阅读说明：本技术 一种在非变性情况下脱去生物体组织中细胞的方法 (Method for removing cells from organism tissue under non-denaturing condition ) 是由 宋云庆 姜来 于 2019-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种在非变性情况下脱去生物体组织中细胞的方法,将获取的生物体组织材料置于缓冲液内,加入核酸内切酶,25.0℃～40.0℃进行反应,反应过程缓慢加入盐溶液,并维持pH值在5～7之间。本发明所述的方法可以去除同种异体组织或异种异体组织中细胞及组织相容性抗原,且该方法在去除组织中细胞及组织相容性抗原的同时,最大程度的保留组织中对细胞及组织生长有益的生长因子。(The invention discloses a method for removing cells in organism tissues under a non-denaturing condition, which comprises the steps of placing an obtained organism tissue material into a buffer solution, adding endonuclease, reacting at 25.0-40.0 ℃, slowly adding a salt solution in the reaction process, and maintaining the pH value between 5 and 7. The method can remove the cell and tissue compatible antigens in the allogeneic tissues or the xenogeneic tissues, and can furthest retain growth factors which are beneficial to the growth of the cells and the tissues in the tissues while removing the cell and tissue compatible antigens in the tissues.)

一种在非变性情况下脱去生物体组织中细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种在非变性情况下脱去生物体组织中细胞的方法。

背景技术

Non-Denature脱细胞技术是基于目前在临床使用过程中，常见的多种同种异体产品和异种异体产品传统制备工艺上研发衍生而出的。随着现代生物医学技术的发展。我们发现在人体和动物体组织上除大量的细胞和免疫原性物质外，还含有大量的利于患处修复、生长、诱导、抗感染等的因子或蛋白质。如：人皮质生长因子(HEGP)、骨诱导生长因子(BMP)、血管内皮质生长因子(VEGF)等。这些物质可诱导或引导患处的细胞，针对损伤部分的修复治疗。同时还有很多这类因子和蛋白，可以控制组织修复后的效果，最终可达到与受损前几乎相同的状态。这一点对于很多损伤的修复极为重要。如：烧伤后植皮术、整形美容等。

对于同种异体组织和异种异体组织，如果需要应用在患者身体上，首要面对的就是如何除去组织上携带的免疫原性的问题。在传统的同种异体、异种异体组织产品制备过程中，均难免会使用到如：醇类、醚类、酮类、强氧化物、强酸、强碱等化学试剂；或是在物理上进行高温、高压、强辐射等工艺。这些方式虽然可以有效的去除组织中的免疫原性物质。但同时，对于那些有利于患处修复的各种因子和蛋白也几乎完全被破坏。而产品在使用后也只能起到单纯的生物支架作用，受体细胞根本无法段时间内在这样的生物支架上负载存活。其最终与许多人工合成材质的生物支架功能相差无几。这大大降低了作为生物组织材料的价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在非变性情况下脱去生物体组织中细胞的方法，本发明所述的方法可以去除同种异体组织或异种异体组织中细胞及组织相容性抗原，且该方法在去除组织中细胞及组织相容性抗原的同时，最大程度的保留组织中对细胞及组织生长有益的生长因子。

使用本发明所述方法制备处理完成的组织，在使用时只是具有生物组织材料的生物结构、细胞间质和部分生长因子的功能，而不保留细胞活性，也不获取细胞功能性的功能产品，定义为组织工程医疗器械(TEMP)，即：不同于移植后的器官。

为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：

一种脱去生物体组织中细胞的方法，将获取的生物体组织材料置于缓冲液内，加入核酸内切酶，25.0℃～40.0℃进行反应，反应过程缓慢加入盐溶液，并维持pH值在5～7之间。

