAATCACTTTTAACAGA-3′，
R：5′-tggtggtgctcgagtgcggccgcTTAAACAAAGAAATAATTCTCTGGATTTG-3′。
(2)用两个限制性内切酶对表达载体pET28a(+)进行双酶切，使pET28a(+)线性化，PCR的反应体系为：
10×QuickCut Buffer
5μL
限制性内切酶I
1μL
Vector pET28a(+)
＜1μg
RNase Free ddH<sub>2</sub>O
Up to 50μL
(3)轻弹混匀后低速短暂离心将反应液收集至管底，PCR中37℃孵育15min；
(4)结束后加入1μL限制性内切酶II，PCR中37℃再孵育15min；
(5)选用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测产物，将目的条带切胶回收纯化；
(6)以克隆质粒为模板，选用高保真酶与含同源序列目的片段引物进行PCR扩增、产物切胶回收纯化、载体连接与测序；
(7)重组反应：在冰上配置重组反应体系：
5×CE II Buffer
2μL
线性化片段
80ng
线性化载体
100ng
Exnase II
1μL
RNase Free ddH<sub>2</sub>O
Up to10μL
轻弹混匀后低速短暂离心将反应液收集至管底，PCR中37℃孵育30min；
(8)重组产物转化：选用DH5α克隆重组质粒PtsuOBP7/pET28a(+)，并选用M13F/R验证阳性克隆，最后测序验证；
(9)阳性克隆质粒提取及转化：
①分别取过夜摇培的菌液10mL，12 000rmp离心1min，去除培养基，
②分别加入SolutionI 500μL充分重悬菌体，再加入Solution II 500μL，迅速颠倒充分混匀至透明蛋清状，最后加入Solution III 700μL，充分混匀，室温静置5min，12000rmp离心10min，
③分别将上清液分数次加入质粒提取专用吸附管(吸附柱已作平衡处理)中，12000rmp离心1min，去除收集管中的废液，重复此步骤至废液去除彻底，
④向管中加入Solution W1 500μL，12000rmp离心1min，去除收集管中的废液，
⑤向管中加入Wash Solution 600μL，12000rmp离心1min，去除收集管中的废液，重复此步骤至废液去除彻底，
⑥12000rmp离心2min，将吸附管转至新的1.5mLEP管中，室温下晾置10min，
⑦向吸附管中的膜中间滴加RNase Free ddH2O100μL，室温下放置2min，12000rmp离心2min，获得纯化的质粒，
⑧琼脂糖凝胶(1.5％)电泳与Nano Drop2000检测质粒的纯度及浓度，
⑨将阳性克隆质粒转入表达载体BL21(DE3)，热激时间延长为90sec，固体培养基为Kana抗性，挑取阳性菌斑摇培，划线纯化后取单克隆再次摇培5h，菌液PCR检测后，送测序验证并保留菌种备用。
(二)重组质粒诱导表达与纯化
(1)诱导表达条件筛选
将保留的PtsuOBP7甘油菌活化后，按1∶100的比例将甘油菌接入1L液体LB培养基中(含Kana)，
①不同终浓度(0、0.2、0.4、0.6、08与1mM)的异丙基-β-D-硫代半乳糖昔(Isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)的筛选实验，温度条件为20℃；
②不同温度(15、20与25℃)的筛选实验，IPTG的终浓度为0.6mM；
③其他相同条件与步骤为：150rmp培养至OD值为0.6-0.8之间，分别加入IPTG，继续诱导培养12h。12 000rmp，4℃条件下离心15min，收集菌体，分别加入100mL缓冲液(50mMPB，300mM NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)重悬菌体，同时加入加入PMSF至终浓度1mM，冰浴条件下对重悬液进行超声破碎(破碎循环条件为：超声破碎3sec，停5sec)，12 000rmp离心30min，分别收集上清备用。分别取上清各20μL，分别加入5μL的Loading buffer混匀后于100℃条件下水浴10min，短暂离心收集至管底，用12.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，100V，120min)结合考马斯亮蓝法染色脱色法检测蛋白表达情况。
(2)重组质粒诱导表达
筛选获得合适的IPTG终浓度及温度条件，对PtsuOBP7的重组蛋白进行大量诱导表达，获取足够量的上清液用于蛋白纯化。
(三)关键PtsuOBP7重组蛋白的纯化
①超声破碎后的上清液均过0.2μm孔径的滤膜，
②重悬液平衡镍离子树脂重力柱(1mL Ni+/柱)备用，
③经滤膜过滤后的上清液逐次过重力柱(2遍)，
④先用少量的PtsuOBP7上清液，分别选用6mL×4Wash buffer(50mM PB，300mMNaCl，咪唑，pH＝7.4)，咪唑终浓度分别为80、100、120、140与160mM洗脱杂蛋白，再用筛选确定的Wash buffer适宜终浓度进行杂蛋白洗脱，
