一种能同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用
阅读说明：本技术 一种能同时降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用 (Aflatoxin B capable of being degraded simultaneously1Construction method and application of mutant of zearalenone fusion enzyme ) 是由 夏雨 吴梓凤 秋杨煜 何瑞 程倩倩 王周平 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种能同时降解黄曲霉毒素B-(1)和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用,属于生物技术和基因工程技术领域。本发明通过将玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1和锰过氧化物酶PhcMnp两种酶进行融合,得到的融合酶能够同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B-(1),并对该融合酶进行突变,通过食品级酵母菌乳酸克鲁维酵母发酵生产融合酶突变体,得到的融合酶突变体,不仅对于玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B-(1)的降解效率较出发酶均得到了显著提升,且表达的产物具有食品级安全性,适用于食品、饲料等领域,对于食品安全具有重要意义。(The invention discloses a method capable of simultaneously degrading aflatoxin B 1 And zearalenone fusion enzyme mutant construction method and application thereof, belonging to the technical field of biotechnology and genetic engineering. The zearalenone hydrolase ZHD 101.1.1 and the manganese peroxidase PhcMnp are fused, so that the obtained fusion enzyme can degrade zearalenone and aflatoxin B simultaneously 1 Mutating the fusion enzyme, and fermenting with food grade yeast Kluyveromyces lactis to produce fusion enzymeVariants, resulting fusion enzyme mutants, not only for zearalenone and aflatoxin B 1 The degradation efficiency is obviously improved compared with the original enzyme, and the expressed product has food-grade safety, is suitable for the fields of food, feed and the like, and has important significance on food safety.)
技术领域
本发明涉及一种能同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用，属于生物技术和基因工程技术领域。
背景技术
黄曲霉毒素B1(Aflatoxins B1，AFB1)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是玉米、花生等谷物中常见的两种真菌毒素，会引发肝癌、生长迟缓、生殖系统损坏等多种疾病，对人和家畜的健康产生巨大威胁。黄曲霉毒素B1是由一些黄曲霉和寄生曲霉等产生的有毒次级代谢产物；玉米赤霉烯酮主要是由多种镰刀菌属真菌产生的非甾体雌激素真菌毒素。两种毒素都具有较强的毒性、致癌性和致畸性，污染多种经济作物并引起食品和饲料等安全问题。由于粮食及饲料中存在多种真菌毒素的污染，单一特异性的毒素降解酶已经无法满足实际的需求，亟须一种能够同时降解多种真菌毒素的多功能酶。
目前的脱毒方法主要有物理、化学、生物法。物理法包括辐射法、热处理法和吸附法等。辐射法本身存在放射性污染问题，辐照后的粮食产物也存在一定安全问题。热处理法时的高温会破坏粮食的品质和风味，且脱毒效果也不彻底。吸附法存在吸附剂添加量多、吸附毒素种类有限等问题。化学法利用碱处理和氧化处理法破坏分子结构而实现脱毒目的，但该法也会破坏了粮食的营养成分，同时引入了新的化学试剂，降解产物的安全性未知。
生物降解法是利用微生物或其产生的酶及其制剂通过生物催化的方法脱毒，脱毒条件温和且高效。目前大量研究主要集中在一种微生物及其代谢产物降解一种毒素的单一化脱毒研究，脱毒方法普适性差、脱毒对象针对性强、脱毒效果整体性差。也有利用多种益生菌搭配组合的方式能实现两种毒素的同时降解，但这种方法效率低下、实验复杂、适用范围窄，不适合应用于自然产毒的食品及谷物中。用连接肽连接多个不同功能蛋白，实现酶的多功能化研究的生物技术已经在某些研究领域有了较为深入的研究，但目前还未广泛应用于真菌毒素的降解研究。
发明内容
为解决目前存在的问题，本发明利用一个单位的柔性连接肽GGGGS连接了来源于Clonostachys rosea的降解真菌毒素的融合酶ZHD101.1和来源于Phanerochaetechrysosporium的锰过氧化物酶PhcMnp，并以食品级酵母乳酸克鲁维酵母为宿主菌实现了融合酶的表达。为提高融合酶的对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率，本发明通过分析融合酶结构上的突变热点，应用分子生物学技术构建定点突变，并筛选出降解率提高的突变体进一步推进降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的融合酶的优良改造，为工业化生产奠定基础。
本发明提供了降解率提高的降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合酶为亲本，