本发明所述方法，通过在特定温度下特定的pH值，持续改变组织中细胞的通透性，使得反应可充分进行。

本发明中关于生物体组织材料的选择，为本领域常用的同种异体组织或异种异体组织，在本发明中，优选的具有如下要求：

(1)不包括分散的和/或可溶于水、油质、醇类的液体组织，如：血液、淋巴液、脑髓液等；

(2)不包括基本无细胞活性且质密的组织，如：上皮层中的角质层、毛发组织、指甲、牙冠、骨骼中的较致密的皮质骨等；

(3)不包括结构复杂，体积较大的、复杂的机体组织或人体复合性组织，如含血管，神经，肌肉，皮肤的肢体。可列举的实例包括但不限于含骨，软骨，半月板，肌腱的关节等。

本发明中关于生物体组织材料的选择，可以为上述不包括的之外的其他同种异体组织或异种异体组织，包括但不限于皮肤，骨，软骨，肌腱，神经组织，血管，心藏瓣膜，心包膜，羊膜，脐带组织等。

本发明生物体组织材料的获取，对于同种异体组织材料，可以遵循供者死亡后立即取材的原则，或者参考YY/T0513.1-2009《同种异体骨修复材料第1部分：骨组织库基本要求》中的方法。对于异种异体组织材料可以做到供体死亡后立即取材。所有的取材工作优选在受控的洁净环境下进行操作，减少材料获取时，材料表面受到微生物和热源等的附着。同时，在取材料时应严格避免碰触或破坏内脏(如：胃部、肠道等)，避免对材料造成严重的污染。

如果取材后可立即进行制备为最佳；若无法直接进行制备，可以采用冷冻保存的方法。通常情况下，若直接采用低温冷冻或深低温冷冻，可能会对材料造成一定程度的损伤，影响最终组织材料的使用效果。优选使用无冰玻璃化冻存技术，可对组织材料进行长期保存，且基本不会对组织材料造成损伤。

取材后的组织不易长时间暴露于空气中，避免出现组织材料脱水和氧化的情况，以免对组织材料中携带的生物活性因子等造成不可逆是损伤。优选的，选用物理隔绝法进行隔绝，如使用：聚乙烯薄膜、石蜡、锡纸或真空袋等中的一种或几种进行隔绝；或使用保护液进行隔绝，如使用：甘油、生理盐水、棉籽油、吐温80、一甲基硅油、二甲基亚砜或D-甘露醇溶液等中的一种或几种。

本发明获取的生物体组织材料，可以按最终产品的需要，将组织材料剪裁或切割成要求的形状，在制定最终产品尺寸时也优选遵循小型化的原则，进行可能的限制其厚度和层数，尽可能降低材料本身的厚度，例如优选的厚度在0.01～6mm之间，可保证良好的通透性时，操作时也不易在制备过程中出现折叠卷曲等情况。更优选的进一步去除角质化、质密的和基本无活性的部分。

本发明获取的生物体组织材料，优选的，在洁净环境内，先使用纯化水或纯化水以上用水对组织材料表面进行初步清洗。其目的主要是为将组织材料表面残留的血液、组织液或保护液等清洗干净，同时控制环境中的污染源对组织材料的污染。清洗时间不宜过长，也不应使材料受到压力、伸张力而发生形变。取出后无水滴落即可，不可使用烘吹的方式加速干燥。

进一步优选的，初步清洗后的生物体组织材料，选用清洁剂进行进一步清洗，清洁剂选自聚氧乙烯醇、聚山梨酯、月桂酰肌酸盐、二甲基亚砜、月桂酸钾、甲基对苯而酚或苏拉明钠中的一种或几种；清洁剂质量浓度优选在0.01％～45％之间，pH值在5.0～8.0之间；清洗时间可以根据材料本身的特性据常规来确定。优选使用超声波清洗机均匀的清洗组织材料。清洗结束后，可选用适当的缓冲液来退去清洗液。缓冲液清洗2～3次后，可以将组织材料浸没在缓冲液中。

本发明所述的缓冲液可根据组织材料根据特性进行常规确定，例如可选择：氯化钠、氯化钙、氯化锂、氯化镁、氯化钾中的一种或几种组合。总质量浓度优选为0.01％～2.5％之间，优选的pH为4～6。