⑤分别用300μL×5Elution buffer(300mM NaCl，300mM咪唑，50mM PB，10％甘油，1mM PMSF，pH＝7.4)洗脱收集目的蛋白，
⑥将收集的目的蛋白分别装入透析袋中，分别用透析液I(200mM NaCl，200mM咪唑，40mM PB，pH＝7.4)于4℃条件下对各目的蛋白透析16h；再用透析液II(100mM NaCl，100mM咪唑，20mM PB，pH＝7.4)对各目的蛋白于相同条件下再透析16h；最后转入纯水中再透析16h，
⑦于-80℃中冷冻透析后的目的蛋白4h，再转至冷冻干燥仪中冷冻干燥目的蛋白至蛋白完全干燥成粉末状，
⑧用RNase Free ddH2O溶解干燥后的目的蛋白，
⑨用(SDS-PAGE，100V，120min)检测纯化后的目的蛋白溶液，并保存于-80℃条件下备用。
PtsuOBP7的原核表达结果由图2可知，15、20与25℃三个温度条件下，PtsuOBP7的表达量差异不显著，此外，PtsuOBP7在终浓度为0.2、0.4、0.6、08与1mM的IPTG诱导条件下，表达量差异也不显著，但均显著高于终浓度为0mM的IPTG诱导。最终确定适用于PtsuOBP7表达的适宜条件：即在20℃，150rmp，IPTG诱导的终浓度0.6mM条件下摇培12h。
PtsuOBP7的纯化结果如图3所示，纯化收集获得的PtsuOBP7，用于开展气味结合蛋白的功能验证。
实施例4：PtsuOBP7的功能验证
目的蛋白的荧光竞争性结合实验，步骤如下：
(一)蛋白溶液与配体气味分子溶液的配制：选用50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)将PtsuOBP7的蛋白冻干粉溶解，NanoDrop 1 000核酸蛋白定量仪测定蛋白的浓度。选用色谱级甲醇溶解荧光探针N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-l-naphthylamine，1-NPN)与寄主植物香樟挥发物(樟脑、罗勒烯、右旋龙脑、芳樟醇、桉叶油素、3-蒈烯、反式-橙花叔醇、α水芹烯与β石竹烯)等配体气味分子，配成10mM的母液存于-20℃备用，实验时再用甲醇将母液稀释成1mM的工作液。
(二)荧光探针1-NPN的适合性测定：荧光探针1-NPN的激发波长为337nm，向96黑色微孔板的微孔中分别加入适量20mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液(反应体系总体积250μL)，再分别加入荧光探针1-NPN，使其终浓度也为2μM，选用扫描法(Spectrum)在Em＝400-500nm波长范围条件下进行扫描测定，发现460nm波长处存在荧光发射峰，依据目的蛋白PtsuOBP7的浓度计算加入量，使目的蛋白PtsuOBP7的终浓度为2μM，室温下反应2min使目的蛋白与1-NPN充分结合，在相同实验条件下检测反应体系的荧光发射峰是否发生明显的蓝移且荧光强度是否显著上升。否则，需选用其他种类探针再测试。随后向2μM的目的蛋白溶液中逐次加入1-NPN至终浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18和20μM，室温下分别反应2min，分别记录荧光值，目的蛋白PtsuOBP7分别设置3个技术重复。实验参数条件为：激发光(Ex)为337nm，吸收光(Em)为1-NPN与PtsuOBP7结合光谱蓝移后的最大荧光发射峰所对应的取值。根据PtsuOBP7的荧光值与荧光探针1-NPN的浓度拟合作图并计算结合常数。同时选用Scatchard法线性化曲线，横坐标为结合配体1-NPN的浓度，纵坐标为结合配体1-NPN的浓度和自由配体1-NPN浓度的比值。以此检测荧光探针1-NPN是否适用于PtsuOBP7的荧光竞争性结合实验。若PtsuOBP7与荧光探针1-NPN的结合存在饱和效应且存在显著的Scatchard线性化关系，表明目的蛋白PtsuOBP7与荧光探针1-NPN之间存在单一的结合位点且不存在别构效应的影响，荧光探针1-NPN适用于后续的荧光竞争性结合实验。
(三)配体气味分子的竞争结合实验：在96黑色微孔板的微孔中分别加入适量20mMTris-HCl(pH＝7.4)缓冲液(反应体系总体积250μL)，依据目的蛋白PtsuOBP7的浓度计算加入量，使PtsuOBP7的终浓度为2μM，再分别加入1-NPN，使其终浓度也为2μM，室温下分别反应2min，在337nm激发光与最大发射峰波长条件下，利用终点法(Endpoint)测定并分别记录荧光值(初始荧光值)。随后分别向反应体系中逐次加入终浓度为2、4、6、8、12、16与20μM的寄主香樟挥发物，室温下分别反应2min，在337nm激发光与最大发射峰波长条件下，利用终点法(Endpoint)测定并分别记录荧光值。