在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，将其命名为S103A。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第172位缬氨酸突变为精氨酸，将其命名为V172R。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第188位脯氨酸突变为天冬氨酸，将其命名为P188D。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第374位天冬酰胺突变为甘氨酸，将其命名为N374G。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第381位天冬酰胺突变为天冬氨酸，将其命名为N381D。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第473位赖氨酸突变为缬氨酸，将其命名为K473V。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第512位苏氨酸突变为谷氨酰胺，将其命名为T512Q。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第381位天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将其命名为S103A/N381D。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第172位缬氨酸突变为精氨酸，并将第381位天冬酰胺突变为天冬氨酸，将其命名为V172R/N381D。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第188位脯氨酸突变为天冬氨酸，并将第381位天冬酰胺突变为天冬氨酸，将其命名为P188D/N381D。
在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将其第103位丝氨酸突变为丙氨酸，将第172位缬氨酸突变为精氨酸，将第188位脯氨酸突变为天冬氨酸，将第374位天冬酰胺突变为甘氨酸，将第381位天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第512位苏氨酸突变为谷氨酰胺，将其命名为S103A/V172R/P188D/N374G/N381D/T512Q。
本发明提供了构建所述融合酶突变体的方法，步骤包括：
1)将玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1和锰过氧化物酶PhcMnp通过一个单位的柔性连接肽GGGGS连接，构建得到融合酶，将编码融合酶的核苷酸序列连接至pKLAC1的多克隆酶切位点处，构建得到重组质粒；
2)利用专业软件计算玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1和锰过氧化物酶PhcMnp的关键氨基酸残基位置，作为潜在突变热点/位点，选择一个或多个位点进行突变设计；
3)对融合酶的核苷酸序列进行分析，设计拟突变位点的PCR用引物(正向引物F、逆向引物R)，并确保突变位点采用的密码子是针对乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化的；
4)利用所述F和R引物，采用一定的PCR反应体系和一系列温度控制，通过PCR扩增含有融合酶的重组质粒序列全长；
5)上述PCR扩增产物经过DpnI酶消化处理后，转化到大肠杆菌宿主菌DH5α中进行扩增、抽提质粒，通过酶切、测序验证等方法获得发生预期突变的突变体质粒；
6)将上述突变体质粒转化到乳酸克鲁维酵母宿主菌GG799中，得到重组酵母转化子，通过抽提重组酵母转化子全基因组序列、测序验证等方法，获得整合有突变体基因的重组酵母菌株；
7)对上述整合有突变体基因的重组酵母菌株使用YEPD培养基培养，使用YEPG培养基诱导目标酶蛋白的分泌表达，从分泌表达上清液中分离、浓缩水解酶突变体；
8)通过检测和计算分泌表达上清液中水解酶突变体对玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的降解率，筛选降解率提高的突变体。
在一种实施方式中，将所述重组酵母菌株在培养基中培养至OD600达到1.0时，转接至YEPG诱导培养基中，于28～30℃、150～300rpm诱导72～120h产酶。
在一种实施方式中，在含有MnSO4和hemin的YEPG培养基诱导目的蛋白的表达。
本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、基因重组或人工合成中的一种或几种方法获得。之后再将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明提供了编码所述融合酶突变体的基因。
本发明提供了携带所述基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体以pKLAC1为出发载体。
本发明提供了一种同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的方法，将所述融合酶突变体加入含有黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的体系中，实现同时对这两种真菌毒素的降解。
在一种实施方式中，所述融合酶突变体是将表达所述融合酶突变体的重组酵母菌株在培养基中培养至OD600达到1.0时，转接至YEPG诱导培养基中，于28～30℃、150～300rpm诱导72～120h产酶，收集发酵上清液；所述YEPG培养基中含有MnSO4和hemin。
在一种实施方式中，在pH 4.0～5.0下，于30～50℃下反应7～9h，体系中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的浓度分别为5.0μg/mL，MnSO4浓度为0.1～1.0mmol/L，H2O2浓度为0.1～5.0mmol/L，所述发酵上清液中蛋白质浓度为0.1～0.5mg/mL。
本发明提供所述融合酶突变体、所述编码融合酶突变体的基因，所述微生物细胞对融合酶的表达产物在降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的融合酶突变体，是在下列实施例中限定的实验条件下进行的，是在未经过任何工艺优化前提下，本发明中突变体相对于未突变的融合酶，具有相似或较高的催化活性，本发明重组表达的融合酶突变体相比未突变酶对于玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的降解率显著提高。