进一步的，本发明所述的核酸内切酶可以选用常规的一种或几种的广谱的核酸内切酶，例如脱氧核糖核酸酶(DNasel)、核糖核酸酶(RNase)，对组织中细胞内的核酸和部分蛋白进行分解，浓度优选为0.5～20U/μL，更优选0.5～6U/μL。浓度过高会造成不必要的浪费，浓度过低则达不到效应的效果。

本发明反应的温度为25.0℃～40.0℃，优选为35.0℃～38.0℃，在同一反应过程中，温差变化优选小于或等于±0.1℃；具体温度可根据不同核酸内切酶的激活需要进行常规选择。

本发明反应过程需严格维持pH值在5～7之间，在此范围内，有利于增加细胞膜的透性，而pH值大于7时，会直接破坏细胞膜和细胞基质。

本发明所述的盐溶液可选用：氯化钠、氯化钙、氯化锂、氯化镁、氯化钾中的一种或几种组合，没有特定的浓度要求，可以为上述盐的饱和溶液。

本发明通过缓慢加入盐溶液，逐渐改变生物体组织材料的细胞通透性，利于生物体组织中细胞的脱去。

本发明所述的盐溶液的加入，可以通过常规方法加入，例通过滴定的形式加入，滴定后溶液中盐的总质量浓度应保持在0.5％～7％之间。

本发明在滴定的同时可以使用搅拌器或摇床使缓冲液浓度变化均匀。

本发明所述的方法，反应结束后可以使用缓冲液对组织材料进行清洗2～3次。

制备后获得的组织材料，可以在无菌条件下，使用Non-Denature液体灭菌法或其他适当的方式对组织材料进行灭菌处理后，再选用一种或几种保护液，如：甘油、二甲基亚砜、聚山梨酯、聚氧乙烯醇、乙酰胺等对组织材料进行保护；使用密封的方式对组织材料进行密封保存，还可使用无冰玻璃化冻存技术或其他适当的方式长期保存。

本发明所述方法现对于现有技术的优势：

本发明所述方法完全不同于传统的生物组织产品制备工艺，是采用盐溶液和核酸内切酶，在特定环境下，对生物组织进行处理。使用该技术处理生物组织，可使得组织在脱去不需要的细胞、除去免疫原性，同时最大程度的保留了生物组织中对于患处生长愈合有利的细胞、活性成分等。通过大量实验表明，使用该技术处理的组织，除可以完好的诱导或引导受体细胞快速对损伤处修复外，更是一种优良的干细胞负载体，使受体干细胞快速在组织中着床成活、分化并参与组织修复。

附图说明

图1为实施例1制备的同种异体真皮基质显微照片；

图2为对比例1制备的同种异体真皮基质显微照片；

图3为基底层皮片在实施例1制备的真皮基质上附着生长的情况；

图4为基底层皮片在对比例1制备的真皮基质上附着生长的情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例的所述方法所涉及的设备可以包括：精密衡温水域器、滴定仪、超声波清洗机、摇床、真空包装机等。

在异种异体组织材料取材过程中，选择规范的动物饲养机构，该机构应能提供动物的属性及进三代的血统证明，同时还应对有可能含有传播性海绵状脑病(TSE)因子的动物进行调查和排除。可参考YY/T0771.4-2015《动物源医疗器械第4部分：传播性海绵状脑病(TSE)因子的去除和/或灭活及其过程确认分析的原则》。