(四)数据分析：选用GraphPad Prism 7.0对PtsuOBP7结合荧光探针1-NPN的最大发射峰处的荧光值与荧光探针1-NPN的浓度拟合作图，并选用Scatchard法线性化该曲线(Y＝bound/free，X＝bound)并获得曲线的回归方程，再利用Scatchard方程计算结合常数(Bingding constant，K1-NPN)。计算各种配体气味分子的IC50值，即荧光值降至PtsuOBP7结合荧光探针1-NPN的初始荧光值的一半时配体气味分子的浓度。最后利用公式Ki＝[ICs0]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)计算获得各种配体气味分子的解离常数(Dissociation constant，Ki)，式中[1-NPN]为未结合的荧光探针1-NPN浓度。
结果如下：
(1)PtsuOBP7与1-NPN的结合特性
由图4可知，PtsuOBP7气味结合蛋白与荧光探针1-NPN之间存在显著的线性化关系且回归方程的R2＝0.92，结果表明，PtsuOBP7与1-NPN的荧光值随1-NPN浓度的增加均存在饱和效应，同时表明PtsuOBP7具有单一的结合位点，可用于荧光竞争性结合力测定。此外，PtsuOBP7与1-NPN的结合常数K1-NPN＝7.09±1.16。
(2)PtsuOBP7与气味配体的结合特性
如图5与下表所示：在9种寄主香樟的挥发性信息化合物中，(1)PtsuOBP7对樟脑(Ki＝9.85μM)与β石竹烯(Ki＝8.41μM)的结合力强(植物挥发物的结合力判断标准：Ki＜10μM表示结合力强；10μM＜Ki＜20μM表示结合力弱；Ki＞20μM表示不结合，下同)；(2)OBP7对芳樟醇(Ki＝10.18)、α水芹烯(Ki＝12.20μM)与右旋龙脑(Ki＝18.07μM)的结合力弱；(3)PtsuOBP7对罗勒烯、桉叶油素、3-蒈烯与反式-橙花叔醇等4种挥发性信息化合物不结合。PtsuOBP7与香樟挥发物的结合亲和力如下表所示：
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种香樟齿喙象成虫气味结合蛋白PtsuOBP7及其编码基因与应用
<130> 100
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 142
<212> PRT
<213> Pagiophloeus tsushimanus
<400> 1
Met Tyr Gln Val Tyr Lys Phe Thr Val Ile Val Leu Cys Ala Ser Ile
1 5 10 15
Ile Ser Ala Lys Leu Asp Glu Ser Leu Leu Thr Glu Asp Leu Lys Ser
20 25 30
Leu Met Ala Thr Leu His Lys Thr Cys Val Asp Gln Ile Gly Ile Asp
35 40 45
Glu Ala Arg Ile Asp Lys Leu Lys Glu Ala Val Phe Glu Asp Asp Ala
50 55 60
Lys Ser Lys Cys Tyr Val Lys Cys Val Met Pro Glu Ser Gly Val Met
65 70 75 80
Asp Glu Asn Gly Asp Val Asp Met Gly Ala Phe Ala Glu Val Ile Pro
85 90 95
Glu Lys Leu Arg Glu Lys Thr Lys Glu Ala Phe Val Gly Cys Val Ser
100 105 110
Arg Glu Gly Gly Lys Ser Asp Leu Cys Glu Lys Ala Phe Ser Ile Leu
115 120 125
His Cys Thr His Glu Ser Asn Pro Glu Asn Tyr Phe Phe Val
130 135 140
<210> 2
<211> 429
<212> DNA
<213> Pagiophloeus tsushimanus
<400> 2
atgtatcaag tgtataagtt tactgtcatt gtgctctgcg cttcgatcat ttcggctaaa 60
ttggacgaat cacttttaac agaagatttg aagagtttaa tggccaccct tcacaagacg 120
tgtgtagatc aaattggaat tgatgaagct cgaatagaca aattgaaaga ggcagtgttt 180
gaggacgatg caaaatcaaa gtgttacgtc aagtgtgtaa tgccagaaag tggcgtgatg 240
gatgaaaatg gtgatgttga tatgggggcc tttgctgaag ttattccaga aaaacttaga 300
gaaaaaacca aagaagcatt tgtaggatgt gtaagtcgcg aaggtggcaa atctgatctt 360
tgcgaaaaag cttttagtat tcttcattgt actcatgagt caaatccaga gaattatttc 420
tttgtttaa 429