2.本发明通过分析，有针对性的对含有玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101.1和锰过氧化物酶PhcMnp两种结构域的融合酶的氨基酸残基或结构进行改造，通过基因工程方法来获得突变体，所得突变体对玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1同时具有较高的降解效率，这一特性更加适应工业化生产。
3.本发明与其他已报道的结果相比，是在食品级酵母菌乳酸克鲁维酵母中实现酶的表达，表达产物具有食品级安全性，适合在食品和饲料等行业中应用。
附图说明
图1为表达融合酶单点突变体的重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液对玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1降解率对比图。
图2为表达融合酶多位点组合突变体的重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液对玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1降解率对比图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
本发明生物材料的来源的一般性说明：
1、引物合成：本发明中所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2、实验中所使用的所有限制性内切酶购于Thermo Fisher Scientific公司。PCR产物纯化试剂盒、胶回收产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、真菌基因组提取试剂盒、DNA限制性内切酶、Phusion酶、T4 DNA连接试剂盒、Protein Ladder、DNA Marker、超滤浓缩管、BCA蛋白定量试剂盒等购于Thermo Fisher Scientific公司。序列测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
3、下述实施例中可能涉及的培养基成分如下：
LB液体培养基(g/L)：酵母粉5、胰蛋白胨10、NaCl 10；
YEPD液体培养基(g/L)：酵母粉10、蛋白胨20、葡萄糖20；
YEPG诱导培养基(g/L)：酵母粉10、蛋白胨20、半乳糖40，该培养基中的添加物为：0.5mmol/L MnSO4和0.2mmol/L hemin。
YCB平板培养基(g/L)：YNB 3.4、葡萄糖10、琼脂粉15，5.0mmol/L乙酰胺。
4、融合酶对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮的降解率均采用如下公式计算：
其中：上述公式中的底物是指黄曲霉毒素B1，或玉米赤霉烯酮。
5、UPLC-MS检测条件如下：
(1)色谱条件：柱：C18；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；流动相：H2O(A相)和乙腈(B相)；梯度洗脱程序如表1和表2所示。
表1黄曲霉毒素B1液相色谱梯度洗脱程序表
表2玉米赤霉烯酮液相色谱梯度洗脱程序表
(2)质谱条件：离子源：电喷雾离子源；质谱扫描方式：多重反应监测模式(MRM)；锥孔电压：3.0kV；加热气温度：500℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气：800L/h；质谱参数如表3所示。
表3黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的质谱参数表
实施例1融合酶突变体突变位点的选择和突变方法
所述融合酶的未突变序列如SEQ ID NO.1所示。该酶是通过一个单位的柔性连接肽GGGGS将来源于Clonostachys rosea的降解玉米赤霉烯酮的酶ZHD101.1和来源于Phanerochaete chrysosporium的锰过氧化物酶PhcMnp酶进行连接，得到的融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过分析确定突变热点，选取了如下位点并进行相应突变：Q45V、S103A、H125R、H125E、H134D、H134A、V172R、V172T、P188D、P188H、G205Q、W210D、W210E、T211A、H248D、H248E、D250H、R301A、E328A、I334L、H339D、N374G、N374A、N374L、S379I、S379A、N381D、L407V、K443S、R447E、F448M、S461A、H466D、H466P、H466Y、V468I、R470A、K473V、K473E、V474I、T512Q、T512P、L569M。
具体步骤为：构建重组质粒pKLAC1-zpf1：将编码融合蛋白的如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列连接至pKLAC1载体的多克隆酶切位点，得到重组质粒，转入大肠杆菌中，测序、验证得到正确的重组质粒命名为pKLAC1-zpf1；设计上下游引物，采用PCR扩增法，采用如下所述的一定的PCR反应体系和一系列温度控制，以重组质粒pKLAC1-zpf1为模板进行PCR反应，例如，以重组质粒pKLAC1-zpf1为模板，以Pri-Q45V-F和Pri-Q45V-R为引物引入Q45V突变。PCR扩增产物用限制性内切酶DpnI进行酶切、回收后，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养。在抗性平板上挑取阳性克隆，用BglII、SalI双酶切验证，并将验证正确的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序后发生上述突变的质粒和含质粒的大肠杆菌菌种进行保存。组合突变的步骤是在单点突变序列的基础上，依次用对应于其它突变位点的引物，对已获得的突变体继续进行PCR反应，从而引入更多突变位点，直至获得目标组合突变体。
本实施例中所述的PCR突变反应体系及程序如表4所示，DpnI酶消化反应体系如表5所示，具体突变引物如表6所示：
表4PCR突变反应体系及程序表
表5DpnI酶消化反应体系表
表6融合酶突变所需引物序列