以下实施例中，关于组织材料滴定和反应时间的确定以及残留细胞的检测可以根据参考YY/T1562-2017《组织工程医疗器械产品生物材料支架细胞活性试验指南》，也可以采用本领域常用的方法，例如同种异体组织材料和异种异体组织材料，应根据实际产品需要制备成规定的规格。应以薄片为主，厚度在0.1～6mm之间较为适宜，也可制备更薄的切片。选取适当的缓冲液和核酸内切酶，并在适当的pH值和温度下重复以上制备过程。根据组织材料的类型和特征，选择抽样时间点：如：0.1h/次、0.5h/次、1h/次或3h/次等(如果组织材料厚度小于0.1mm，建议适当缩短抽样时间点)，进行组织切片。选用适当的染色剂，如：苏木精、洋红、苯胺蓝、亮绿、伊红、碱性品红、亚甲基蓝、甲基蓝、甲基绿等，对组织切片进行染色并观察组织中细胞染色体的水解情况。当无法观察到被染色的染色体，或无法检测到有活性的细胞时。该样品的取样时间点应设定为组织材料的滴定和反应时间(在批量生产过程中，为保证最终产品的安全性和最终合格率，通常会增加滴定和反应时间5％～20％。但具体应根据组织材料的特性来制定)。以上方法也可用于组织材料最终检验的方式。

以下实施例中，最终制备后的同种异体组织材料和异种异体组织材料将会应用于临床，对于组织材料中的免疫原性物质必须严格的进行控制。关于组织材料制备的免疫原性的检测可以根据参考YY/T1465.1-2016《医疗器械免疫原性评价方法第1部分:体外T淋巴细胞转化试验》中的方法来进行检测和判断，也可以采用本领域常用的方法，例如通过体外淋巴细胞刺激试验，可快速进行对组织材料是否残留免疫原性物质进行检测。具体操作可以如：取适量组织材料样品和浸提液，在无菌条件下操作，在37℃的条件下，打碎样品并与浸提液混合，静置12～72h，以3000～6000rpm，3～10min离心并取上清浸提液，-20℃冻存。使用淋巴细胞分离液分离健康成人外周血中的淋巴细胞，并制备成悬浮液，调整浓度至1～3*10⁶/ml。根据MTT细胞增殖试验，使用96孔板分三组：a、刺激组；人淋巴细胞和浸提液各50～100μl；b、阳性对照组：人淋巴细胞和PHA(植物血凝素)各50～100μl；c、阴性对照组：人淋巴细胞和空白缓冲液各50～100μl，取平均值。置于5％二氧化碳培养箱37℃，24～72h，每日观察细胞生长情况，离心，取上清液，加入DMSO(100～150μl/孔)，震荡反应5～10s。在酶标仪上于一定波长处测吸光度(A)，记录各组吸光度A的平均值并进行对比。若组织材料中不含有免疫原性物质，吸光度对比应为：试验组≤阴性对照组＜阳性对照组。