实施例2融合酶突变体重组酵母菌构建及鉴定
用限制性内切酶SacII对实施例1中构建得到的重组质粒进行线性化，将酶切产物纯化回收；用电脉冲法将线性化的质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞中；电击后的酵母细胞立即加入1.0mL预冷的山梨醇溶液，30℃孵育1～3h，离心收集酵母菌体，留100μL重悬菌体，均匀涂布在含有乙酰胺的YCB平板上，于30℃培养3～5d至长出单克隆。挑取多个生长良好的单一菌落，分别接种于10.0mL YEPD液体试管中，于30℃、200rpm过夜培养。离心收集菌体，并利用真菌基因组抽提试剂盒抽提重组菌基因组。以抽提的基因组DNA作为模板，进行PCR验证。将验证成功的PCR产物及对应的重组酵母菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序验证正确、携带突变体基因的重组酵母菌保存于-80℃超低温冰箱。
实施例3融合酶突变体的分泌表达方法及突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解方法
取出实施例2保存的测序验证正确、携带突变体基因的重组酵母菌甘油管进行活化。挑取单菌落于10.0mL YEPD培养基中，在30℃下200rpm，培养18～22h；当OD600达到1.0时，以1％(1mL/100mL)的接种量转接至含有0.5mmol/L MnSO4和0.2mmol/L hemin的YEPG诱导培养基中，于30℃、200rpm诱导72h产酶(分泌表达)。发酵结束后8000rpm离心，收集发酵上清液，并用截留分子量为10kDa的超滤离心管浓缩。用蛋白质定量试剂盒对浓缩后的发酵上清液进行蛋白质定量。
利用含突变体蛋白的重组乳酸克鲁维酵母分泌表达上清液(或浓缩的上清液)降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，参考论文《同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的重组酵母菌构建及其应用研究》中所述黄曲霉毒素B1降解方法和玉米赤霉烯酮降解方法，采用改进的方法进行降解反应，具体反应体系和反应过程如下：
1.0mL总反应体系，反应缓冲液为70.0mmol/L丙二酸缓冲液(pH 4.5)，MnSO4浓度为0.2mmol/L，H2O2浓度为1.0mmol/L，反应体系中加入的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的浓度分别为5.0μg/mL，反应体系中加入含融合酶未突变体或突变体的上述分泌表达上清液(或浓缩的上清液)，使得反应体系中含蛋白质的终浓度为0.1mg/mL，于40℃下反应8h。反应结束后，加入3.0mL甲醇以终止反应。反应液用0.22μm滤膜过滤后，通过UPLC-MS分析剩余黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的含量。
实施例4融合酶的单点突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解应用
将获得的融合酶单点突变体按照实施例3中所述方法进行黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解，经UPLC-MS检测，单点突变的融合酶突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率结果如表7所示。
表7融合酶的单点突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率
从表7可以看出，单点突变的融合酶突变体S103A、V172R、P188D、N374G、N381D、K473V、T512Q对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮都具有较高的降解率。
实施例5融合酶的两点组合突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解应用
根据实施例4得到的单点突变的有效位点，在单点突变的基础上，对融合酶进行两点组合突变。组合突变的步骤是在单点突变序列的基础上，依次用对应于其它突变位点的引物，对已获得的突变体继续进行PCR反应，从而引入更多突变位点，直至获得目标组合突变体。PCR反应条件如实施例1中所述。按照实施例3相同方法在乳酸克鲁维酵母中进行了突变体酶的分泌表达。用得到的培养上清液进行黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮降解试验，具体反应过程及参数如实施例3所述。经UPLC-MS检测，两点组合突变的融合酶突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率结果如表8所示。
表8融合酶的两点组合突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率
从表8可以看出，两点组合突变的融合酶突变体组合S103A/N381D，V172R/N381D，P188D/N381D对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮都具有较高的降效果，对黄曲霉毒素B1的降解率均超过了66％，对玉米赤霉烯酮的降解率均超过了89％。
实施例6融合酶的多位点组合突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解应用
根据实施例4、实施例5得到的单位点组合突变结果、两点组合突变结果，在此基础上，对融合酶进行多位点组合突变，按照实施例3相同方法在乳酸克鲁维酵母中进行了突变体酶的分泌表达。用得到的培养上清液进行黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮降解试验，具体反应过程及参数如实施例3所述。经UPLC-MS检测，多位点组合突变的融合酶突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率结果如表9所示。
表9融合酶的多位点组合突变体对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率
从表9可以看出，多位点组合突变的融合酶突变体组合S103A/V172R/P188D/N374G/N381D/T512Q对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮具有最高的降效果，对黄曲霉毒素B1的降解率为88.74％，对玉米赤霉烯酮的降解率为96.34％。比未突变时，分别提高了91.0％、17.42％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种能同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的融合酶的突变体构建方法及其应用
<130> BAA210882A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 651
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr
1 5 10 15
Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly
20 25 30
Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala
35 40 45
Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser
50 55 60
Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Val Ile Ser Val Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala
85 90 95
Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu
100 105 110
Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro
115 120 125
Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu
130 135 140
Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn His Met Leu Asn Asp Phe Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu
165 170 175
His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro
180 185 190
Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu
195 200 205
Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn
210 215 220
Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly
225 230 235 240
Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val
245 250 255
Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Phe
260 265 270
Gly Ser Leu Leu Ala Phe Val Ala Leu Ala Ala Ile Thr Arg Ala Ala
275 280 285
Pro Thr Ala Glu Ser Ala Val Cys Pro Asp Gly Thr Arg Val Thr Asn
290 295 300
Ala Ala Cys Cys Ala Phe Ile Pro Leu Ala Gln Asp Leu Gln Glu Thr
305 310 315 320
Leu Phe Gln Gly Asp Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Val Ile Arg Leu
325 330 335
Thr Phe His Asp Ala Ile Ala Ile Ser Gln Ser Leu Gly Pro Gln Ala
340 345 350
Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Met Leu His Phe Pro Thr Ile Glu Pro
355 360 365
Asn Phe Ser Ala Asn Asn Gly Ile Asp Asp Ser Val Asn Asn Leu Leu
370 375 380
Pro Phe Met Gln Lys His Asp Thr Ile Ser Ala Ala Asp Leu Val Gln
385 390 395 400
Phe Ala Gly Ala Val Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Arg Leu
405 410 415
Glu Phe Met Ala Gly Arg Pro Asn Thr Thr Ile Pro Ala Val Glu Gly
420 425 430
Leu Ile Pro Glu Pro Gln Asp Ser Val Thr Lys Ile Leu Gln Arg Phe
435 440 445
Glu Asp Ala Gly Asn Phe Ser Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Leu Ala
450 455 460
Ser His Thr Val Ala Arg Ala Asp Lys Val Asp Glu Thr Ile Asp Ala
465 470 475 480
Ala Pro Phe Asp Ser Thr Pro Phe Thr Phe Asp Thr Gln Val Phe Leu
485 490 495
Glu Val Leu Leu Lys Gly Thr Gly Phe Pro Gly Ser Asn Asn Asn Thr
500 505 510
Gly Glu Val Met Ser Pro Leu Pro Leu Gly Ser Gly Ser Asp Thr Gly
515 520 525
Glu Met Arg Leu Gln Ser Asp Phe Ala Leu Ala Arg Asp Glu Arg Thr
530 535 540
Ala Cys Phe Trp Gln Ser Phe Val Asn Glu Gln Glu Phe Met Ala Ala