实施例1同种异体真皮基质的制备

步骤1：将获取的厚度为0.2～0.3mm的真皮层材料使用0.05％～0.5％月桂酸钾水溶液清洗材料正反两面，并使用浓度为0.1％～1.0％氯化钠水溶液浸泡材料；

步骤2：配置总浓度为0.1％氯化钙和氯化镁水溶液，并使用稀盐酸将溶液PH值调节至4～6，选用脱氧核糖核酸酶(DNasel)加入溶液至浓度为0.5～5u/μL；

步骤3：将材料转移至配置好的溶液中，使用精密恒温水域器控温，将温度稳定在37±0.1℃；

步骤4：配置氯化钠饱和溶液，使用滴定仪对精密恒温水域器内溶液进行滴定，滴定时间为36h～72h，最终溶液盐浓度为1.5～4.5％；

步骤5：取出材料使用0.9％生理盐水对材料进行清洗，同时选用无水甘油对材料进行保护；

步骤8：使用非变性液体灭菌法对材料进行灭菌，并采用Ice Free玻璃化冻存技术保存材料。

所制备的同种异体真皮基质显微照片如图1所示，可见实施例1制备的同种异体真皮基质，材料表面光滑平整，少见胶原蛋白质凝结物质。

对比例1同种异体真皮基质的制备

步骤1：将获取的厚度为0.2～0.3mm的真皮层材料使用75％乙醇对材料浸泡消毒；

步骤2：使用浓度为0.5～1.5g/ml的氢氧化钠对材料进行浸泡30min，浸泡是温度应保持在20～38％，取出后使用生理盐水材料进行清洗。此步骤重复3次；

步骤3：取出后使用冷冻干燥机对材料进行冷冻干燥处理，并使用PE袋密封保存。

所制备的同种异体真皮基质见图2，显示对比例1制备的同种异体真皮基质材料可见较多因胶原蛋白质凝结产生的小颗粒。

对比结果：

使用人基底层皮片负载试验对两种方法制备的真皮基质(实施例1和对比例1)进行对比：

步骤1：分别取两种方法制备的真皮基质(实施例1和对比例1)，使用无菌生理盐水进行清洗或复水备用；

步骤2：取健康人皮下基底层皮片约1～3g,并粉碎至物理直径为0.1～2.0mm的小颗粒，并使用生物染色剂进行染色；将粉碎后的皮片分两份，均匀的涂抹至两种真皮基质上；

步骤3：使用DMEM培养基，37℃，培养72h,取出后使用无菌生理盐水洗脱浸泡。并观察小皮片生长情况；

观察方法：在均匀涂抹被染色的粉碎皮片后，使用×4倍物镜观察计数，在视野内统计皮片附着数量，随机5个观察点，平均计数76个。培养洗脱后，采用同样的方法观察，由图3和图4的结果可见，基底层皮片在实施例1制备的真皮基质上附着生长良好(图3)，而在对比例1制备的真皮基质上附着生长情况较差，较实施例1有明显差距(图4)。根据试验计数表明，使用实施例1制备的真皮基质平均附着达65处，即使用实施例1制备的真皮基质负载的皮片小颗粒融合分化率达85.5％；对比例1制备的真皮基质平均附着达11处，即使用对比例1制备的真皮基质负载的皮片小颗粒融合分化率仅14.5％。

实施例2同种异体肋软骨的制备

1、将肋软骨切割为厚度1.0-1.5mm的片状，使用0.05～0.5％碳酸氢钠水溶液清洗材料，并使用浓度为0.1％～1.0％氯化钠水溶液浸泡材料；

2、配制总浓度为0.1％氯化钾或氯化钠水溶液，并使用稀盐酸将PH值调节至4～6，选用选用脱氧核糖核酸酶(DNasel)加入溶液至浓度为0.5～5u/μL；

3、将材料转移至配置好的溶液中，使用精密恒温水域器控温，将温度稳定在37±0.1℃；

4、配置氯化钾饱和溶液，使用滴定仪对精密恒温水域器内溶液进行滴定，滴定时间为1.5h～10h，最终溶液盐浓度为2.0～5.0％；

5、取出材料使用0.9％生理盐水对材料进行清洗，同时选用无水甘油对材料进行保护并冷冻保存。

实施例3同种异体肌腱的制备

1、异体肌腱应先去除肌腹和腱膜部分，保留白色圆锁状部分，其已经应控制在0.7cm以下，使用0.1～1.5％月桂醇聚醚硫酸酯钠水溶液清洗，并使用0.1～1.0％氯化钠水溶液浸泡；

2、配制总浓度为0.1％氯化钾或氯化钠水溶液，并使用稀盐酸将PH值调节至4～6，选用选用脱氧核糖核酸酶(DNasel)加入溶液至浓度为0.5～5u/μL；

3、将材料转移至配置好的溶液中，使用精密恒温水域器控温，将温度稳定在37±0.1℃；

4、配置氯化钾饱和溶液，使用滴定仪对精密恒温水域器内溶液进行滴定，滴定时间为1.5h～10h，最终溶液盐浓度为2.0～5.0％；

5、取出材料使用0.9％生理盐水对材料进行清洗，同时选用无水甘油对材料进行保护并冷冻保存。

实施例2和实施例3制备的肋软骨和肌腱临床植入效果较好。