545 550 555 560
Ser Phe Lys Ala Ala Met Ala Lys Leu Ala Ile Leu Gly His Ser Arg
565 570 575
Ser Ser Leu Ile Asp Cys Ser Asp Val Val Pro Val Pro Lys Pro Ala
580 585 590
Val Asn Lys Pro Ala Thr Phe Pro Ala Thr Lys Gly Pro Lys Asp Leu
595 600 605
Asp Thr Leu Thr Cys Lys Ala Leu Lys Phe Pro Thr Leu Thr Ser Asp
610 615 620
Pro Gly Ala Thr Glu Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asn Gly Gly Met
625 630 635 640
Ser Cys Pro Gly Val Gln Phe Asp Gly Pro Ala
645 650
<210> 2
<211> 1953
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagaacta gatcaactat ttcaactcct aatggtatta cttggtatta tgaacaagaa 60
ggtactggtc ctgatgttgt tttagttcct gatggtttag gtgaatgtca aatgttcgat 120
tcatcagttt ctcaaattgc tgctcaaggt ttcagagtta ctactttcga tatgccaggt 180
atgagcaggt cagctaaagc tccaccagaa acttatactg aagttactgc tcaaaaatta 240
gcttcttatg ttatttctgt tttggatgct ttggatatta aacatgctac tgtttggggt 300
tgttcatcag gtgcttcaac tgttgttgct ttattattgg gttatcctga tagaattaga 360
aatgctatgt gtcatgaatt accaactaaa ttattggatc atttgtcaaa tactgctgtt 420
ttggaagatg aagaaatttc taaaattttg gctaatcaca tgttgaatga tttttcaggt 480
ggttcagaag catggcaagc tatgggtgat gaagttcatg ctagattaca taaaaattat 540
ccagtttggg ctagaggtta tcctagaact attccaccat ctgctccagt taaagatttg 600
gaggcgttga gaggtaaacc attggattgg actgttggtg ctgctactcc aactgaatca 660
ttcttcgata atattgttac tgctactaaa gctggtgtta atattggttt attgccaggt 720
atgcatttcc cttatgtttc acatcctgat gttttcgcta aatatgttgt tgaaactact 780
caaaaacatt tgggtggtgg tggttctatg gctttcggtt ctttattggc tttcgttgct 840
ttagctgcta ttactagagc tgctccaact gctgaatcag ctgtttgtcc tgatggtact 900
agagttacta atgctgcttg ttgtgctttc attcctttag ctcaagattt gcaagaaact 960
ttattccaag gtgattgtgg tgaagatgct catgaagtta ttagattgac tttccatgat 1020
gctattgcta tttcacaatc tttgggtcca caagctggtg gtggtgctga tggttctatg 1080
ttgcatttcc caactattga acctaatttc tcagctaata atggtattga tgattcagtt 1140
aataatttat tgccattcat gcaaaaacat gatactattt cagctgctga tttagttcaa 1200
ttcgctggtg ctgttgcttt atctaattgt cctggtgctc ctagattgga atttatggct 1260
ggtagaccaa atactactat tccagctgtt gaaggtttaa ttccagaacc acaagattca 1320
gttactaaaa ttttacaaag attcgaagat gctggtaatt tctcaccatt cgaagttgtt 1380
tctttattag cttcacatac tgttgctaga gctgataaag ttgatgaaac tattgatgct 1440
gctccattcg attctactcc tttcactttc gatactcaag ttttcttaga agttttatta 1500
aaaggtactg gtttcccagg ttctaataat aatactggtg aagttatgtc acctttgcca 1560
ttaggttcag gttctgatac tggtgaaatg agattacaat cagatttcgc tttggctaga 1620
gatgaaagaa ctgcttgttt ctggcaatca ttcgttaatg aacaagaatt tatggctgct 1680
tcattcaaag ctgctatggc taaattagct attttgggtc attctcgctc atctttaatt 1740
gattgttctg atgttgttcc agttcctaaa ccagctgtta ataaaccagc tactttccca 1800
gctactaaag gtccaaaaga tttggatact ttgacttgta aggctttaaa attcccaact 1860
ttgacttctg atccaggtgc tactgaaact ttaattccac attgttctaa tggtggtatg 1920
tcttgtccag gtgttcaatt cgatggtcca gct 1953
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